CC BY
20
УДК 619:615.28:576.8 Мандигра М.С., д.вет.н., професор, член-кор. УААН (E-mail: ieuaan@ukr.net) Лисиця А.В., к.б.н., доцент (E-mail: lysycya@ukr.net) Степаняк 1.В., к.вет.н., ст.наук.ствр.
Бойко О.П., астрант (E-mail: pkboyko@ukr.net) Мандигра-Мельник Ю.М., бюлог © 1нститут етзоотологп УААН, м. Р1ене
ПОРШНЯЛЬНА ОЦ1НКА БАКТЕРИЦИДНО! АКТИВНОСТ1 Р1ЗНИХ
ПОХ1ДНИХ ГУАН1ДИНУ
В робот1 розглянуто мехатзми еплиеу атону на протимжробну актиетсть полйексаметилегуатдину. Наведено результати мжробюлоггчних еипробуеань бюцидних препарат1е р1зного хгмгчного складу.
Ключовi слова: антимжробна актиетсть, дезтфектант, пол1гексамет иленгуатдин.
Вступ. Серед порiвняно нових антибактерiальних препарата, яю найбшьш повно вщповщають зростаючим вимогам щодо дезшфектанта для ветеринарно! медицини, провiдне мiсце починають займати полiмернi сполуки гуанiдину. Ця група дезшфжуючих засобiв вигiдно вiдрiзняeться вщ традицiйних препаратiв, таких як четвертинш амонieвi сполуки (ЧАС), альдегiди, поверхнево-активш речовини (ПАР), похiднi фенолу, хлорактивш дезiнфiкуючi препарати. Завдяки полiмернiй природi похiднi гуанiдину мають вищу бюцидну активнiсть нiж !х низькомолекулярнi аналоги на зразок хлоргексидину бiглюконату, при цьому вони е й менш токсичними.
Одним з основних препарата групи полiмерних похiдних гуанiдину е пол^ексаметиленгуанщин (polyhexamethyleneguanidine) (рис.1). Бiоциднi властивост полiгексаметиленгуанiдину (далi ПГМГ) та його похщних зумовлюються наявнiстю гуанiдинових груп [1].
—(CH2)6 — NH—C —NH —
II
NH . HCl
_ J n
Рисунок 1. Структура молекули пол1гексаметиленгуашдину г1дрохлориду
(ПГМГ хлорид).
ПГМГ вщповщае всiм вимогам щодо дезшфжуючих засобiв, це зокрема: - актившсть щодо широкого спектру мiкроорганiзмiв (бактерицидна, вiрулiцидна, альгiцидна, iнсектицидна, фунгiцидна);
© Мандигра М.С., Лисиця А.В., Степаняк 1.В., Бойко О.П., Мандигра-Мельник Ю.М., 2009 220
- повшьне формування резистентних форм мiкроорганiзмiв;
- формування резистентност мiкроорганiзмiв до ди 111 МГ супроводжуеться збiльшенням 1х чутливостi до iнших катiонактивних препаратiв [2];
- безпека для персоналу i тварин (не мае запаху, не леткий, за параметрами гостро! токсичност належить до 4-го класу безпеки, при потраплянш в середину оргашзму - до 3-го класу безпеки, робочi розчини препарату не подразнюють шкiру i слизовi оболонки);
- еколопчна безпека;
- стабiльнiсть при збер^анш i транспортуваннi;
- хороша розчиншсть у водi та високий рiвень змочувального контакту з обробленими поверхнями;
- мийш властивостi (катiонна ПАР);
- придатшсть до використання без активаци або змiшування кiлькох компонентiв;
- вщсутшсть агресивностi щодо конструкцiйних матерiалiв (не викликае корози металiв, не пошкоджуе гуми, скла, полiмерних матерiалiв тощо);
- пролонгована активнiсть (на оброблених ПГМГ поверхнях залишаеться малопом^на плiвка полiмеру, яка забезпечуе тривалу дiю препарату);
- незначна втрата активност в присутностi бiлкового навантаження (бшковий iндекс 1,6);
- ушверсальшсть (можливiсть дезшфекци шорокого кола обекив рiзними способами - протирання, зрошення, обприскування, занурення, замочування, заливання тощо).
