CC BY
6УДК 579.25:577.15
Т.В. Семашко, А.И. Горина, Е.А. Мартынова, Л.Н. Валентович, Л.А. Жуковская, А.Г. Лобанок
ПОЛУЧЕНИЕ ВЕКТОРНОЙ КОНСТРУКЦИИ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ В КЛЕТКАХ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ ГЕНА ИЗОФЕРМЕНТА С2 ПЕРОКСИДАЗЫ ИЗ КОРНЕЙ ХРЕНА
Институт микробиологии НАН Беларуси Республика Беларусь, 220141 г. Минск, ул. Купревича, 2 e-mail: tsemashko@mbio.bas-net.by
Проведен анализ нуклеотидных последовательностей генов изоферментов группы С пероксидазы из корней хрена, представленных в базе данных GenBank. Сконструирован вектор для экспрессии гена изофермента С2 пероксидазы из корней хрена (hrpC2) в клетках мицелиальных грибов на основе синтезируемой последовательности вышеуказанного гена и плазмид: рК18-са1, несущей фрагмент гена каталазы Penicillium adametzii для обеспечения встройки плазмиды в геномную ДНК, и pAN7-1, имеющей в своем составе промотор и терминатор гена глицеральдегидфосфатдегидрогеназы Aspergillus nidulans для экспрессии hrpC2.
Ключевые слова: ген пероксидазы хрена, изофермент С2, экспрессионные векторы, грибы рода PеmciUшm.
Введение
Ферменты — эффективные природные биокатализаторы. Они используются в химической и пищевой промышленности, фармацевтической индустрии, бытовой химии, сельском хозяйстве и т.д. Развитие биотехнологии, генетической и белковой инженерии позволило получать ферменты с новыми свойствами для катализа самых разнообразных химических реакций [1, 2].
Особый интерес представляют ферменты класса оксидоредуктаз, в частности перок-сидазы. Они способствуют осуществлению окислительных процессов, выполняют синтетическую и метаболическую, а также защитную функции.
Пероксидазы применяются в аналитической химии, медицинской диагностике и биотехнологии (в фотометрических, электрохимических, хемилюминесцентных, иммунофер-ментных и ДНК-гибридизационных методах анализа). Так, использование пероксидазы в качестве метки в иммуноферментном анализе позволяет определять различные вещества, такие как гормоны, онкомаркеры, аутоантитела, иммуноглобулины, лекарственные соединения и т. д. [3].
В настоящее время основным источником коммерчески доступной пероксидазы являются корни хрена (Armoracia rusticana) (HRP —
Horse Radish Peroxidase, КФ 1.11.1.7). Однако сезонность и нестандартность растительного сырья, сложность очистки фермента ставят производителей перед необходимостью поиска других источников пероксидазы. Кроме того, препараты HRP содержат несколько изоферментов, а их получение в гомогенном состоянии достаточно трудоемкая задача [4].
В последние годы прогресс, достигнутый в генной инженерии при клонировании эу-кариотических генов в гетерологических системах, позволяет решать задачи более детального анализа свойств отдельных изо-форм фермента, кодируемых определенным геном, а также их получения [5]. В литературе имеются сведения о конструировании векторов для экспрессии генов HRP в клетках Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Nicotiana tabacum, N. benthamiana и культурах клеток личинок насекомых [2]. Первая аминокислотная последовательность изофермента HRP C1 была определена в 1976 году Велиндером. Молекулярная масса полипептидной цепи составляла ~34 кДа [2]. В 1987-1988 года были установлены три кодирующих пероксидазу гена — prxC1, prxC2 и prxC3. К 2014 году было опубликовано в общей сложности 28 ну-клеотидных последовательностей различных изоферментов пероксидаз [5]. Установлено,
что ферменты, кодируемые этими последовательностями, различались по субстратной специфичности [3].
Система экспрессии E. coli наиболее популярна при исследовании кристаллической структуры HRP, поскольку позволяет довольно быстро получить дегликозилированные формы фермента. Однако отсутствие глико-зилирования в 2-3 раза снижает стабильность фермента. Согласно литературным данным, все кристаллические структуры пероксидаз растений, за исключением пероксидазы арахиса, были получены в Е. coli [3]. Способы получения рекомбинантной HRP в E. coli изучались многими исследователями на примере различных векторных систем. Существует несколько стратегий получения рекомбинантной HRP в E. coli, а именно: получение в качестве тел включения и последующий рефолдинг или получение активной пероксидазы хрена в периплазме [3, 6-8]. Недостатком подобных способов получения фермента является низкий выход целевого продукта. Так, при изучении возможности экспрессии пероксидазы в E. coli в работах Bartonek-Roxa с соавторами [7], было показано, что рекомбинантная HRP C1 может синтезироваться в цитоплазме клеток E. coli в тельцах включения в нерастворимой неактивной форме. Образование телец включения является единственным возможным способом защиты от токсического действия, вызванным HRP C1. Исследователи наблюдали ингибирование роста трансформантов E. coli. Ингибирующая активность обусловлена синтезом 192 нуклеотидов, кодирующих первые 64 N-концевых аминокислоты в зрелой HRP.
