CC BY
42
Биомедицина • № 1, 2016, С. 4-17
НОВЫЕ БИОМЕДИЦИНСКИЕ ТЕХНОЛОГИИ
Молекулярно-генетические аспекты технологии получения трансгенных мышей с интегрированными генами N-ацетилтрансферазы (NAT1 и NAT2) человека
В.Н. Каркищенко1, В.П. Рябых2, H.H. Каркищенко1, М.С. Дуля1, В.А. Езерский2, Е.М. Колоскова2, В.Н. Лазарев1, С.В. Максименко2, Н.В. Петрова1, В.Н. Столярова2, Т.П. Трубицина2
1 - ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий ФМБА России», Московская область
2 - ФГБНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии, биохимии и питания животных», Калужская область
Контактная информация: д.м.н. КаркищенкоВладиславНиколаевич, vladl672@ya.ru
В ходе работы были созданы ДНК-конструкции, включающие нуклеотидные последовательности генов NAT1 и NAT2 человека и промоторно-энхансерную область гена альбумина мыши. Кодирующие части генов NAT1 и NAT2 были амплифицированы с матрицы геномной ДНК человека с использованием олигонуклеотидов NATl-Not и NATl-Xho в случае NAT1 и NAT2-Not и NAT2-Xho - в случае NAT2. Плазмиды pSI-NATl и pSI-NAT2 расщепляли эндонуклеазами BamHI и EcoRV (сайт рестрикции EcoRV был введен в олигонуклеотид enAlb-F).
Параллельно осуществлялся синтез олигонуклеотидных праймеров и детекция экспрессии генов у людей и создаваемых трансгенных животных с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров.
На следующих этапах осуществлялось выделение ДНК/РНК из пробы плазмы крови, амплификация геномной ДНК, идентификация ПЦР-продуктов методом горизонтального электрофореза. Наличие в геле полоски ДНК соответствующего размера свидетельствовало о наличии в образце искомого гена.
Получены трансгенные мыши (F0) с интегрированными в их геном конструкциями, включающими нуклеотидные последовательности генов NAT1 и NAT2 человека под промотором гена альбумина мыши. Общая эффективность трансгеноза составила для гена NAT1 - l,l% и для NAT2 - 0,6%. Анализ интеграции трансгенов в различных органах и тканях у потомков (Fl) первичных трансгенных мышей (F0) показал, что встраивание генов NAT1 и NAT2 человека произошло во все три зародышевых листка.
Ключевые слова: ДНК-конструкции генов NAT1 и NAT2, промоторно-энхансерная область гена, плазмиды, высокоспецифичные праймеры, детекция экспрессии генов, амплификация, трансгеноз.
Введение генетических и эпигенетических меха-
Ацетилирование в живых системах низмов, который, наряду с процессом является фундаментальным процессом метилирования, обеспечивает стабиль-
ность и оптимальное функционирование геномов. Огромное количество лекарственных препаратов и ксенобиотиков участвует в гистоновых модификациях через вовлечение ацетильных групп и ацетилирование, которые, не влияя на исходную последовательность генов, существенно изменяют их экспрессию.
Несмотря на важную роль в метаболизме экологических и синтетических химических веществ, ферменты, метаболизирующие ксенобиотики, первоначально развивались, чтобы катализировать реакции эндогенного метаболизма [15]. Например, фаза I ферментов CYP450, как известно, действуют при широком диапазоне эндогенных субстратов, в т.ч. стероидов, жирных кислот, желчных кислот, простагландинов, лейкотриенов, ретиноидов и биогенных аминов [16, 20]. II фаза сульфотрансфе-раз и UDP-глукуроносультрансфераз также играют ключевую роль в эндогенном метаболизме стероидов и билирубина [9,11].
Дальнейший прогресс в направленном поиске лекарств определяется наличием адекватных биологических моделей в виде трансгенных или гуманизированных животных, несущих гены человека. Эндогенная роль человеческой NAT1 и ее мышиного гомолога NAT2 далее поддерживается повсеместной экспрессией двух изоферментов и тем, что они представлены в зародыше и ранних стадиях преимплантационных эмбрионов на протяжении всего развития. Работы прошлых лет с конгенными и рекомбинантными инбредными линиями подразумевали генетическую связь между фенотипами медленных ацети-ляторов и высокой чувствительностью
к тератогенно-индуцированному орофа-циальному расщеплению [12, 13], в то время как последние исследования показывают взаимодействие человеческой NAT1 с транскрипцией фактора внутри клеточного ядра [6, 10].
