CC BY
8
DOI 10.29254/2077-4214-2018-3-145-251-256 УДК 615.371:579.871.1:534.321.9:616-097
Елисеева I. В., Бабич €. М., Ждамарова Л. А., Блозерський В. I., Колпак С. А.
ПОВЕРХНЕВ1 АНТИГЕНИ ЗБУДНИКА ДИФТЕРИ, ОДЕРЖАН ЗА ДОПОМОГОЮ Ф1ЗИЧНИХ ЧИННИК1В, ЯК Б1ОЛОГ1ЧНА ПЛАТФОРМА ДЛЯ РОЗРОБКИ КОМБ1НОВАНО'' ДИФТЕР1ЙНО'' КАНДИДАТ-ВАКЦИНИ ДУ «1нститут мшробюлогп та iмунологм iм. 1.1. Мечникова НАМН УкраТни» (м. Харкiв)
babych_em@ukr.net
Зв'язок публшацп з плановими науково-до-слщними роботами. Дана робота е фрагментом науково-дослщно'| роботи «Визначити вплив каш-люково-дифтерiйних антигенiв на ^тинно-опосе-редкований iмунiтет та обгрунтувати концептуальн1 положення створення вакцин у форсуючому режима, № державно'| реестраци 0117и002276.
Вступ. Дифтерiйна iнфекцiя у поточний час рее-струеться переважно у кражах, ендемiчних по дифтерп. За даними ВООЗ, у 2017 р. про найбшьшу кть-мсть випадкiв дифтерп повiдомлено з Ыгери (7616), 1нди (5293), 1ндонези (954), Венесуели (786), Непалу (728), Памстану (560) [1]. В уах вказаних кражах вд значаеться тенденцiя до росту захворюваност у по-рiвняннi з 2016 р., особливо в Пашсташ - у 46,7 рази та у Венесуелi - у 25,4 рази. В межах цих краш дифте-рiя залишаеться серйозною проблемою для суспть-ства та системи охорони здоров'я i являе собою, вна-слiдок iнтенсивних мiграцiйних процесiв у сучасному свiтi, потенщальний ризик для краш, епщемюлопч-но благополучних щодо дифтерп [2].
В Укра'|'ш захворюванiсть у останнi роки перебу-вала на спорадичному рiвнi: у 2015 р. зареестровано 2 випадки дифтерп, у 2016 р. - 4, у 2017 р. - 0 [1]. Рiвень охоплення вакцинащею проти дифтерп теля 2010 року суттево зменшився: у 2016 р. одну вак-цинацiю проти дифтерп, правцю i кашлюку (КДП1) одержали 42 % дтей, триразово були щеплеш 19 %; у 2017 р. ц показники дещо покращилися: КДП1 - 65 %, КДП3 - 50 % [3].
Останнш епiдемiчний пiдйом дифтери на терито-ри краш Схщно'| бвропи у 90-х роках минулого сто-рiччя проходив на тлi значних показнишв щепленост1 та високо'| частки вакцинованих серед захворiвших, в тому числк дiтей - 74,7 %, пщлп"мв - 86,6 %, до-рослих - 43,6 %. На кл^чно вираженi та токсичн1 форми дифтерп хворти навiть повноцiнно щепле-нi особи. Були щепленими бiльшiсть захворiвших iз груп ризику (60 %) [4]. За перюд розвитку ешдеми зареестровано 690 летальних випадшв вiд дифтер^но'!' шфекцп, серед яких щепленими були 196 дорослих (28,4 %) i 97 дп-ей (14,0 %). В 1996 р. цей показник серед померлих вщ дифтери дорослих досягнув 35,5 %, причому 12,7 % з них були щеплеш проти дифтери тричi [5].
Дослщники дшшли висновку про вщсутшсть впливу первинного щеплювального комплексу на рiвень захворюваностi на дифтерш у 90-х роках, що непрямим чином свщчить про його недостатню ефектившсть [4]. Результати серологiчного мошто-рингу за станом колективного антитоксичного iму-нiтету пiдтверджували данi епщемюлопчного ана-лiзу. Навiть пiсля вакцинаци та першо'| ревакцинацГ( близько 20 % д^ей, у яких сформувався iмунiтет до
правцю, не мали iмунiтету до дифтерГ| на захисному рiвнi, що може вказувати на недостатшсть iмуноген-ностi дифтерiйного компоненту у АКДП-вакциш [4].
Зазначенi епщемюлопчш особливостi пiдйому захворюваностi, а також кнування ендемiчних по дифтерГ| територш поставили ряд запитань щодо ефективносл вакцинопрофiлактики цiеí небезпечно'( iнфекцií та примушують вчених продовжувати пошу-ки шляхiв Т| удосконалення [5-8].
Як вщомо, сучаснi специфiчнi профiлактичнi вакцины препарати проти дифтерп представлеш диф-терiйним анатоксином у складi рiзних багатоком-понентних вакцин i спрямованi на стимулювання специфiчного антитоксичного iмунiтету, що поперед-жуе розвиток токсичних форм дифтерп, але не поши-рення шфекцп, яке вщбуваеться, особливо у помiж-епiдемiчний перюд, переважно за рахунок латентно'[ циркуляцп збудника через субклiнiчнi форми дифте-рiйноí iнфекцií та бактерiоносiйство. Антитоксичний гуморальний iмунiтет реалiзуеться за умови вклю-чення системи уродженого iмунiтету та активацГ( Th1 ланки клп"инного iмунiтету. Тригером включен-ня уродженого захисту е бактерiальнi антигени, що потрапляють на слизовi оболонки макрооргашзму та взаемодiють iз Toll-подiбними рецепторами ден-дритних клiтин [9].