Механiзм бюцидно! ди препарату полягае в наступному [1,3]. ПГМГ належить до групи катюнних полiелектролiтiв, якi завдяки N мають позитивний заряд молекули. На першому етапi взаемоди з негативно зарядженою бактерiальною клiтиною (заряд обумовлюеться тейхоевими, сiаловими кислотами, фосфатними групами лшдав) молекули ПГМГ адсорбуються на 11 поверхнi (бактерiальнiй стiнцi) та частково блокують дихання, живлення i транспорт метаболiтiв через клiтинну стшку. На наступному етапi молекули ПГМГ взаемодшть з цитоплазматичною мембраною мжрооргашзму, тут, крiм електростатичного (мiшенню можуть слугувати карбоксильш групи амiнокислот, бшки, кислi фосфолiпiди, кислi полiсахариди), дiе також i гiдрофобний механiзм - молекула ПГМГ мктить неполярнi гексаметиленовi дiлянки, якi взаемодiють з фосфолшщами мембран бактерiй. Певне значення мае i той фактор, що плазматична мембрана бактерш часто мiстить трубчаст або пластинчастi заглиблення в бж цитоплазми. Таким чином, при контакт з клiтиною вiдбуваеться електростатична взаемодiя негативно заряджених груп на кл^иннш мембранi з молекулою полiмеру, що призводить до переорiентацil молекули i потрапляння 11 заряджених фрагментiв до лшщного зовнiшнього моношару мембрани; макромолекула полiмеру кооперативно зв'язуеться з великою кшькютю молекул фосфолiпiдiв мембрани i спричиняе нейтралiзацiю 1х негативного заряду; комплекс, що утворився, стабшзуеться гщрофобними взаемодiями алкiльних ланцюгiв жирних кислот
221
фосфолшвдв, це призводить до змш електростатичних та гщрофобних взаемодш яю, стабшзують мембрану, та до послаблення лшщ-лшщних взаeмодiй; наслщком сорбци е порушення бар'ерних i транспортних функцiй мембрани; подальше проникнення гщрофобного фрагменту молекули полiгексаметиленгуанiдину до неполярно! частини кл^инно! мембрани призводить до l! розширення та до порушення ван-дер-ваальсово! взаемоди мiж молекулами лшвдв; наслiдком цього е спочатку змша проникностi, а потiм i цiлiсностi мембрани, яка фрагментуеться i деструктуруеться. Крiм того, мембрана прокарют мiстить системи окисного фосфорелювання, ферменти перенесення електрошв, залiзо-сiрчанi бiлки та шшц наприклад, цитохром С розташований на зовнiшньому боцi мембрани, АТФ-синтаза - на внутршньому. Оскiльки молекули ПГМГ е ферметактивними сполуками, то вони також можуть шпбувати роботу окремих ферментних систем цитоплазматично! мембрани бактерш [4]. Комплекс уЫх щх факторiв призводить до порушення цшсност мембрани, l! ферментативних, бар'ерних, i транспортних функцiй, i як наслщок - до розладу метаболiзму i загибелi клiтини.
Токсичнiсть i бюцидш властивостi полiгуанiдинiв значною мiрою залежать не лише вщ !х концентраций, а й вщ молекулярно! маси та хiмiчноl природи анiону. Вважаеться, що найбшьша бiоцидна активнiсть для ПГМГ гщрохлориду властива полiмеру з молекулярною масою близько 10 000-15 000 Да [1].
Макромолекулярна природа катюнного полiелектролiту значно впливае на його реакцшну здатнiсть при взаемоди з мжробною клiтиною. Мають мюце такi чинники, як кооперативна взаемодiя розташованих поруч у полiмерному ланцюгу функцiональних груп, внутрiшньомолекулярна взаемодiя вщдалених по ланцюгу фрагментiв, конформацiйнi перетворення полiмерного ланцюга, змiни комплементарностi макромолекул бюциду i бiлкових молекул бактерш. Вивчення взаемоди гнучколанцюгових молекул полiелектролiтiв з мiкробною клiтиною показало, що антимжробна активнiсть полiмеру залежить в першу чергу вщ величини заряду на макромолекулi i в бшьшоси випадкiв пiдвищуеться при порiвняннi з його низькомолекулярним аналогом через кооперативне зв'язування велико! кшькоси позитивно заряджених груп макромолекули з поверхнею негативно заряджено! бактерiальноl клiтини [5].