В качестве средства, исследующего постулат эндогенной роли NAT, ученые предприняли попытку получения трансгенных мышей, лишенных или сверх-экспрессирующих NAT-изоферменты. Первые сообщения в литературе свидетельствуют о том, что NAT-ограни-ченные, NAT'2-нокаутные [8] или NAT1/ NAT2-нокаутные [19], мыши нормально развиваются и не страдают никакими очевидными фенотипическими дефектами. Корниш и др. [6] подтвердили, что уровни активности гена NAT2 строго дозозависимые, р-ABA N-ацетилирова-ние у мышей NAT2 (+/+) примерно в два раза выше, чем у гетерозигот NAT2 (+/-). P-ABA-ацетилирования не наблюдалось у гомозиготных «нулевых» мышей NAT2 (-/-), предполагая, что дефицит не компенсируется другими ферментами метаболизма ксенобиотиков.
Этот эффект «ген-доза» также отражается на уровнях иммунореактивности белка NAT2, обнаруженного в печени мышей NAT2 (+/+), NAT2 (+/-) и NAT2 (-/-) линий. Также стало возможным контролировать тканеспецифичную экспрессию NAT2 при помощи X-Gal-окрашивания нокаутных эмбрионов, т.к. кассета, используемая для прижигания NAT2 ORF, также содержит ген LacZ транскрипции, связанный с эндогенным NAT2-промотором через внутренний рибосомный сайт вступления (IRES).
Sugamori и др. [18] сделали еще один шаг вперед, нокаутировав гены NAT1 и NAT2 у мышей. Полное отсутствие ген-
ных продуктов было подтверждено с помощью полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и анализа ферментативной активности. Было показано, что гомозиготные NAT1/ NAT2 (-/-) мыши «подрывают» возможность метаболизировать лекарственные средства в силу отсутствия N-ацетили-рованных производных п-AS и СМЗ в плазме NAT1/NAT2-дефицитных мышей.
Получение NATi-нокаутных линий также было недавно проведено Sugamori и соавт. [16]. Эта линия является фено-типически нормальной и имеет ту же ариламинметаболизирующую способность, как и у дикого типа. Сверхэкспрессия NAT3 случайно индуцируется у двойного нокаута NAT1/NAT2, как результат присутствия сильных элементов промотора в абляции кассеты, не имеющего никакого фенотипического воздействия.
Исследователи также попытались воспроизвести сверхэкспрессию NAT2-подобного белка у трансгенных мышей. Sim и др. [17] сообщают о грубых нарушениях, ведущих к смерти химерных эмбрионов мышей с избыточной экспрессией человеческой NAT1. Другие исследования обнаружили нормальное развитие мышей, несущих тот же транс-ген, но сообщают только о скромной (или об отсутствии увеличения) ферментативной активности, даже на сроках, где количество копий гена человеческой NAT1 является высоким [7]. Различные вариации методик, используемых для генерации трансгенных линий, могут объяснить противоречивые результаты двух исследований.
В целом, исследование трансгенных моделей для NAT позволяет предполо-
жить, что изоферменты не участвуют в решающей эндогенной функции организма. Это не абсолютно неожиданное открытие, поскольку в литературе есть несколько примеров фенотипически нормальных нокаутных мышей, которые испытывают дефицит ферментов фазы I и II метаболизма ксенобиотиков [3]. Тем не менее, эти мыши по-разному реагируют на применение канцерогенов, и их способности метаболизировать препараты могут быть также нарушены.
Предварительное исследование трансгенных мышей с гиперэкспрессией человеческого МАТ2-изофермен-та в простате не выявило какого-либо влияния на локальную скорость биоактивации предканцерогенов, таких как РЫР [14]. Тем не менее, необходимы дальнейшие детальные исследования, чтобы определить, как МАТ-дефицит или избыточная экспрессия могут модулировать восприимчивость к химической токсичности и раку. С этой целью МАТ-нокаутные и трансгенные линии, доступные для научного сообщества, будут очень полезны.