Ortlepp с соавторами [6] сконструировали три вектора на основе pUC18, позволяющих контролировать экспрессию с помощью плаз-мидного lac репрессора, находящегося под контролем tac промотора. Ими установлено, что на уровень экспрессии белка влияют изменения на С-конце. Кроме того, ими был создан вектор для периплазматической экспрессии HRP C1 в клетках E. coli. Успешные результаты были получены путем слияния белка DsbA (disulfide bond, тиолдисульфид-оксидоредуктазы) с N-концевым пептидом HRP. Однако такой гибридный белок HRP-DsbA демонстрировал пониженную катали-
тическую активность и нестабильность, эту проблему, как предполагают авторы, можно решить путем посттрансляционного удаления DsbA. Несмотря на вполне успешные попытки секреции белка в периплазме клеток, большое количество рекомбинантного HRP C1 все равно обнаруживалось в тельцах включения [8].
Ряд исследований по продукции рекомби-нантной HRP C1 был выполнены в эукарио-тических системах экспрессии. Для трансформации в P. pastoris использовали векторы pPICZa, содержащие последовательность, кодирующую a-фактор S. cerevisiae — сигнал секреции метанол-индуцируемого промотора P ; ген устойчивости к антибиотику зеоцину для селекции как в E. coli, так и в Pichia; последовательность, кодирующую C-концевой пептид, содержащий полиги-стидиновую метку для упрощения процесса очистки рекомбинантного белка [8]. Установлено, что мутация Asn175Ser приводила к увеличению термической стабильности, благодаря дополнительным водородным связям, вызывающим стабилизацию гемовой части фермента. В P pastoris также была продемонстрирована возможность продукции HRP с Fab-фрагментами (fatty acid binding protein), обеспечивающими устойчивость к атразину, что придавало HRP антигенсвязывающие свойства. Система экспрессии для получения рекомбинантной HRP с Fab-фрагментами антител также была разработана на основе вектора pPICZa [10].
Кроме того, ген hrpCl был клонирован в дрожжевой секретирующий вектор pYEX-S. Экспрессия гена находилась под контролем конструктивного промотора гена фосфоглице-раткиназы. Вектор также содержал ген ампициллин-резистентности из E.coli и дрожжевые селективные маркеры. Перенос гена hrpCl осуществляли в S. cerevisiae. Активность HRP C1 составила 25 ед/л [8].
В 1992 году в клеточных культурах клеток насекомых Sf9 была выделена активно синтезирующаяся HRP С1 [11, 12]. Вектор для экспрессии конструировали на основе плазмид pVL1392 и pGEMT, в которые ген hrp встраивали под контроль вирусного промотора по-лиэдрина.
При экспрессии в растениях томата и табака гена hrpC1, как правило, получается
активный фермент, хотя степень его глико-зилирования может отличаться от нативного белка. Известно, что степень гликозилиро-вания фермента, синтезируемого трансгенными томатами значительно ниже, чем HRP. Уменьшение степени гликозилирова-ния снижает стабильность фермента. Кроме того, данный белок является каталитически активным и вызывает увядание растений (как полагают, за счет окисления гормона роста). При выделении рекомбинантной HRP основной проблемой является процесс очистки фермента, а именно, его отделение от полифенольных пигментов, синтезируемых в томатах [3, 13, 14]. Преимуществами использования растительных систем для получения гетерологичных белков являются: правильный фолдинг и процессинг белка, сопоставимый с эукариотической системой экспрессии; незначительные материальные затраты на выращивание растений, что обеспечивает упрощенность производственного процесса и низкую себестоимость получаемого фермента [3, 14].
В работе Matsui с соавторами [13] сообщалось о секреции HRPC1 в клетках трансгенного табака (Nicotiana tabacum). Во-первых, была подтверждена роль СТРР (C-terminal propeptide; С-концевой пропептид) в клетках табака. Если в трансгенных растениях табака ген hrpCl экспрессируется вместе с сигнальным пептидом и СТРР, то наблюдается накопление HRPC1 в вакуолях. Когда hrpCl экспрессируется без ССТР, наблюдается накопление активного фермента в апопластиче-ском пространстве. Во-вторых, было показано увеличение экспрессии hrpCl с помощью энхансеров — 5'-нетранслирующей области (UTR) гена алкогольдегидрогеназы N. tabacum
(NtADH).