На вщмшу вiд ЧАС, де позитивний заряд локалiзований на одному атомi азоту, в катiонi гуанiдинiю, що входить до складу ПГМГ, заряд розподшено мiж трьома атомами азоту. Така будова реакцшного центру забезпечуе необхщний баланс мiж ефективнiстю бюцидно! дil антисептику щодо мiкроорганiзмiв та низькою токсичнiстю щодо теплокровних тварин i людини. Токсичнiсть полiгуанiдинiв (значення LD50) зменшуеться одночасно iз зменшенням електронегативностi анiону, тобто токсичнi властивоси гуанiдинових сполук залежать вiд ступеня делокалiзацil позитивного заряду в молекулi [5].
Анiоном у випадку ПГМГ-гщрохлориду слугуе Cl-. Хлор, як досить сильний акцептор, вщтягуе на себе електрони, збшьшуючи позитивний заряд на катюш гуанщинш. Перерозподiл електронно! густини в гуанщиновш групi створюе певне напруження у всiй макромолекулi, вона випрямляеться та 222
набувае форми близько! до лшшно!, при цьому вс гуанiдиновi групи е легкодоступними i можуть реалiзувати свою реакцiйну здатшсть при взаемоди з клiтиною. Аналопчно дiе анiон-акцептор ОН-.
Анiони глюконово! та iнших органiчних кислот, навпаки, вщдають електронну густину на гуанщинову групу, зменшуючи И позитивний заряд. 1нщшований анiоном перерозподiл електронно! густини в гуанщиновш групi поширюеться вздовж полiмерного ланцюга i пiдсилюе внутршньомолекулярш взаемоди вiддалених по ланцюгу функцюнальних груп. Внаслiдок цього молекула набувае стрально! конформаци, яка стабiлiзуеться водневими зв'язками i ван-дер-ваальсовими взаемодiями гексаметиленових фрагмента, а тип анюну визначае крок внутршньомолекулярно! спиралi. При цьому частина гуанщинових груп виявляеться блокованою i втрачае свою реакцiйну здатшсть, ^м того, може бути порушена комплементаршсть макромолекули полiгуанiдину i рецепторiв мембраних структур клiтини.
Отже, макромолекула ПГМГ являе собою добре збалансовану систему, в який гуанiдиновi групи несуть позитивний заряд i забезпечують бактерициднi властивостi, а тип анюну впливае на стутнь делокалiзацil позитивного заряду i тим самим контролюе токсичнiсть; гексаметиленовi дiлянки сприяють перерозподшу електронно! густини в макромолекулi й, ^м того, регулюють гiдрофiльно-гiдрофобний баланс молекули.
Пщсилення ефективностi бюцидно! ди полiмеру порiвняно з низькомолекулярним аналогом забезпечуеться кооперативною взаемодiею багатьох хiмiчно звязаних гуанiдинових груп з мжробною клiтиною, а зменшення токсичностi - можливктю делокалiзацil електронно! густини вздовж полiмерного ланцюга та його конформацшними перетвореннями.
В той час, як низькомолекулярш бiоциди при будь-який хiмiчнiй реакцi! з фiзiологiчно активними центрами втрачають сво! бiоциднi властивостi, полiмери у бiльшостi випадкiв !х збер^ають. Це пов'язано з тим, що внаслiдок конформацiйних i стеричних факторiв, реакцi! в полiмерних ланцюгах школи не вiдбуваються iз 100% конверЫею, i у модифiкованому анiонами оргашчних кислот ПГМГ завжди залишаються вшьш (не задiянi в реакцiях) гуанiдиновi групи. Регулюючи анiонний склад полiмеру, можна досягнути оптимального спiввiдношення бюцидних, токсичних i фiзико-хiмiчних властивостей антисептика.
Завданням наших дослщжень було з'ясувати вплив рiзних анiонiв на антибактерiальну актившсть ПГМГ.