Молекулярно-генетические аспекты получения трансгенных мышей основываются на генно-инженерных технологиях, к которым относятся:
- получение нуклеотидных последовательностей структурного гена, кодирующего тот или иной признак;
- получение нуклеотидных последовательностей регуляторных участков гена (промоторов, энхансеров и др.);
- создание генно-инженерных конструкций;
- анализ интеграции трансгена у эмбрионов и животных, полученных из зигот, микроинъецированных генно-инженерными конструкциями.
Цель работы - создание генетических конструкций с генами NAT1 и NAT2 человека и животных, несущих гены NAT.
Материалы и методы
Создание генетической конструкции с генами NAT1 и NAT2 человека
Кодирующие части генов NAT1 и NAT2 были амнлифицированы с матрицы геномной ДНК человека с иснользованием олигонуклеотидов NATl-Not и NATl-Xho в случае NAT1 и NAT2-Not и NAT2-Xho - в случае NAT2. Плазмиды pSI-NATl и pSI-NAT2 расщенляли эндонуклеазами BamHI и EcoRV (сайт рестрикции EcoRV был введен в олигонуклеотид enAlb-F).
ПЦР нроводили с иснользованием ДНК-нолимеразы Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (Thermo Scientific) в соответствии с рекомендациями нроизво-дителя. Полученный нродукт очищали нутем нренаративного электрофореза в агарозном геле и выделяли с номо-щью набора Gene JET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific).
Пренаративное выделение нлазмид-ной ДНК нроводили с иснользованием набора Jet Star Plasmid Purification Maxi Kit (Genomed, Германия) согласно инструкции фирмы-нроизводителя.
Продукты реакции разделяли с но-мощью электрофореза в агарозном геле. Полосу, соответствующую но нодвижно-сти ДНК-фрагменту размером 3,5 кБ, вырезали и выделяли из геля с номощью набора Gene JET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific). Концентрацию ДНК в конечном растворе онределяли но онтической нлотности нри длине волны 260 нм.
Правильность структуры нлазмид нроверяли нутем секвенирования но Сэнгеру с иснользованием олигонукле-
отидов pSI-F и pSI-R на капиллярном автоматическом секвенаторе.
ПЦР-анализ интеграции трансгенов в геном животных
Определение интеграции трансгена у потомства мышей, полученного из зигот, микроинъецированных генно-инженерной конструкцией, проводили с использованием ПЦР-амплификации.
Выделение геномной ДНК из тканей проводили по методу Блина и Стаффорда [4] с некоторыми модификациями.
ДНК из лизата выделяли гуанидино-вым методом: сорбцией на стекле в высокосолевом растворе, с последующими несколькими промывками Трис-спирто-вым (80%) буфером, испарением спирта и растворением ДНК, сорбированной на стекле, в ТЕ-буфере.
Для определения интеграции генно-инженерной конструкции в геном мыши использовали метод ПЦР с применением следующих пар праймеров:
для обнаружения конструкции Alb-NATl брали пару - prAlb-F (прямой) и NATl-Not (обратный);
для обнаружения конструкции Alb-NAT2 брали пару - prAlb-F (прямой) и NAT2-Not (обратный).
В обоих случаях величина амплифи-ката составляла 1504 пары нуклеоти-дов (п.н.).
Нуклеотидные последовательности используемых праймеров:
prAlb-F: GAC CCA TGG GGC ATG CTT CCA TGC CAA G - 5'-концевой на промотор (28 п.н.);
NATl-Not: GAA GCG GCC GCC TAA ATA GTA AAA AAT CTA TCA CCA З'-концевой наNAT1 (36 п.н.);
NAT2-Not: GAA GCG GCC GCC TAA ATA GTA AGG GAA CCA TCA C -З'-концевой наNAT2 (34 п.н.).
Электрофорез проводили в 0,8% ага-розном геле в 0,5хТВЕ. В каждую лунку вносили по 18-20 мкл ПЦР-смеси (окрашенная водная фаза) для ДНК из образцов тканей мышей или 6-10 мкл положительного контроля.
Для оценки размера амплификата одна из дорожек агарозного геля выделялась для ДНК-маркера (100-10000 п.н., Fermentas).