Как видно из литературных данных, каждая из описанных в работе систем экспрессии имеет свои преимущества и недостатки. Следует отметить, что высокий уровень экспрессии изофермента С HRP наблюдался в клетках дрожжей [3].
Цель данной работы — сконструировать вектор для экспрессии гена, кодирующего изофермент С2 HRP в клетках мицелиальных грибов. Мицелиальные грибы, синтезирующие гем-содержащие ферменты, как извест-
но, образуют гем в избытке, что позволяет не проводить дополнительной активации HRP, добавляя кофактор или вещества его индуцирующие.
Материалы и методы
Ген, кодирующий изофермент С2 HRP, синтезирован искусственно и предоставлен для работы Eurofins Genomics в составе плазмиды рЕХ-А258-^р. Для анализа на наличие фрагмента гена каталазы (cat) в геномной ДНК использовали мицелиальные грибы РепшШит adametzii, Pénicillium jensenii БИМ F-134, Pénicillium sp. 17, Pénicillium sp. 37, Pénicillium kapuscinski, Pénicillium funiculosum, Pénicillium varians 545, Pénicillium chrysogénum БИМ F-112, Pénicillium chrysogénum БИМ F-32. В работе для клонирования рекомбинантных плазмид использовали Е. coli XL-1 Blue ((F::Tn10(Tetr), proA+B+, lacI« , A(lacZ) M15 / récAl, éndAl, gyrA96(Nalr ), thi-1, hsdR17 (r — mk - ), glnV44, rélAl, lac)). Информация об использованных плазмидах представлена в табл. 1.
Для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовались праймеры («Прайм-тех», Беларусь) (табл. 2, 4). Праймеры были подобраны для выделения гена cat из мице-лиальных грибов рода Pénicillium, экзонных последовательностей фрагментов генов hrpC и для получения линеаризированного гена hrpC2, а также плазмид pK18-cat-pAN7-1 и pAN7-1.
ПЦР проводили с помощью Р/м-полимеразы или Taq ^F-полимеразы («Праймтех», Беларусь), применяя необходимые для их работы буферные растворы того же производителя. Конечный объем смеси составил 50 мкл при использовании Р/м-полимеразы и 20 мкл — для Taq ^F-полимеразы (табл. 3).
Для выделения геномной ДНК из мицелия грибов и корней A. rusticana использовали набор «Нуклеосорб» (комплектация «С») фирмы «Праймтех» (Беларусь) [15]. Выделение проводили по методике производителя. Предварительно грибы рода Pénicillium выращивали в колбах Эрленмейера на качалках в течение 48 часов при температуре 25-27 °C, при постоянном вращении колб со скоростью 180 об/мин в жидкой питательной среде [16].
Таблица 1
Характеристика основных плазмид, используемых в работе
Плазмида Характеристики Источник получения
pJETl.2 AmpR; Т7-промотор; PlacUV-промотор; полилинкер; репликон плазмиды рМВ1; летальный ген есо47Ж; 2974 п.н., используется для клонирования продуктов амплификации с тупыми концами Плазмида получена из коллекции лаборатории «ЦАГИИ» Института микробиологии НАН Беларуси
рАШ-1 Hyg*; Атр*; lac-оператор; промотор и терминатор гена глицеральдегидфос фатдегидрогеназы A. nidulans Любезно предоставлена доктором P. Punt (Wageningen Center for Food Sciences (WCFS), Wageningen, The Netherlands
pK18 Кап*; 1ас-промотор; последовательность, кодирующая ген lacZ; полилинкер в составе 1ас2 гена; Со1Е1-репликон Плазмида получена из коллекции лаборатории «ЦАГИИ» Института микробиологии НАН Беларуси
рЕХ-А258-hrp Атр*; риС оп; 1ас-промотор; 1ас-оператор; последовательность, кодирующая изофермент С2 пероксидазы; 3504 п.о. Плазмида предоставлена компанией Eurofins Genomics, Люксембург
Таблица 2
Характеристика праймеров, использованных в работе
ПЦР-продукт Название праймера Нуклеотидная последовательность праймера в направлении Размер ПЦР-продукта, п. о.