З точки зору сучасно'| iмунологiчноí парадигми, клп"ини уродженого iмунiтету здатнi утворювати «на-вчений iмунiтет», iмунологiчну пам'ять, подiбну до тiеí, котра притаманна набутому iмунiтету, що збiль-шуе стiйкiсть макроорганiзму до реiнфекцií. Основою навченого iмунiтету е епiгенетичнi змши експресГ( генiв i клiтинноí фiзiологií уроджених iмунних клiтин (моноцитiв/макрофагiв, NK-клiтин) внаслiдок |'х сти-муляцГ| шфекцшними або неiнфекцiйними агентами рiзного походження [10]. ^ унiверсальнi механiзми можна ефективно використовувати для розробки нових профтактичних i терапевтичних стратегiй для захисту вщ множинних iнфекцiйних захворювань [10,11]. Розробка вакцин нового поколшня, котр1 поеднують адаптивну та уроджену iмунну пам'ять, нещодавно було запропоновано i у вiдношеннi вак-цини проти кашлюку [12]. Коринебактерп, неспе-цифiчнi iмуномодулюючi властивостi котрих давно вiдомi [13], вочевидь теж е шдукторами навченого iмунiтету i можуть бути використаш для удосконалення дифтершно'| вакцини за рахунок уведення до и складу поверхневих антигенiв мiкробних клiтин С. diphtheriae.
При кнуючому рiзноманiттi способiв одержання мтробних антигенiв використання фiзичних методiв привертае увагу перспективою налагодження випус-ку нативних, хiмiчно не змiнених, i вiдповiдно, бiльш специфiчних вакцинних препаралв. Одним з таких
Таблиця 1.
Результати вивчення бiохiмiчного складу антигенних препаралв C. diphtheriae
№№ зразк1в Ф1зичниИ фактор Б1ох1м1чниИ склад
Б1лок, мг/мл Гл1це-рин-теИхоева кислота, мкг/мл Риб|тол-теИхоева кислота, мкг\мл
1 УЗО № 1 8,1 72,65 14,42
2 УЗО № 2 12,38 57,48 9,82
3 УЗО: № 1+№ 2+№ 3 20,0 197,48 41,62
4 ЕМВ НЗВЧ (1) 19,52 79,45 20,0
5 ЕМВ НЗВЧ (2) 22,38 131,16 19,37
6 ЕМВ НЗВЧ (1)+(2) 10,24 62,16 19,37
7 Лазер He-Ne № 1 23,81 100,11 23,25
8 Лазер He-Ne № 2 15,71 93,16 17,84
9 Лазер ТГц 16,66 88,22 11,05
10 Лазер He-Ne+лазер ТГц 11,52 67,48 10,07
11 УЗО+лазер He-Ne 13,33 258,66 113,12
12 УЗО+лазер ТГц 16,66 274,11 107,13
13 УЗО+ЕМВ НЗВЧ (1) 1,904 48,72 30,0
14 УЗО+ЕМВ НЗВЧ (2) 17,14 95,12 14,32
15 He-Ne № 1+ЕМВ НЗВЧ (1) 18,57 103,11 33,17
16 He-Ne № 2+ЕМВ НЗВЧ (2) 28,95 270,21 50,18
чиннимв, якии давно використовуеться для дезште-граци м1кроорган1зм1в е ультразвукове опромшення [14]. Використовувався ультразвук i для дезштеграци м1кробноТ маси C. diphtheriae [13].
Суттевим для збереження нативних характеристик поверхневих антиген1в е виб1р параметр1в ультразвукового опромшення, Иого частоти, потужносл, джерела ультразвуку, оск1льки дез1нтеграц1я потуж-ними ультразвуковими хвилями призводить, нав1ть при охолодженн1, до перегр1вання матер1алу i, як на-сл1док, до неконтрольованоТ зм1ни просторовоТ кон-ф1гураци б1лк1в, пошкодження тонкоТ структури поверхневих антиген1в, знижуючи Тх специф1чн1сть [15].
Мета дослщження. Розробка п1дход1в до одер-жання поверхневих антиген1в бактер1альних кл1тин C. diphtheriae як бюлопчноТ платформи для створення комбшованоТ вакцини проти дифтери з бактер1аль-ним компонентом за допомогою ф1зичних фактор1в.
Об'ект i методи дослiдження. Бактер1альн1 анти-гени одержували у так1И посл1довност1: накопичува-ли б1омасу культури музеИного штаму C. diphtheriae, var. gravis, tox+, 1нактивували ТТ, в1дмивали в1д залиш-к1в живильного середовища, дез1нтегрували ф1зич-ними чинниками в р1зних режимах та комб1нац1ях (ультразвук - УЗО, вузькосмугове електромагн1тне випром1нення надзвичаИно високоТ частоти - ЕМВ НЗВЧ, гелш-неоновий (He-Ne) та терагерцовий (ТГц) лазери), центрифугували, поддавали ультрафтьтраци та гель-хроматографи з подальшою концентрац1ею антигенного препарату [16].