Результаты и их обсуждение Создание генно-инженерных конструкций, включающих нуклеотид-ные последовательности генов NAT1 и NAT2 человека
Плазмиды, содержащие участки ДНК, кодирующие NAT1 и NAT2, под контролем промотора мышиного гена альбумина, были получены в три этапа, на основе плазмиды pSI (Promega). На первом этапе из плазмиды был удален промотор-ный участок и заменен на промотор мы-
шиного гена альбумина. На втором этапе в плазмиду ввели энхансерный участок мышиного гена альбумина. На последнем этапе в полученный вектор вводили кодирующие участки для белков NAT1 и NAT2. Поэтапное конструирование регу-ляторной области объясняется тем, что в мышином геноме промотор и энхансер гена альбумина физически удалены на большое расстояние (около 8 кБ).
Участки ДНК, соответствующие промотору и энхансеру мышиного гена альбумина, были получены с помощью ПЦР. В качестве матрицы использовалась ДНК мыши. Для амплификации энхансерного участка применяли оли-гонуклеотиды enAlb-F и enAlb-R с введенными сайтами рестрикции BamHI и Ncol соответственно. Для амплификации промоторного участка применяли олигонуклеотиды prAlb-F и prAlb-R с введенными сайтами рестрикции Ncol и HindIII соответственно (табл. 1).
Таблица 1
Структура олигонуклеотидов
Название Структура 5'->3'
enAlb-F TGGATCCGATATCTAGCTTCCTTAGCATGACGTTC
enAlb-R ATACCATGGGTCCCAAGCTGGAGAACGA
prAlb-F GACCCATGGGGCATGCTTCCATGCCAAG
prAlb-R AATCAAGCTTGGGGTTGATAGGAAAGGTGATC
NAT1-Not GAAGCGGCCGCCTAAATAGTAAAAAATCTATCACCA
NAT1-Xho AGCCTCGAGATGGACATTGAAGCATATCTTG
NAT2-Not GAAGCGGCCGCCTAAATAGTAAGGGAACCATCAC
NAT2-Xho AGCCTCGAGATGGACATTGAAGCATATTTTG
pSI-F GTTTCGCCACCTCTGACTTG
pSI-R TCACTGCATTCTAGTTGTGGT
pSI-int CCTATTGGTCTTACTGACATC
en-s1 GTGTCTCCTGCTCTGTCAG
en-s2 AGCAGATCTCTGAGTTCAAGA
Рис. 1. Картаплазмидыр81-ргЕпЬА1Ь.
На следующем этапе плазмиду р$1-ргА1Ь (рис. 1) обрабатывали эн-донуклеазами BgШ и №о1. Фрагмент ДНК, соответствующий энхансерной области гена альбумина, расщепляли с помощью эндонуклеаз ВатН1 и №о1. Продукты расщепления объединяли и подвергали действию Т4-ДНК-лигазы.
Дальнейшие операции по трансформации, отбору целевых клонов и получению плазмидной ДНК проводились по аналогии с вышеописанным. При секвенировании использовали олиго-нуклеотиды pSI-F, pSI-R, епА1Ь-Я, еп-в1 и еп-в2. В результате была получена плазмида pSI-рrEnhА1b.
Рис. 2. Карта плазмиды pSI-NATl.
Кодирующие части генов NAT1 и NAT2 были амплифицированы с матрицы геномной ДНК человека с использованием олигонуклеотидов NATl-Not и NATl-Xho в случае NAT1 и NAT2-Not и NAT2-Xho - в случае NAT2. Полученные ДНК-фрагменты обрабатывали эндону-клеазами Notl и Xhol и объединяли путем
дотирования с плазмидой pSI-prEnhAlb, расщепленной теми же ферментами. Дальнейшие операции проводили аналогично. Для ПЦР-анализа бактериальных колоний и секвенирования использовали олигонуклеотиды pSI-R и pSI-int. В результате получены плазмиды р81-КАТ1 (рис. 2) и р8ШАТ2 (рис. 3).
Рис. 3. Схема получения конструкции NAT2 под альбуминовым промотором.
ПЦР-анализ интеграции транс- произошло во все исследуемые органы
генов в органах и тканях потомков (рис. 4-6), а, следовательно, интегра-
трансгенных мышей показал, что ция трансгенов у первичных животных
встраивание трансгенов у потомков ^0) произошла во все три зародышевых
первичных трансгенных мышей ^1) листка.