Ген фермента пероксидазы из хрена Armoracia rusticana PIFHRP TGAGCAGACATCACCATGCATTCCTCTTCC 1078
P2RHRP GGTCGGCATCTACTATTCGCTAGCTCTAG
Ген фермента каталазы мицелиальных грибов рода Penicillium fcat2 GATTTCATCTTCCGCCAGAAGATCCA 545
rcat3 CCGTGACCGGCCATTGCCCA
Плазмида pK18-pAN7-1 P3 FpNOM GGAAGAGGAATGCATGGTGATGTCTGCTCA 10035
P4 RpNOM CTAGAGCTAGCGAATAGTAGATGCCGACC
Таблица 3
Состав реакционной смеси для проведения ПЦР
Компонент Объем, мкл Концентрация Объем, мкл
Для Р/м-полимеразы Для Taq HF -полимеразы
ДНК-матрица 1 10 нг/мкл 1-3
Прямой праймер 1,5 20 пМ 1,5
Обратный праймер 1,5 20 пМ 1,5
Буфер (2,5Х) 20 1Х 2
Нуклеотиды (2мМ) -1 - 2
ДНК — полимераза Р/и (2 ед/мкл) 1 1 ед/мкл 3
Вода дистиллированная стерильная 25 - 7-9
Примечание. 1 — нуклеотиды входят в состав буфера
Биомассу гриба отбирали фильтрованием, удаляли культуральную жидкость (супернатант). Затем обрабатывали мицелий ацетоном, просушивали, промывали дистиллированной водой и обрабатывали ультразвуком на установке Sonics Vibra-cell VCX 130 PB (США). Для выделения ДНК бактерий применяли набор фирмы «АртБиотех», Беларусь.
Определение концентрации ДНК осуществляли с помощью флуориметра («Invitrogen», США), используя краситель ZUBR Green-1 («Праймтех», Беларусь) согласно инструкции фирмы-производителя.
Амплификацию проводили с использованием аплификатора T100 Thermal Cycler (производство «Bio-Rad», США). Условия амплификации варьировали в зависимости от используемых полимераз, праймеров и размера получаемого фрагмента ДНК.
Электрофоретический анализ плазмидной ДНК и продуктов амплификации проводили по общепринятым методам, изложенным в руководстве Т. Маниатис и др. [17]. Электрофорез проводили при комнатной температуре в течение 40-80 мин. Для визуализации результатов использовали систему гель-документации ChemiDoc™ MP Imaging System.
Размеры фрагментов ДНК устанавливали на основании их электрофоретической подвиж-
ности в агарозном геле. Для выделения ПЦР-продуктов использовали набор «Нуклеосорб» (комплектация «G») фирмы «Праймтех» (Беларусь) [18].
Выделение плазмидной ДНК из бактериальных клеток E. coli XL-1 Blue проводили методом щелочного лизиса по методике Маниатиса с соавторами [17], адаптированной сотрудниками лаборатории ЦАГИИ Института микробиологии НАН Беларуси.
Эндонуклеазные реакции проводили в объеме 20 мкл с использованием 2 мкл (10Х) соответствующего рестрикционного буфера, 2 мкл ДНК и 2 ед рестрицирующего фермента. Для рестрикционного анализа были использован ферменты «ThermoScientific».
Реакции лигирования проводили в объеме 20 мкл с использованием 10Х лигазного буфера и Т4 ДНК-лигазы. Реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч при температуре 22 °С. После окончания инкубирования проводили очистку лигазной смеси хлороформом. Смесь хранили при температуре -20 °С. При постановке реакций были соблюдены все условия, рекомендуемые производителем в соответствии с общепринятыми экспериментальными протоколами [19].
Сиквенс-анализ проводили по методу Сен-гера с помощью автоматического секвенато-
ра 4300 DNA Analyzer (Li-COR Biosciences). Матрицей для секвенирующей реакции служила плазмидная ДНК pJET1.2-cat. Для проведения секвенирования был использован набор реактивов «DNA Cycle Sequencing Kit» («Jena Bioscience», PCR-401S) и стандартные секвенирующие праймеры к вектору pJET1.2 (pJET-F и pJET-R), меченые флуоресцентной меткой Cy5.5 (Праймтех, Беларусь).
Полученные данные анализировали с помощью компьютерных программ eSeqTM DNA Sequencing Software Version 3.1.10 (LiCOR Biosciences), BLASTN2.2.1 (NCBI сайт: http://www.ncbi.nlm.nih.gov), SnapGene Viewer Version 3.1.2.
Изготовленные векторные конструкции трансформировали в клетки E. coli XL-1 Blue и протопласты P. adametzii методом электро-порации с помощью прибора MicroPulser BIORAD (США). Трансформанты отбирались по устойчивости к селективному агенту и по результатам ПЦР-анализа.