Експериментальн1 антигенн1 препарати C. diphtheriae оц1нювали за Тх б1ох1м1чним складом, ад'ювантними властивостями щодо нативного очи-щеного дифтер1Иного анатоксину за даними РПГА та специф1чною безпечн1стю за шк1рними реакц1ями при вакцинаци лабораторних тварин (крол1в).
Експериментальн1 досл1дження було проведено з дотриманням вимог гуманного ставлення до п1ддо-сл1дних тварин, регламентованих Законом УкраТни
«Про захист тварин вщ жорстокого пово-дження» (№ 3447-М вiд 21.02.2006 р.) та бвропейською конвенцieю про захист хре-бетних тварин, як використовуються для до-слiдних та iнших наукових цтей (Страсбург, 18.03.1986 р.).
Результати дослщження та Тх обговорен-ня. Застосування рiзних фiзичних факторiв та Тх режи1^в показало, що за умови однаковоТ оптичноТ щiльностi зразкiв вихщноТ мтро-бноТ суспензи (13,5 х 109 КУО/мл), вони мають власш характеристики впливу на поверхнев1 структури бам^альних клiтин коринебакте-рiй. Бiохiмiчнi дослiдження одержаних бак-терiальних антигенних препаралв показали значне варiювання вмiсту бiлку та тейхоевих кислот (табл. 1).
З даних табл. 1 очевидно, що найбшьш1 показники концентраци бтку у препаратах -вщ 22,4 до 28,9 мг/мл - виявилися при засто-суваннi гелш-неонового лазеру, ЕМВ НЗВЧ (2) та Тх комбшаци. Щодо тейхоевих кислот, ям е складовими ^тинноТ стшки грампозитивних бактерiй та вважаються адгезинами, найбть-шi концентраци глщерин-тейхоевоТ кислоти знайдено у препаратах, виготовлених пщ дiею УЗО+лазер ТГц (274, 1 мкг/мл), лазеру Не^е, ЕМВ НЗВЧ 42,2 ГГц (270,21 мкг/мл), УЗО+лазер Не^е (258,66 мкг/мл). Поеднання дм ультразвуку i лазерiв ТГц або Не^е дало максимальний вихiд рибпх>л-тей-хоевоТ кислоти - 107,1 та 113,1 мкг/мл, вщповщно.
Взагалi треба вщзначити значнi коливання вмiсту уах вказаних речовин у дослiджуваних антигенних препаратах: по бтку - максимум у 9,2 рази, для тейхоевих кислот - у 5,6 рази (ГТК) та у 11,5 рази (РТК). Для дослщжуваних антигенних препаралв знайдено прямий кореляцшний зв'язок середньоТ сили помiж виходом бтку та суми тейхоевих кислот (р = 0,664).
В ходi подальших дослщжень для дезштеграци мтробноТ маси використовувалося ультразвукове опромiнення (УЗО) завдяки можливост залучення рiзних приладiв-джерел ультразвуку, у тому числ1 промислових, з бажаними техшчними характеристиками i регулюванням режимiв опромiнення.
Стандартизацiя режимiв УЗО середньоТ частоти та низькоТ потужностi показала можливiсть впливу на вм^ бiлку в антигенному препарат при варiюваннi вихщноТ оптичноТ щтьносл мтробноТ суспензи та тривалостi дм УЗО [17]. Так, якщо оптична щтьшсть мтробноТ суспензи С. diphtheriae становила 1 МсF (за шкалою Мак-Фарланд), то концентращя бiлку складала 0,24 мг/мл. Пщвищення оптичноТ щтьносл втричi дало вихiд бiлку у препарат у 7,7 разiв бть-ший - 1,85 мг/мл, а оптична щтьшсть 15 МсР дала можлив^ь пiдвищити концентрацiю бiлку майже у 52 рази - 12,38 мг/мл.
Варшвання режимiв опромiнення ультразвуком дало можливiсть встановити оптимальну тривал^ь ди УЗО для заданих параметрiв ультразвуку. Макси-мальнi значення концентраци бтку було зареестро-вано на четвертш та сьомiй годинi УЗО, а саме: 2,38 мг/мл.
Виявилося також, що послщовна ступшчаста ультразвукова дезштегращя мтробноТ суспензи збудника дифтери дозволяе суттево пiдвищити кон-
Таблиця 2.
Динамша р1вня гуморального 1мун1тету проти дифтерп в сироватках кров1 крол1в п1сля Тх вакцинацп досл1джуваними антигенними препаратами
№№ Антигены Р1вень антитоксишв, МО/мл
пп препарати 7 дн1в 14 дшв 21 день 28 дшв
К НОДА (20 и) 0 0 0 0
1 ВДВ 1,5 0,7 0,35 0,5
2 ДЗ 0,125 0,06 16,0 0,03
3 КС 0 0,03 0 0
4 БА 0 0,125 0,06 0
5 БА (1:2000) 0 0,03 0 0
центрацiю бiлку у антигенному препаратi за рахунок використання другого семигодинного циклу УЗО бю-маси збудника: темпи приросту концентрацп бiлку на цьому етапi складали 50,6 %. Третш цикл УЗО бюмаси дозволив одержати антигенний безклп"инний препарат з концентрацiею 1,51 мг/мл. На 4-5-му циклах вихщ бшку суттево зменшився - до 0,86 та 0,66 мг/мл.