Рис. 4. Электрофореграммы продуктов ПЦР-амплификации ДНК, выделенной из хвостов мышей (Б0), полученных в результате микроинъекции конструкций А1Ь-КАТ2 (А) и А1Ь-КАТ1 (Б). Амплификаты размером 15ОО п.н. ограничены праймерами ргА1Ь-Б-КАТ2 и ргАШ-Б-ЫАП. 0,8% агарозный гель с О,5хТБЕ. Обозначения: А: 1-6 - образцы №№ 1-6; Б: 1-13 - образцы №№ 7-19; 7 (А), 14 (Б) - вода (отрицательный контроль); 8 (А), 15 (Б) - маркеры размеров ДНК; 9 (А), 16 (Б) - положительный контроль (К+, конструкция А1Ь-КАТ2 (1), 0,001 пг/мкл); 10 (А) -контроль ингибирования (К+, образец ДНК кролика). Мыши №№ 2 и 17 (дорожки 2А и 11Б соответственно) - трансгенные.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
3000 ПН
-1500 пн
1000 пн
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
- 3000 пн
-1500 пн
—1000 пн
Рис. 5. Электрофореграммы продуктов ПЦР-амплификации ДНК, выделенной из хвостов мышей, потомков (F1) трансгенных основателей линий с генами человека: NAT1 (А) и NAT2 (Б). Амплификаты размером 1500 п.н. ограничены праймерами prAlb-F-NAT1 и prAlb-F-NAT3. 0,8% агарозный гель с 0,5хТБЕ.
Обозначения: А: 1-12 - образцы №№ 1-12; Б: 1-14 - образцы №№ 13-25; 13 (А) - вода (отрицательный контроль); 14 (А), 15 (Б) - маркеры размеров ДНК; 15 (А), 16 (Б) - положительный контроль (К+, мышь № 17 (А), мышь № 49 (Б) - F0). Мыши №№ 2 и!7 (дорожки 2А и 11Б) - трансгенные.
Рис. 6. Электрофореграммы продуктов ПЦР-амплификации ДНК, выделенной из органов и тканей мышей, трансгенных по N-ацетилтрансферазе-! {NATI) и №ацетилтрансферазе-2 (NAT2) человека {снимки А и Б соответственно). Амплификаты ограничены праймерами Alb-NATl {2) (содержат фрагменты последовательности промотора гена альбумина мыши и гена N-ацетилтрансферазы человека), общий размер амплификата - 1500 п.н. 0,8% ага-розный гель с 0,5хТБЕ.
Обозначения: 1,2- левый и правый яичники; 3 - матка; 4 - мышцы; 5 - кишечник; 6 - почка; 7 - печень; 8 - селезенка; 9 - желудок; 10 - отрицательный контроль (нетрансгенная мышь, хвост); 11 - сердце; 12 - тимус; 13 - вода; 14 - маркер размеров ДНК; 15 - положительный контроль (хвост трансгенной по NATI (2) мыши, ранее тестированной как содержащей трансген); 16 - контроль ингибирования (К+, один из образцов 1-9).
Эффективность получения гуманизированных трансгенных мышей с интегрированными конструкциями МЛТ1кот и МЛТ2кот человека
Анализ методом ПЦР интеграции трансгена в геном рождённого потомства (табл. 2) показал, что из 66-ти мышат, полученных из зигот, микроинъ-ецированных конструкцией ЫЛТ1Нот, у пяти была обнаружена интеграция трансгена, что составило 7,6% от чи-
сла рождённых животных. Тогда как из зигот, микроинъецированных конструкцией ЫЛТ2Нот, из 118-ти рождённых мышат интеграция трансгена была обнаружена только у трех потомков, что составило 2,5% от числа рождённых животных. Причина сравнительно низкого выхода трансгенных мышей с интегрированной конструкцией ЫЛТ2Нот требует дальнейшего выяснения.
Таблица 2
№ группы Конструкция Число трансплан-тир. эмбрионов Родилось потомков Общая эффективность трансгеноза (%)
всего из них трансгенных
N N % от числа рождённых
I NATIhom 434 66 5 7,6 1,1
II NAT2hom 488 118 3 2,5 0,6
Эффективность получения гуманизированных трансгенных мышей с интегрированными конструкциями NATlhom и NAT2hom человека
Общая эффективность технологии получения трансгенных мышей с интегрированными генами NATlhom и NAT2hom, т.е. отношение количества полученных трансгенных животных к числу трансплантированных эмбрионов, микроинъецированных генной конструкцией, составила l,l и 0,6%, что соответствует среднему стандартному международному уровню (табл. 2).