Матер1али 1 методи. В експериментах були використаш такi солi похiдних гуанiдину:
ПГМГ сукцинат однозамщений (умовне позначення Епiдез-1), ПГМГ хлорид (Етдез-2),
полiгексаметилен бiгуанiдин або ПГМБГ (Епiдез-3),
ПГМГ валерат (Епiдез-4),
ПГМГ малеат (Епiдез-5),
ПГМГ сукцинат двозамщений (Епiдез-6),
223
дiетаноламiнбiгуанiдин дiхлорид (Етдез-7), неполiмерний препарат.
Визначення бюцидних властивостей препарата та мжробюлопчш дослiдження проводили за загальноприйнятими методиками [6,7]. Для приготування бактерiальноl та спорово! суспензи батистових тест-об'eктiв використали тестовi штами мiкроорганiзмiв: Esherichia coli АТСС 055 К59 №3912/41, Staphylococcus aureus АТСС №25923 F 49, Bacillus cereus (ДНК1БШМ, м. Ки1в). Готували 0,05-10% розчини дослщжуваних дезiнфiкуючих препаратiв на дистильованш водi з розрахунку 0,56 мл розчину на кожний тест-об'ект.
В робочi розчини занурювали батистовi тест-об'екти, iнфiкованi культурами Esherichia coli, Staphylococcus aureus, спорами Bacillus cereus. З моменту занурення тест-об'екив у дезшфжуючий розчин, через 15, 30 та 60 хв. петлею виймали по 2 тест-об'екти i тсля дворазового промивання у водi проводили поЫв !х у м'ясо-пептонний бульйон та агар (МПБ, МПА). ПоЫви iнкубували при +37 °С. Облж результатiв проводили щоденно, для вегетативних форм упродовж 6-7 дiб, для спорових форм - упродовж 14 дiб.
Результати дослщження. Узагальненi результати експериментiв наведено в табл. 1 -3.
Таблиця 1.
МПшмальш концентрат!" дезшфектанпв, як д1ють на picT тестового
м1кроорганпму Esherichia coli
Препарати та ix мшгмальт дiючi концентраци Етдез-1 4% Етдез-2 0,1% Етдез-3 3% Етдез-4 0,5% Етдез-5 0,5% Етдез-6 0,5% Етдез-7 10%
Експозицiя 15 хв. + + + + + + +
30 хв. - - - + + + +
60 хв. - - - - - - +
„+" - наявтсть росту тестового мiкроорганiзма; „-" - вiдсутнiсть росту тестового мжрооргатзма.
Отже, Етдез-1 д1е бактерицидно на тест-м1крооргашзм через 30 хв. в концентраци 0,5 %; Епщез-2 - в концентраци 0,1% через 30 хв.; Етдез-3 - в концентраци 3% через 30 хв.; Етдези-4,5,6 - в концентраци 0,5% через 60 хв.; Етдез-7 не д1е протягом 1 год. у 10% концентраци.
Таблиця 2.
МПшмальш концентрат! дезшфектант1в, як д1ють на ркт тестового
м1крооргашту Staphylococcus^ aureus
Препарати та i'x мшгмальт Етдез-1 2% Етдез-2 0,1% Етдез-3 0,5% Етдез-4 0,5% Етдез-5 1,5% Етдез-6 0,2% Етдез-7 10%
ДiЮЧi
концентраци
Експозищя
15 хв. - - + + + + +
30 хв. - - + + - - +
60 хв. - - - - - - +
224
Отримаш даш свщчать, що Етдез-1 дie бактерицидно на тест-мiкроорганiзм через 15 хв. в концентраци 2 %; Етдез-2 - в концентраци 0,1% через 15 хв.; Епщез-3,4 - в концентраци 0,5% через 60 хв.; Епщез-5 - в концентраци 1,5% через 30хв.; Етдез-6 - в концентраци 0,2% через 30 хв.; Етдез-7 не дie протягом 1 год. у 10% концентраций
Таблиця 3.