Антигены властивост дослщжуваних препаратiв вивчалися при шдшшрнш вакцинацп кролiв, яким уводили, вщповщно, 1,0 мл нативного очищеного дифтершного анатоксину (НОДА), вбиту формалшом цiльноклiтинну дифтерiйну вакцину (ВДВ), мтро-бний УЗО-дезiнтеграт (ДЗ), препарат кл^инних стiнок збудника дифтери (КС), бам^альний антиген (БА), що мiстив розчинш поверхневi антигени. Середнi по-казники щотижневого рiвня титрiв антитоксичного дифтершного iмунiтету в сироватках кровi вакцино-ваних кролiв впродовж мiсяця тсля пiдшкiрного ще-плення представленi у таблиц (табл. 2).
Як виявилось, щеплення кролiв препаратом очищеного концентрованого дифтершного анатоксину в дозi 20 Lf не призвело до формування антитоксичного гуморального iмунiтету. Пщшшрне введен-ня кролям препаралв бактерiальних антигенiв С. diphtheriae стимулювало утворення антитоксичних антитiл. Вбита формалшом цшьноклпшнна дифте-рiйна вакцина, як найбшьш повноцiнний в антигенному вщношенш препарат, вже через тиждень пiсля щеплення призвела до появи антитоксишв - 1,5 МО/ мл, рiвень яких впродовж мiсяця поступово знизився до 0,5 МО/мл.
Введення мтробного УЗО-дезiнтеграту iстотно пiдвищило утворення антитоксинiв - на третьому тижш титр антитiл збтьшився вiд початкового 0,03 до 16,0 МО/мл, але в подальшому рiзко впав.
Застосування препаратiв клiтинних стшок та цть-ного або розведеного (1:2000) розчинного поверх-невого бам^ального антигену дезiнтегрованих ми кробних клп"ин дифтери призводило до етзодично|' (одно- дворазово'|) появи невисоких титрiв антитоксичних антитт - вiд 0,03 до 0,125 МО/мл (табл. 2).
Результати визначення ад'ювантних властивостей дослщжуваних препаралв субкл^инних комплексiв в комбшацп з НОДА за даними РПГА наведет у таблиц! 3. За контроль був взятий нативний очищений дифтершний анатоксин в дозi 20 Lf
Найбiльшi титри протидифтершних антитоксинiв показала комбiнацiя дезiнтеграту мтробних клiтин С. diphtheriae, розведеного 1:1000, з дифтершним анатоксином: к третьому-четвертому тижню резуль-
Таблиця 3.
Динамша р1вня дифтер1йного гуморального 1мун1тету в сироватках кров1 крол1в п1сля Тх !мун1зацм бактер1альними антигенними препаратами С. diphtheriae
№№ пп Антигенш препарати Р1вень антитоксишв, МО/мл
7 дшв 14 дшв 21 день 28 дшв
К Контроль (НОДА) 0 0 0 0
1 НОДА + ДЗ (1:1000) 0 0,5 16,0 16,0
2 НОДА + КС 0 0,5 1,0 0,25
3 НОДА + БА (1:2) 0,5 4,0 2,0 2,0
4 НОДА + БА (1:2000) 0 0,03 0 0,03
тати РПГА досягли високого рiвню - 16,0 МО/мл. Препарат клп"инних стiнок разом iз НОДА викликав формування менш напруженого титру антитт - вщ 0,5 до 1,0 МО/мл на 2-3-му тижш, який надалi знизився до 0,25 МО/мл. Швидке збтьшення рiвня антитт виявила комбiнацiя НОДА з розведеним 1:2 бактери альним антигеном: через тиждень шсля iмунiзацií ри вень iмунiтету складав 0,5 МО/мл, на другому тижш вш досяг значення 4,0 МО/мл, а надалi стаб^зував-ся на рiвнi 2,0 МО/мл. Розведення БА 1:2000, в комбшацп з аналопчною дозою дифтершного анатоксину дало мЫмальш рiвнi iмунiтету - 0,03 МО/мл - на другому та четвертому тижш.
Введення дослщжуваних антигенних препаралв-ад'юванлв у склад офщинально|' дифтершно'| вакци-ни зi зменшеним антигенним навантаженням АД-М при зменшенш и дози у 5 разiв - до 1 Lf (К), шдтвер-дило ад'ювантну дiю препаралв (табл. 4).
Комбiнацiя (№ 1) вакцини АД-М (1 Lf) i 0,5 мл розведеного у 2,5 рази препарату ДЗ обумовила високий рiвень антитоксишв з другого тижня iмунiзацií (4,0 МО/мл), надалi захисний рiвень зберiгався, тодi як у контролi (К) сероконверсГ|' не вщбулося. У тварин, вакцинованих з додаванням до вакцини АД-М 0,5 мл препарату БА (№2) та 0,1 мл препарату БА-ф (№ 3), який було одержано за допомогою фтьтрацп БА через фшьтри «Владшор», iмунiзацiя комбшованим препаратом виявились найбшьш результативною: титри протидифтершних антитт досягли стабтьних високих показнимв - 4,0-8,0 МО/мл.
Таблиця 4.