Результаты и их обсуждение
Проведен анализ 5 последовательностей генов, кодирующих изофермент С HRP, представленных в базе данных GenBаnk. Установлено, что все гены hrpC имеют единую
структуру: 4 экзона, 3 интрона. Определена гомология экзонных областей генов hrp, для последующего выделения участков гена hrpC. Показано, что сходство экзонных последовательностей 3' и 5' концов составляет 95-100%. Установлено, что анализируемые последовательности экзонов 1, 2 и 3 различных изоформ обладали наиболее высокой степенью идентичности (99-100%), существенные отличия наблюдались между 5' концевыми последовательностями экзона 4 изоформ С1 и С2, С3. На основании полученных результатов были подобраны праймеры (табл. 4).
Для амплификации использовали геномную ДНК A. rusticana. Нами были получены 4 эк-зонных области данного гена с использованием подобранных праймеров (табл. 4). Результаты проведения полимеразной цепной реакции представлены на рис. 1. Размеры полученных фрагментов соответствовали ожидаемым результатом, а именно, для экзона 1 ~ 230 п. о., для экзона 2 ~ 192 п. о., для экзона 3 ~ 169 п. о., для экзона 4 ~ 470 п. о. Наличие дополнительных фрагментов отмечено только при получении продукта экзона 3, что свидетельствует о специфичности подобранных праймеров, однако не позволяет выделить гены, кодирующие отдельные изоформы HRP.
Таблица 4
Праймеры подобранные на основании анализа нуклеотидных последовательностей экзонов
Изоформа пероксидазы Праймеры Последовательность Температура плавления, °C
Экзон 1
C1, C2, C3 Fex1/3 HRP прямой ATGCATTCCCCTTCTTCTACTTC 53
C1, C2, C3 Rex1/3 HRP обратный ATTAACAAAGCAGTCGTGGAAGTG 54
Экзон 2
C1, C2, C3 Fex2/3 HRP прямой GGTTGTGACGCATCGATCTTG 54
C1, C2, C3 Rex2/3 HRP обратный CAAATTGACAGATTGTTGAGCTGCAA 55
Экзон 3
C1, C2, C3 Fex3/3 HRP прямой GCGGGAGGTCCTTCTTGGA 55
C1, C2, C3 Rex3/3 HRP обратный CGGAGAGAGCAACGAGATCAG 56
Продолжение табл. 4
Изоформа пероксидазы Праймеры Последовательность Температура, °C
Экзон 4
C1 прямой GTGGTCACACATTTGGAAAAAATCA 53
C2, C3 Rex4/3 HRP прямой GGGGCCACACATTTGGTAAAAAT 53
C2, C3 Rex4/3 HRP обратный TCACATAGAGCTAACAAAGTCAAC 52
Для дальнейшей работы ген, кодирующий изоформу С2 HRP, был синтезирован химически Eurofins Genomics и получен в составе плазмиды рEX-A258-hrp (рис. 2).
Как сказано выше, наиболее изучена изо-форма С1 HRP, клонирование кодирующего ее гена было осуществлено в различные штаммы про- и эукариот [3]. Нами для работы был выбран ген ЬтрС2, поскольку в литературе мало сведений о клонировании данного гена. При этом HRP С2 в отличие от HRP С1 характеризуется более высокой скоростью окисления различных фенольных соединений [2, 3], а сходство экзонных участков генов кгрС2 и ИтрС1 составляет 86-91%.
Хотя грибы являются одним из главных объектов, используемых для получения биологически активных метаболитов, векторов для экспрессии генов в клетках мицелиаль-ных грибов сконструировано небольшое количество. Нами была использована конструкция для экспрессии генов в клетках грибов рода Aspergillus pAN7-1, содержащая сильный конститутивный промотор гена глице-ральдегидфосфатдегидрогеназы Aspergillus nidulans (промотор gpd) и любезно предоставленная доктором P. Punt (Wageningen Center for Food Sciences (WCFS), Wageningen, The Netherlands) [20]. Ряд исследователей отмечали, что, поскольку синтезируемые дрожжами и растениями пероксидазы являются каталитически активными, то они могут влиять на рост реципиентов, вызывая снижение количества биомассы дрожжей и увядание растений [9, 21].
Для встраивания гена hrpC2 в ДНК ми-целиальных грибов было решено создать конструкцию, несущую фрагмент гена cat.
Предполагалось, что полученный вектор обеспечит не только встраивание hrpC2 в хромосому, но и позволит инактивировать ген, кодирующий гем-содержащую каталазу. Ка-талаза и пероксидаза являются ферментами антиоксидантной системы и выполняют одну функцию — способствуют распаду пероксида водорода, образованного при окислении различных соединений.