МПшмальш концентраци дезшфектанпв, як д1ють на рiст тестового
м1кроорганпму Bacillus cereus
Препарати та ix мшмальт Етдез-1 10% Етдез-2 9% Етдез-3 10% Етдез-4 10% Етдез-5 10% Етдез-6 10% Етдез-7 10%
Д1ЮЧ1
концентраци
Експозищя 15 хв. + + + + + + +
30 хв. + - + + + + +
60 хв. + - + + + + +
Отже, Епiдези-1,3,4,5,6,7 не дшть бактерицидно на тест-мжрооргашзм тсля 60 хв. експозици в концентраци 10%; Етдез-2 в концентраци 9% дie бактерицидно на Bacillus cereus через 30 хв.
Висновки. 1. Отже, з ycix випробуваних препарата найкращi бiоциднi властивостi показав 111 МГ хлорид (або Епiдез-2). Вш дie бактерицидно у концентраци 0,1% на Staphylococcus aureus (експозицiя 15 хв.) та Esherichia coli (експозищя 30 хв.), починаючи з концентраци 9% спороцидно на Bacillus cereus (експозищя 30 хв.).
2. 11 МГ сукцинат однозамiщений (Епiдез-1), полiгексаметилен бiгуанiдин або ПГМБГ (Епiдез-3), ПГМГ валерат (Епiдез-4), ПГМГ малеат (Етдез-5), П1 МГ сукцинат двозамiщений (Епщез-6) та дiетаноламiнбiгуанiдин дiхлорид (Епiдез-7) не виявили спороцидних властивостей щодо Bacillus cereus (експозищя 60 хв.) навт при максимальних концентрацiях 10%.
3. Щодо вегетативних (неспорових) форм Staphylococcus aureus та Esherichia coli випробуваш препарати за порядком зменшення активноси можна розташувати таким чином: Епщез-2 > Епiдез-6 > Епiдез-4 > Епiдез-5 > Епiдез-3 > Епщез-1 > Епiдез-7.
4. Низькомолекулярний дiетаноламiнбiгуанiдин дiхлорид (Епiдез-7) практично не проявив бюцидно! активностi навiть у високих концентращях (до 10%).
5. Токсичшсть випробуваних серiй Епiдезiв потребуе подальшого вивчення.
Л1тература
1. Гембицкий П.А. Полимерный биоцидный препарат полигексаметиленгуанидин / П.А. Гембицкий, ИИ. Воинцева. - Запорожье: Полиграф, 1998. - 44 с.
2. Нехорошева А.Г. Адаптация бактерий к катионактивным соединениям / А.Г. Нехорошева, Е.К. Скворцова // Проблемы дезинфекции и стерилизации. Сб. науч. трудов. - М., 1975. - Вып. 24. - С. 126-129.
225
3. Використання пол^ексаметиленгуанщину для дезшфекци / М.С. Мандигра, 1.В. Степаняк, А.В. Лисиця, Ю.М. Мандигра // Аграрний вкник Причорномор'я. Збiрник наукових праць. Вип. 42. - Одеса: СМИЛ, 2008. - Ч.2. - С. 69-73.
4. Бiохiмiчнi аспекти бюцидно! ди полiмерних похщних гуанiдину / М.С. Мандигра, А.В. Лисиця, 1.Л. Андрущук, Ю.М. Мандигра-Мельник // Вiсник Бiлоцеркiвського державного аграрного ушверситету: Зб. наук праць. - Бша Церква, 2009. - Вип. 60. - Ч. 1. - С. 81-85.
5. www.iet.biocide.ry
6. Довщник саштарно-мжробюлопчних методiв дослдшня харчових продуктiв та об'eктiв довкшля / В.1. 1вченко, В.В. Шарандак, Г.М. Денисенко, О.1. Горбатюк. - Бша Церква, 2004. -242 с.
7. Визначення чутливоси/стшкост мiкроорганiзмiв до дезшфжуючих засобiв: метод. Рек. / уклад.: Н.С. Морозова ти ш. - К.: Знання Украши, 2008. -12 с.
Summary
M.Mandygra, A.Lysytsya, I.Stepanyak, O.Boyko, Y.Mandygra-Melnyk THE COMPARATIVE ESTIMATION OF ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF DIFFERENT DERIVED GUANIDINES
The article presents the data of studies of the anion influence on antibacterial activity of polyhexamethyleneguanidine. There are also the results of the microbiological studies of antimicrobial properties of the solutions of different chemical composition.
Стаття надшшла до редакцИ 8.04.2009
226