Р1вень дифтершних антитоксин1в в сироватках
кров1 крол1в, вакцинованих зменшеними дозами вакцини АД-М в поеднанш з досл1джуваними антигенними препаратами
№№ пп Склад вакцини Р1вень антитоксишв, МО/мл
7 дшв 14 дшв 21 день 28 дшв
К 0,1 мл АД-М (1 Щ 0 0 0 0
1 0,1 мл АД-М (1 1^) + 0,5 мл ДЗ (1: 2,5) 0 4,0 1,0 0,25
2 0,1 мл АД-М (1 + 0,5 мл БА 0,125 8,0 8,0 4,0
3 0,1 мл АД-М (1 + 0,1 мл БА-ф 4,0 4,0 8,0 4,0
Основними вимогами до якост вакцин е поеднан-ня Тх ефективност та нешкiдливостi [17]. Вивчення специфiчноТ безпечностi дослiджуваних антигенних препаратiв шляхом постановки кролям внутрш ньошмрноТ проби з дослщжуваними антигенними препаратами рiзного ступеню очищення показало, що у першi регламентованi чотири днi спостережен-ня найбiльш реактогенним виявився препарат ДЗ - у двох кролiв з трьох спостеркалися iнфiльтрати до 8 мм у дiаметрi, а в одшеТ з тварин - очаг некрозу. Зони шмрних реакцш на введення препарату БА виявили-ся майже вдвiчi меншими - 4,5 мм. Найменш реактогенним на даному етап спостережень виявився препарат БА-ф, який призвiв лише до появи невеликого почервоншня (2 мм) у одшеТ тварини. Препарати кли тинних стшок та цтьнокл^инноТ вакцини вiдразу ж дали формування гшеремп та шфшьтрацп (5 мм i 2,8 мм, вщповщно).
Подовження строку спостереження за розвитком шкiрних реакцiй на дослiджуванi антигенш препарати до 15 дшв дало можливiсть виявити появу тз-нiх реакцiй на препарати ДЗ, БА i навiть на первкно ареактогенний препарат БА-ф при збтьшенш серед-нiх дiаметрiв зон шфшьтрацп: 13 мм, 10,5 мм, 7 мм, вщповщно. Реакцп на препарат клп"инних стiнок та цiльноклiтинну дифтершну вакцину в цей перiод ре-дукувалися.
Розведення препарату БА удвiчi (БА 1:2) дозволило усунути шмрш реакцп на його введення, ад'ювантш властивостi при цьому збереглися: титр антитоксишв коливався вiд 0,5 МО/мл на першому тижнi тсля вакцинацп до 4,0 МО/мл на другому та 2,0 МО/мл на 3-4-му тижнях.
Застосування гель-хроматографп для очищення препарату БА-ф дало можливiсть видшити фракцiю протеТшв з молекулярною масою понад 13 тис. Дальтон, питома вага якоТ в середньому перевищувала 50 % в загальному складi видшених фракцiй, та низько-молекулярнi фракцп вiд 1 до 10 тис. Дальтон, на як1 приходилися одиничш вiдсотки.
1мушзащя монопрепаратами вказаних фракцiй не призвела до появи антитоксишв у кровi тварин. Не було зареестровано жодних шшрних реакцш.
Випробовування Тх ад'ювантноТ дм щодо натив-ного очищеного дифтерiйного анатоксину (в дозi 20 Lf, 0,4 мл) на лабораторних тваринах з нульовими титрами дифтершних антитоксишв, iмунiзованих у минулому роц експериментальними дифтерiйними вакцинними препаратами, призвело до розвитку напруженого гуморального iмунiтету - до 32,0 МО/ мл. Цей рiвень зберкався впродовж строку спостереження при вакцинацп комбшованим антигенним препаратом з фракцiею протеТшв з молекулярною масою понад 13 тис. Да. 1нш^ низькомолекулярнi, фракцп теж були здатнi активно стимулювати анти-токсичний iмунiтет: у порiвняннi з дiею НОДА контр-ольний рiвень антитоксинiв (0,25 МО/мл) на другому тижш було перевищено у 128 разiв, а на 3-4-му тижш у 4-8 разiв.
Висновки
1. Показано принципову можливiсть удоскона-лення дифтершноТ вакцини за рахунок поеднання нативного очищеного дифтершного анатоксину та ад'юванту бактерiального походження, виготовлено-го з мтробноТ маси токсигенного штаму С. diphtheriae за допомогою рiзних фiзичних чинникiв.
2. Вакцинащя тварин дослiджуваними дифтерш-ними бам^альними антигенними препаратами рiзного ступеня очищення (дезштеграт, супернатант, фiльтрат, гель-хроматографiчнi фракцГТ) разом iз на-тивним очищеним дифтершним анатоксином при-зводить до формування захисного рiвня гуморального антитоксичного iмунiтету.
3. Послiдовна очистка мтробного дезiнтеграту фiзичними методами (центрифугування, фшьтра-цiя, препаративна рiдинна гель-хроматографiя) або адекватне розведення антигенних препаралв до-зволяють ефективно усунути реакцп на вакцинацiю експериментальними антигенними препаратами С. diphtheriae при збереженнi Тх ад'ювантноТ дм.
Перспективи подальших дослщжень. Одержан! за допомогою фiзичних чинникiв препарати поверх-невих антигенiв збудника е бюлопчними платформами для подальшоТ розробки удосконалених комбiно-ваних вакцин проти дифтери.
Лiтература
1. WHO/Diphtheria reported cases. Last update: 15-July-2018 (data received as of 09-Jul-18).
2. Global Vaccine Action Plan 2011 - 2020. Immunization, Vaccines and Biologicals.
3. WHO data. WHO vaccine-preventable diseases: monitoring system. 2018 global summary. Coverage time series for Ukraine (UKR). Last updated 15-Jul-2018 (data as of 15-Jul-2018).