Заключение
Нами созданы ДНК-конструкции NATl и NAT2, включавшие выделение плазмидной ДНК, удаление из клеток E. coli промоторного участка с его заменой на промотор мышиного гена альбумина. Плазмиду pSI-prAlb обрабатывали эндонуклеазами до получения плазмиды pSI-prEnhAlb. Кодирующие части генов NATl и NAT2 были амплифицированы с матрицы геномной ДНК человека с использованием олигонуклеотидов NATl-Not и NATl-Xho в случае NATl и NAT2-Not и NAT2-Xho - в случае NAT2. Плазмиды pSI-NATl и pSI-NAT2 расщепляли эндонуклеазами BamHI и EcoRV (сайт рестрикции EcoRV был введен в олиго-нуклеотид enAlb-F). Продукты реакции разделяли с помощью электрофореза в агарозном геле. Полосу, соответствующую по подвижности ДНК-фрагменту размером 3,5 кБ, вырезали и выделяли из геля с помощью набора Gene JET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific). Концентрацию ДНК в конечном растворе определяли по оптической плотности при длине волны 260 нм.
Микроинъекции генно-инженерных конструкций вводили в пронукле-усы зигот гибридных мышей. С целью проведения трансплантации ДНК-конструкций ЫЛТ1 и ЫЛТ2 были усовершенствованы или созданы новые методики ксенотрансплантации.
Учитывая результаты наших исследований об отрицательном влиянии слишком ранней экспрессии генно-инженерных конструкций под сдау-промотором на жизнеспособность предымпланта-ционных эмбрионов млекопитающих [1, 2], нами при создании конструкций с нуклеотидными по следовательно стями генов ЫЛТ1 и ЫЛТ2 человека в качестве промоторно-энхансорной области была выбрана регуляторная область гена альбумина мыши (рис. 2). Этот выбор обусловлен тем, что ген альбумина в пре-дымплантационных эмбрионах ещё не активен, и, по всей вероятности, альбуминовый промотор не должен запускать экспрессию чужеродных генов ЫЛТ1 и ЫЛТ2 человека и оказывать отрицательное влияние на их жизнеспособность.
В качестве доноров эмбрионов использовали самок гибридных мышей Б1 СВАЛас * С57ВЬ/6 массой 16-18 г. На следующих этапах осуществлялось выделение ДНК/РНК из пробы плазмы крови, амплификация геномной ДНК, идентификация ПЦР-продуктов методом горизонтального электрофореза. Наличие в геле полоски ДНК соответствующего размера свидетельствовало о присутствии в образце искомого гена.
Параллельно осуществлялся синтез специфических олигонуклеотидных праймеров и детекция экспрессии генов у людей и создаваемых трансгенных животных. Гены ЫЛТ1 и ЫЛТ2 амплифи-цировались по стандартным методикам.
На основе выполненных работ были получены ДНК-конструкции NAT1 и NAT2 с соответствующими генами человека. С помощью генно-инженерных методов получены животные, несущие гены NAT1 и NAT2 человека, а также первая генерация соответствующих трансгенных животных. Ранее был проведен биоинформационный анализ последовательностей генов NAT1 и NAT2 мышей, крыс, кроликов для отбора наиболее перспективных нуклеотидных последовательностей мишеней, с целью использования в синтезе видоспеци-фичных праймеров для полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) [3].
Результаты наших исследований приживаемости 2-клеточных мышиных эмбрионов, инъецированных генно-инженерными конструкциями NAT1 и NAT2 человека, в организме самок-реципиентов, свидетельствующих о достаточно высоком проценте приживаемости этих эмбрионов (как в пересчёте на всех реципиентов, так и на беременных), подтверждают это предположение.
Анализ интеграции трансгенов в органах и тканях потомков мышей, трансгенных как по гену NAT1, так и по NAT2 человека, показал, что встраивание трансгенов у первичных трансгенных мышей (F0) произошло во все три зародышевых листка - эктодерму, энтодерму и мезодерму. Особенно важно, что встраивание трансгенов у самок произошло в оба яичника. Это должно позволить быстро размножить и создать линии трансгенных животных.