Для выделения фрагмента гена cat P. adametzii использовались праймеры, созданные на основе анализа нуклеотидных последовательностей cat грибов рода Penicillium. В результате про-
Рис. 1. Электрофореграмма фрагментов ДНК, ампли-фицированных на матрице тотальной ДНК, выделенной из A. rusticana
Номера дорожек соответствуют продуктам амплификации экзонов 1-4 гена hrpC согласно порядковому номеру дорожки, 5 — маркер молекулярного веса (GeneRuler™
1°kb°DNA Ladder, «ThermoScientific»)
Zral
AatH
Nsbl
NmeAIII
Bgll 1
CfrlOI
Gsul I
Eamll05I l
Vfj 4,1
Iii
v=>
Sspl
Pfol
Muni
Sail Xmil HincII Ab si
Paul - Ptel - Sgsl
...... BtgZI
Bpil Bsul5I
BbvCI - BpulOI
Van91I
Ecol05I
NotI
PspFl BseYI
Lgul
Рис. 2. Карта плазмиды pEX-A258-hrp, несущей ген hrpC2
веденных экспериментов был выделен фрагмент, размер которого составил около 600 п. о. (рис. 3, дорожка 2), что полностью соответствует ожидаемому результату.
ПЦР-продукт был встроен в плазмидный вектор pJET1.2 для последующего определения нуклеотидной последовательности фрагмента cat P. adametzii. На основании сиквенс-анализа установлено, что фрагмент cat P. adametzii, имеющий размер 568 п. о., на 81-97% идентичен участкам cat грибов P. chrysogenum Wisconsin 54-1255, P. digitatum Pd1, P. citrinum, P. marneffei ATCC 18224 (депонированных в GenBank NCBI (AM920431.1, XM_014675429.1, DQ288844.1, XM_002153565.1, соответственно).
В дальнейшем фрагмент с целевой последовательностью ДНК cat P. adametzii (размер вырезанного по BamHI участка из вектора pJET1.2-cat составлял 615 п. о.) клонировали в плазмиду pK18 (предварительно также обработанную рестрицирующим ферментом BamHI) (рис. 4, дорожка 2). Размер полученной плазмиды рК^-cat составил 2661 п. о.
Для выбора штаммов потенциальных реципиентов был проведен ПЦР-скрининг на наличие фрагмента гена cat для последующей его инактивации путем встройки экспрессируемого гена пероксида-зы. Для этого использованы 9 штаммов мицелиальных грибов Penicillium, синтезирующих гем-содержащие фермен-
Рис. 3. Электрофореграмма амплифицированного фрагмента ДНК гена cat P. adametzii\
1 — маркер молекулярного веса Long Range DNA Ladder (100bp-10kb) производства «Jena bioscience»; 2 — продукт амплификации cat P. adametzii)
ты (P. adametzii, P. jensenii БИМ F-134, Penicillium sp. 17, Penicillium sp. 37, P. kapuscinski, P. funiculosum, P. varians 545, P. chrysogenum БИМ F-112, P. chrysogenum БИМ F-32). Согласно полученным ранее сотрудниками лаборатории ферментов данным эти штаммы продуцировали марганец-пероксидазы и каталазы [21]. Установлено, что из 9 штаммов грибов рода Penicillium, характеризующихся повышенным уровнем гем-содержащих ферментов, 4 (P. adametzii P. kapuscinski, P. chrysogenum БИМ F-112, P. chrysogenum БИМ F-32) имеют аналогичный фрагмент и в дальнейшем могут использоваться в качестве реципиентных штаммов для трансформации векторной конструкции. В дальнейшем плазмиды рК18-саt и pAN7-1 были лианеризованы по HindIII и лигирова-ны друг с другом. Таким образом, была получена плазмида рК18-саt-AN7-1 10031 п. о.
Рис. 4. Электрофореграмма плазмиды pK18
1 — маркер молекулярного веса GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder («ThermoScientific»); 2 — плазмида pK18, разрезанная по сайту рестрикции BamHI; 3 — исходная плазмида pK18
Ген hrpC2 предполагалось встраивать вместо гена устойчивости к гигромицину.
Наличие в гене пероксидазы хрена и в экспрессионных плазмидах сайтов, подверженных воздействию наиболее часто встречающихся рестрицирующих ферментов не позволило использовать данный метод для конструирования экспрессионной плазмиды. Для этого применялся метод продолжительной перекрывающейся полимеразной цепной реакции (пп-ПЦР) [22]. На первом этапе ген hrpC2 был выделен из рEX-A258-hrp методом ПЦР с использованием P/u-полимеразы и олигону-клеотидных праймеров P1 FHRP и P2 RHRP, имеющих на концах последовательности, комплементарные плазмиде рК18-саt-AN7-1. В результате был получен фрагмент, несущий hrpC2, размером ~1100 п. о. (рис. 5А).