4. Chudnaya LM, Oksiyuk VG, Krasyuk LS, Moroz LV, Bryzhata SI, Skuratovskaya IM, i dr. Ehpidemiologicheskaya situaciya po difterii na Ukraine. Ehpidemiologiya i infekcionnye bolezni. 1999;1:10-2. [in Russian].
5. Kolesnikov MM, Petrusevich TV. Vivchennya mozhlivosti viniknennya timchasvoi sprijnyatlivosti do difterijnogo toksinu u shcheplenih tvarin. Suchasni infekcii. 2002;4:69-71. [in Ukrainian].
6. Demihovs'ka OV, Chudna LM. Epidemiya difterii v Ukrayni: pidsumki i uzagal'nennya. Ukrayns'kij medichnij chasopis. 1999;3(12):56-8. [in Ukrainian].
7. Narkevich NI, Tymchakovskaya IM. Osobennosti raspostraneniya difterii na fone immunizacii detej. Zhurnal mikrobiologii, ehpidemiologi, immunologic 1996;2:25-9. [in Russian].
8. Kharseeva GG, Alieva AA. Adhesion of Corynebacterium diphtheriae: the role of surface structures and formation mechanism. Zh. Mikrobiol. (Moscow). 2014;4:109-17.
9. Kawai T, Akira S. Toll-like receptors and their crosstalk with other innate receptors in infection and immunity. Immunity. 2011;34(5):637-50.
10. Rusek P, Wala M, Druszczynska M, Fol M. Infectious Agents as Stimuli of Trained Innate Immunity. Int J Mol Sci. 2018 Feb 3;19(2). pii: E456. DOI: 10.3390/ijms19020456
11. Netea MG, Joosten LA, Latz E, Mills KH, Natoli G, Stunnenberg HG, et al. Trained immunity: A program of innate immune memory in health and disease. Science. 2016 Apr;22(352):6284.
12. Locht C, Mielcarek N. Live attenuated vaccines against pertussis. Expert Rev Vaccines. 2014 Sep;13:1147.
13. Shmeleva EO, avtor; Shmeleva EO, patentoobladatel'. Sposob povysheniya nespecificheskoj rezistentnosti organizma i sposob polucheniya preparata dlya povysheniya nespecificheskoj rezistentnosti organizma. № 2019181 RU; 1994 Sent 15. [in Russian].
14. Isaenko EYu. Primenenie ul'trazvuka dlya dezitegracii mikrobnih kletok. Annals of Mechnicov Institute. 2008;1. Dostupno: www.imiamn.org/ journal.htm 5 [in Russian].
15. Yelyseieva IV, Doroshenko AO, Babich EM, Zhdamarova LA, Bilozers'kij VI, Gorbach TV. Viznachennya osoblivostej spektra fluorescencii zrazkiv nativnogo ochishchenogo difterijnogo anatoksinu. Zhurnal klinicheskih i ehksperimental'nyh medicinskih issledovanij. 2017;5(1):680-9. [in Ukrainian].
16. Babych YeM, Yelyseieva IV, Bilozerskyi VI, Zhdamarova LA, Isaienko OYu, Bobyrieva IV, Horbach TV, vynakhidnyky; Derzhavna ustanova «Instytut mikrobiolohiyi ta imunolohiyi im. I. I. Mechnykova NAMN Ukrayiny», patentovlasnyk. Sposib otrymannia bakteriinoho dyfteriinoho antyhenu. № 86891 UA. 2014 Sich 10. [in Ukrainian].
17. Ada G. The importance of vaccination. Front Biosci. 2007Jan;1(12):1278-90.
ПОВЕРХНЕВ1 АНТИГЕНИ ЗБУДНИКА ДИФТЕРП, ОДЕРЖАН1 ЗА ДОПОМОГОЮ Ф1ЗИЧНИХ ЧИННИК1В, ЯК Б1ОЛОГ1ЧНА ПЛАТФОРМА ДЛЯ РОЗРОБКИ КОМБ1НОВАНО1 ДИФТЕР1ЙНО1 КАНДИДАТ-ВАКЦИНИ Елисеева I. В., Бабич €. М., Ждамарова Л. А., Бiлозерський В. I., Колпак С. А.
Резюме. Дослщжеш практичнi аспекти п1дход1в до розробки комбшованоТ дифтершноТ вакцини на основ! бактер!ального дифтерiИного антигену, одержаного за допомогою дм ф!зичних факторiв. Оцiнювалася ефективнiсть дм р1зних ф1зичних факторiв (ультразвук, вузькосмугове електромагштне випромiнення над-звичаИно високоТ частоти, лазерне опромiнення) на м1кро6н1 клп"ини C. diphtheriaе за 61ох1м1чним складом одержаних препаралв. Проводилась оптимiзацiя режимiв ультразвукового опромiнення бiомаси патогену для одержання поверхневих бактерiальних антигешв. Вивчалися антигеннi та ад'ювантнi властивост експериментальних препаратiв. Особлива увага придтялася забезпеченню Тх специфiчноТ нешкiдливостi, котра досягаеться послщовною очисткою м1кро6ного дезштеграту ф1зичними методами (центрифугування, фiльтрацiя, препаративна рщинна гель-хроматографiя) або адекватним Тх розведенням.
Ключовi слова: дифтерiИна вакцина, бам^альниИ дифтерiИниИ антиген, ультразвук, електромагштне випромшення надзвичаИно високоТ частоти, лазерне опромшення.
ПОВЕРХНОСТНЫЕ АНТИГЕНЫ ВОЗБУДИТЕЛЯ ДИФТЕРИИ, ПОЛУЧЕННЫЕ ПРИ ПОМОЩИ ФИЗИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ, КАК БИОЛОГИЧЕСКАЯ ПЛАТФОРМА ДЛЯ РАЗРАБОТКИ КОМБИНИРОВАННОЙ ДИФТЕРИЙНОЙ КАНДИДАТ-ВАКЦИНЫ
Елисеева И. В., Бабич Е. М., Ждамарова Л. А., Белозерский В. И., Колпак С. А.
Резюме. Исследованы практические аспекты разработки комбинированноИ дифтериИноИ вакцины на основе бактериального дифтериИного антигена, полученного при помощи физических факторов. Оценивалась эффективность воздеИствия различных физических факторов (ультразвук, узкополосное электромагнитное излучение сверхвысокоИ частоты, лазерное излучение) на микробные клетки C. diphtheriaе по биохимическому составу полученных препаратов. Проводилась оптимизация режимов ультразвукового облучения биомассы патогена для получения поверхностных бактериальных антигенов. Изучались антигенные и адъювант-ные своИства экспериментальных препаратов. Особое внимание уделено обеспечению их специфическоИ безопасности, которая достигается последовательноИ очисткоИ микробного дезинтеграта физическими методами (центрифугирование, фильтрация, препаративная жидкостная гель-хроматография) или адекватным их разведением.
Ключевые слова: дифтериИная вакцина, бактериальныИ дифтериИныИ антиген, ультразвук, электромагнитное излучение сверхвысокоИ частоты, лазерное излучение.
SURFACE ANTIGENS OF C. DIPHTHERIAE OBTAINED BY PHYSICAL FACTORS AS A BIOLOGICAL PLATFORM FOR THE DEVELOPMENT OF COMBINED DIPHTHERIAL CANDIDATE-VACCINE
Yelyseyeva I. V., Babych E. M., Zhdamarova L. A., Belozersky V. I., Kolpak S. A.
Abstract. Diphtheria infection is currently recorded mainly in countries endemic in diphtheria. According to the WHO, in 2017, Nigeria (7616), India (5293), Indonesia (954), Venezuela (786), Nepal (728), Pakistan (560) reported the highest incidence of diphtheria. In all of these countries, there is a tendency to increase the incidence compared to 2016, especially in Pakistan - 46.7 times and in Venezuela - 25.4 times. Within them, diphtheria remains a serious health problem and is, as a result of intensive migration processes in the modern world, a potential risk for countries epidemiologically well-off with diphtheria. The last epidemic rise of diphtheria in the countries of Eastern Europe in the 90s of the last century was on the background of significant immunization rates and a high proportion of vaccinated among the sick. Clinically expressed and toxic forms of diphtheria have been recorded even in fully vaccinated people. Among the causes of the incidence of diphtheria in vaccinated children, scientists call the possible use of drugs with insufficient antigenic load, insufficient immunogenicity of drugs used, violation of immunization schemes, impairment of the immune status of children and a certain percentage of truly refractory children. The indicated epidemiological features of the rise of morbidity, as well as the existence of endemic diphtheria territories raised a number of questions about the effectiveness of vaccine prophylaxis of this dangerous infection and forcing scientists to continue to seek ways to improve it. Practical aspects of the development of a combined diphtheria vaccine based on bacterial diphtheria antigen obtained by physical factors were studied. The aim of the study was development of approaches to obtaining surface antigens of C. diphtheriae bacterial cells as a biological platform for the creation of a combined vaccine against diphtheria with a bacterial component by physical factors. The efficiency of various physical factors (ultrasound, narrow-band electromagnetic radiation of ultrahigh frequency, laser radiation) was evaluated for C. diphtheriae microbial cells according to the biochemical composition of the preparations obtained. Optimization of ultrasonic irradiation of biomass pathogen for obtaining surface bacterial antigens was carried out. Antigenic and adjuvant properties of experimental preparations were studied. Particular attention is paid to ensuring their specific safety, which is achieved by sequential purification of the microbial disintegration by physical methods (centrifugation, filtration, preparative liquid gel chromatography) or by adequate dilution. It is
shown the principle opportunity of improving the diphtheria vaccine by combining the native purified diphtheria toxoid and adjuvant of bacterial origin made from the microbial mass of the toxigenic strain C. diphtheriae by various physical factors. Vaccination of animals with investigated diphtheria bacterial antigenic preparations of different degree of purification (disintegrate, soluble antigenic complexes, filtrate, gel-chromatographic fractions) together with native purified diphtheria toxoid leads to stimulation of humoral antitoxic immunity. Sequential purification of the microbial disintegrator by physical methods (centrifugation, filtration, preparative liquid gel chromatography), or adequate dilution of antigenic preparations, effectively eliminate the skin reactions to vaccination with experimental C. diphtheriae antigen preparations and preservation of adjuvant effect. Prepared C. diphtheriae surface antigen agents obtained by different physical factors are biological platforms for the further development of advanced combined diphtheria vaccines.
Key words: diphtheria vaccine, bacterial diphtheria antigen, physical factors, ultrasound, electromagnetic radiation of ultrahigh frequency, laser irradiation.
Рецензент - проф. Лобань Г. А.