На втором этапе линеаризовали вектор рК18-саt-AN7-1 методом ПЦР с использова-
ABB
12 М 345М 6 7 М
Рис. 5. Электрофореграммы продуктов амплификации при проведении клонирования гена hrpC2 методом пп-ПЦР
А — первый этап клонирования гена hrpC2 (температуры отжига 52 (1), 58 °С (2)); Б — амплификат линеаризованного вектора рК18-са^А^-1 (температура отжига: 45 (3), 50 (4), 55 °С (5)); В — амплификат вектора рК18-са^А^-1 с геном hrpC2 (температура отжига: 50 (6), 55 °С (7)), М — маркер молекулярного веса (GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder, «ThermoScientific»)
нием Р/и-полимеразы и олигонуклеотидных праймеров Р3 FpNOM и Р4 ЯрЫОМ, содержащих фрагменты, комплементарные последовательности гена ЫрС2. В результате был получен фрагмент, несущий вектор без гена устойчивости к гигромицину, размером ~9000 п. о. (рис. 5Б). Каждый этап контролировали при помощи агарозного гель-электрофореза. Продукты амплификации очищали из реакционной смеси переосаждением ацетатом аммония и изопропиловым спиртом. На третьем этапе собирали линеаризованный вектор и целевой ген методом пп-ПЦР по следующей программе: цикл этапов предденатурации 30 с при 98 °С; элонгации 3 мин при 72 °С и последующая стандартная процедура ам-плификации. В результате была получена плазмида, обозначенная как рК18-са^АШ-1-НКР размером более 10000 п. о. (рис. 5В).
В дальнейшем была проведена котрансфор-мация рК18-са^АШ-1-НКР и рАШ-1 в клетки Р. adametzii. Трансформанты отбирали по устойчивости к гигромицину, ген устойчивости к данному антибиотику находился на плазмиде рАШ-1. Было получено 16 трансформантов, у 2 из которых вставка гена НгрС2 подтверждена с использованием ПЦР-анализа (рис. 6).
1 2 3 4 5 6
Рис. 6. Электрофореграмма ПЦР-продуктов ДНК трансформантов P. adametzii
1-5 — трансформанты P. adametzii, 6 — маркер молекулярного веса (GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder, «ThermoScientific»)
Заключение
Таким образом, проведен анализ нуклео-тидных последовательностей генов, кодирующих изофермент С HRP, представленных в базе данных GenBаnk. Установлено, все гены hrpC имеют единую структуру: 4 экзона, 3 интрона. Показано, что сходство экзонных последовательностей 3' и 5' концов составляет 95-100 %. Проведен анализ геномной ДНК грибов рода РетсШшт. Отобраны 4 штамма мицелиальных грибов (P. adametzii, P. kapuscinski, P. chrysogenum БИМ F-112, P chrysogenum БИМ F-32), как потенциальные реципиенты для векторных конструкций с генами пероксидазы и фрагментом гена cat, необходимым для встраивания конструкции в геномную ДНК. На основе синтезированной последовательности hrpC2 и плазмид: рЕХ-A258-hrp, несущей ген hrpC2, рК18-са^ несущей фрагмент гена cat P. adametzii для обеспечения встройки плазмиды в геномную ДНК, и pAN7-1, имевшей в своем составе промотор и терминатор гена глицеральдегидфосфатдеги-дрогеназы A. nidulans для экспрессии hrpC2, сконструирован вектор для экспрессии гена пероксидазы хрена изофермента С2 в клетках мицелиальных грибов. Проведена его трансформация в P. adametzii. Наличие вставки гена подтверждено ПЦР-анализом.
Список использованных источников
1. Варфоломеев, С.Д. Химическая энзимология / С.Д. Варфоломеев. - Высшее профессиональное образование: учебник. -М., 2005. - С. 214-456.
2. Horseradish Peroxidase / N. С. Veitch [et al.] // Advances in Inorganic Chemistry. - 2000. Vol. 51. - P. 1-56.
3. An updated view on horseradish peroxidases: recombinant production and biotech-nological applications / F.W. Krainer [et al.] // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2015. - Vol. 99, № 4. - P. 1611-1625.
4. Вяткина, О.В. Проблемы выделения и очистки растительных пероксидаз / О.В. Вяткина // Уч. записки Таврич. нац. ун-та. Сер. Биология. Химия. - 2012. - №3. - С. 271-273.
5. Peroxidase gene discovery from the horseradish transcriptome / L. Naatsaari [et al.] // BMC Genomics. - 2014. - Vol. 15. - P. 1-16.
6. Expression and characterisation of a protein specified by a synthetic horseradish peroxidase gene in Escherichia coli / S. A. Ortlepp [et al.] // Journal of Biotechnology. - 1989. - Vol. 11. - P. 353-364.