Стаття надшшла 27.07.2018 року
DOI 10.29254/2077-4214-2018-3-145-256-259 УДК 579.61
Скляр Т. В., Лаврентьева К. В., Кременчуцька П. €., Лихолат О. А., Джужа Д. О.
ОСОБЛИВОСТ1 СТ1ЙКОСТ1 ДО АНТИБ1ОТИК1В М1КРООРГАН1ЗМ1В У СКЛАД1 М1КРОФЛОРИ ШЛУНКОВО-КИШКОВОГО ТРАКТУ У ХВОРИХ НА ГЕПАТИТ В Дншровський нацюнальний ушверситет iMeHi Олеся Гончара (м. Дншро)
polinakrr@yandex.ru
Зв'язок публшацп з плановими науково-дослщ-ними роботами. Дослщження виконано у межах науково-дослщно'|' теми: перспективы для викорис-тання людиною бюлопчш властивост мтрооргашз-мiв - компонент природних i штучних бiоценозiв (номер державно'| реестрацп 0118и003277), що ви-конуеться на кафедрi мшробюлогп, вiрусологií та бю-технологи Днтровського нацюнального ушверсите-ту iменi Олеся Гончара.
Вступ. Протягом двох останшх десятилпъ вщзна-чаеться iстотне збiльшення випадмв захворювання на хронiчнi гепатити, це обумовлено покращенням дiагностики, адже лише в минулому столгт щенти-фтовано вiрус гепатиту С, а 1990 роц вдалося роз-шифрувати структуру вiрусу гепатиту Е, G, D [1]. За рiзними даними на земнш кулi носив вiрусу гепатиту В вщ 400 мiльйонiв до 2 мiльярдiв людей, iз них 40% - переносить гострий гепатит у субкл^чний формi, у 10-25 % випадшв хронiчне носiйство гепатиту В при-зводить до тяжких захворювань печшки, а 2 мтьйо-ни людей щорiчно помирають вщ гепатиту В. Дiти що перехворши гострим гепатитом у 90% виявляються хрошчш захворювання печiнки. В Укра^ 2,2 % насе-лення е ноаями НВsAg [2].
За даними Центру медичноТ статистики МОЗ Украши, захворюванiсть хронiчними гепатитами у середньому по Укра^ складала у 2005 роц 440,7 на 100 тис. населення. Найбтьш часто в дитячому вщ1 зустрiчаються гепатити вiрусноí етюлоги - В, С, D, С та ш. Так, частота поширення гепатиту В досягае 20 -30%, гепатиту С - 32-43% [3,4].
Вщомо, що у хворих на гепатит В в порожниш тов-стоТ кишки (ПТК) створюються сприятливi умови для розвитку дисбютичних зсувiв, активаци умовно пато-генних мiкроорганiзмiв i прояву íх агресивних влас-тивостей. Це зумовлено змшою середовища про-живання мiкроорганiзмiв у товстш кишцi внаслiдок порушень функцюнального стану печiнки, жовчо-видiлення, морфофункцюнальних розладiв шлунку, пiдшлунковоí залози i кишок, порушень секретор-
но-ферментативно! дiяльностi шлунково-кишкового тракту (ШКТ) [5].
Актуальшсть гепатиту В зумовлена високим piB-нем захвоpюваностi, складнiстю патогенезу, недо-статньою ефективнiстю лiкування, тяжкими наслщ-ками хвороби [6].
Метою роботи було вивчення складу мтрофлори товстого кишечника людей хворих на гепатит В.
Об'ект i методи дослщження. Проведена дiа-гностика за допомогою iмунофеpментного аналiзу на виявлення гепатиту В. Дiагностику проводили за допомогою тест-системи №A-HBsAg. Набip призна-чений для виявлення поверхневого антигену вipусу гепатиту В (HBsAg) в сироватц або плазмi кpовi лю-дини «in vitro» методом твердофазного iмунофеp-ментного «сендвiч»-аналiзу. Дiагноз вipусного гепатиту В шдтверджувався виявленням у сироватц1 кpовi HBsAg та Anti-HBc IgM методом 1ФА [7].
Для поставлено! задачi було залучено 45 чоловж вiком вiд 18 до 57 ромв, якi були подшеш на 3 групи:
- група - люди втом вiд 18 до 30 рошв (n=12);
- група - люди втом вщ 30 до 45 pокiв (n=20);
- група - люди втом вiд 45 до 57 рошв (n=13).
Пiсля цього проводили бактерюлопчне досли
дження мiкpофлоpи товстого кишечника людей хворих на гепатит В для виявлення умовно-патогенно! аеробно!та анаеробно! мiкpофлоpи та визначення ступеню дисбiозу [8].
На наступному етапi визначали чутливiсть до ан-тибактеpiальних пpепаpатiв видiлених штамiв умов-но-патогенних бактеpiй методом дифузп в агаpi [9].
Статистичну обробку отриманих результат проводили з використанням програми Microsoft Exell.
Результати дослщження та ix обговорення. Ви-значено, що серед 45 обстежених оаб у 35 (78%) було виявлено гепатит В. Дослщження стану мтробюце-нозу товсто! кишки проведено у 35 пащенлв хворих на гепатит В. Проведет мтробюлопчш дослiдження вм^у товсто! кишки у хворих на гепатит В показали наявшсть змш якiсного та кiлькiсного складу мтро-флори у 100,0 % хворих (рис. 1).