7. Expression of a neutral horseradish peroxidase in Escherichia coli / E. Bartonek-Roxа [et al.] // Journal of Biotechnology. - 1994. - Vol. 37. - P. 133-142.
8. Gundinger, T. A comparative approach to recombinantly produce the plant enzyme horseradish peroxidase in Escherichia coli / T. Gundinger, O. Spadiut // Journal of Biotechnology. - 2017. - Vol. 248. - P. 15-24.
9. Functional expression of horseradish per-oxidase in Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris / B. Morawski [et al.] // Protein Eng. -2000. - Vol. 13, № 5. - P. 377-384.
10. Studies on the transformation of intact yeast cells by the LiAc/SS-DNA/PEG procedure / R.D. Gietz [et al.] // Yeast. - 1995. - Vol. 11, № 4. - P. 355-360.
11. Baculovirus Expression and Characterization of Catalytically Active Horseradish Peroxidase / C. Hartmann [et al.] // Archives of Biochemistry and Biophysics. - 1992. - Vol. 297. - P. 61-72.
12. Genetically engineered horseradish peroxidase for facilitated purification from baculovirus cultures by cation-exchange chromatography / G. Levin [et al.] // J. Biotechnol. - 2005. - Vol. 118, № 4. - P. 363-369.
13. High-efficiency secretory production of per-oxidase C1a using vesicular transport engineering in transgenic tobacco / T. Matsui [et al.] // J. Biosci. Bioeng. - 2006. - Vol. 102, № 2. - P. 102-109.
14. Transient Expression and Purification of Horseradish Peroxidase C in Nicotiana ben-thamiana /Suzanne M. Huddy [et al.] //International Journal of Molecular Sciences. - 2018. -Vol. 19, № 115. - P. 1-13.
15. Инструкция на набор по выделению ДНК «Нуклеосорб». - Минск. - С. 9-10.
16. Михайлова, Р.В., Жуковская Л.А., Лобанок А.Г. Изучение спонтанной изменчивости Penicillium adametzii ЛФ F-2044 - продуцента глюкозооксидазы // Прикладная биохимия и микробиология. -2007. - Т. 43, № 2. - С. 209-211.
17. Инструкция на набор по выделению ДНК «Нуклеосорб». - Минск. - С. 11.
18. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии: молекулярное клонирование /
Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. - М. : Мир, 1984. - 480 c.
19. Великов, В.А. Молекулярная биология. Практическое руководство: учеб. пособие / В.А. Великов. - Саратов: Саратовский источник, 2013. - 84 с.
20. Verdoes, J.C. Molecular genetic strain improvement for the overproduction of fungal proteins by filamentous fungi / J.C. Verdoes, P. J. Punt, C.A. van den Hondel // Appl. Microbiol. and Biotechnol. - 1995. - Vol. 43. - P. 195-205.
21. Поиск штаммов мицелиальных грибов -
продуцентов гем-содержащих ферментов / Т.В. Семашко [и др.] // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты : Сборник научных трудов. - Минск: Беларуская навука, 2017. -Т. 9. - С. 115-130.
22. Рымко, А.Н. Создание штамма Escherichia coli - продуцента гомо-логичной нуклеозиддифосфаткиназы / А.Н. Рымко, С.В. Квач, А.И. Зинченко // Молодежь в науке - 2013: приложение к журналу «Весщ НАН Беларуа», сер. б1ял. навук. - 2013. - № 5. - С. 135-138.
^V. Semashko, A.I. Gorina, E.A. Martynava, L.N. Valentovich, L.A. Zhukovskaya, A.G. Lobanok
OBTAINING A VECTOR CONSTRUCTION FOR EXPRESSION OF THE PEROXIDASE ISOENZYME С2 GENE FROM HORSERADISH ROOTS IN FILAMENTOUS FUNGAL CELLS
Institute of Microbiology, NASB Minsk, 220141, the Republic of Belarus
The nucleotide sequences of isoenzymes C horseradish peroxidase genes of group presented in the GenBank database were analyzed. The vector for the expression of the horseradish peroxidase gene of the C2 isoenzyme was constructed for mycelial fungi cells using synthesized gene sequence and some plasmids: pK18-cat, carrying the fragment of the Pénicillium adametzii catalase gene for plasmid insertion into genomic DNA, and pAN7-1, which contains the promoter and terminator of the Aspergillus nidulans glyceraldehyde phosphate dehydrogenase gene for hrpC2 expression.
Key words: horseradish peroxidase gene, isozyme C2, expression vectors, Pénicillium fungi.
Дата поступления статьи: 10 сентября 2018 г.