В нашей работе (так же, как и у исследователей из Аризонского университета [7]) было получено 5 первичных (F0) трансгенных мышей с интегри-
рованной конструкцией hNATl и 3 - с hNAT2 человека. Причина относительно более низкого выхода трансгенных мышей с интегрированной конструкцией NAT2hom требует своего дальнейшего выяснения.
Проведено исследование вариантов ацетилирования гена NAT2 у различных линий мышей методом ПДРФ-анализа с применением эндонуклеаз рестрикции: Kpnl, Tagl, BamHI. Проведены молекулярно-генетические исследования экспрессии генов NAT2 и NAT1 человека и мыши на уровне мРНК у трансгенных животных методом ОТ-ПЦР с применением видоспецифичных праймеров.
Проведено сравнение видоспецифичных праймеров для ОТ-ПЦР у людей и лабораторных животных для последующей оптимизации экстраполя-ционных биомоделей ацетиляционного полиморфизма по NAT1 и NAT2, а также для изучения механизмов сегрегации индивидуумов в медленные, быстрые или промежуточные ацетиляторные фенотипы, что будет представлено в последующих публикациях.
По результатам выполнения работы с помощью видоспецифичных праймеров подтверждено наличие генов NAT1 и NAT2 человека у создаваемых линий трансгенных мышей.
Список литературы
1. Езерский В.А., Тевкин С.И., Трубицина Т.П., Колоскова Е.М., Шишиморова М.С., Безбородова O.A., Якубовская Р.И., Рябых
В.П. Интеграция и тканеспецифическая экспрессия гена лактоферрина человека в молочной железе трансгенных кроликов // Проблемы биологии продуктивных животных. 2013. № 4. С. 33-52.
2. Каркищенко H.H., Рябых В.П., Каркищен-ко В.Н., Колоскова Е.М. Создание гумани-
зированных мышей для фармакотоксило-гических исследований (успехи, неудачи и перспективы) // Биомедицина. 2014. № 3. С. 4-22.
3. Каркищенко Н.Н., Петрова Н.В., Слобо-денюк В.В. Высокоспецифичные видовые праймеры к генам NAT1 и NAT2 для сравнительных исследований у человека и лабораторных животных // Биомедицина. 2014. № 2. С. 4- 17.
4. Blin N., Stafford D.W. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eukaryotes // Nucleic acids res. 1976. No. 3(9). Pp. 2303-8.
5. Boukouvala S., Fakis G. Arylamine N-acet-yltransferases: what we learn from genes and genomes // Drug metabolism reviews. 2005. No. 37. Pp. 511-564.
6. Butcher N.J., Arulpragasam A., Goh H.L., Davey Т., Minchin R.F. Human arylamine N-acetyltransferase-1 interacts with EHZF, a multi-functional transcription co-factor // In: Third International Workshop on Arylamine N-acetyltransferases. - Vancouver, Canada. 2004.
7. Cao W., Chau B., Hunter R., Strnatka D., McQueen C.A., Erickson R.P. Only low levels of exogenous N-acetyltransferase can be achieved in transgenic mice // Pharmacogenetics J. 2005. No. 5. Pp. 255-261.
8. Cornish V.A., Pinter K., Boukouvala S., Johnson N., Labrousse C., Payton M., Priddle H., Smith A.J., Sim E. Generation and analysis of mice with a targeted disruption of the arylamine N-acetyltransferase type 2 gene // Pharmacogenomics J. 2003. No. 3. Pp. 169-177.
9. Coughtrie M.W.H., Sharp S., Maxwell K., Innes N.P. Biology and function of the reversible sulfation pathway catalysed by human sulfotransferases and sulfatases // Chem.-biol. interact. 2003. No. 109. Pp. 3-27.
10. Erickson R., Morgan C., McQueen C.A. 2nd International NAT Workshop. - Eynsham, Oxford. 2000. Abstract. No. 1.
11. Green M.D., Tephly T.R. Glucuronidation of amine substrates by purified and expressed UDP-glucuronosyltransferase proteins // Drug metab. dispos. 1998. No. 26. Pp. 860-867.
12. Karolyi J., Erickson R.P., Liu S. Genetics of susceptibility to 6-aminonicotinamide-induced cleft palate in the mouse: studies in congenic and recombinant inbred strains // Teratology. 1988. No. 37. Pp. 283-287.
13. Karolyi J., Erickson R.P., Liu S., Killewald L. Major effects on teratogen-induced facial clefting in mice determined by a single genetic region // Genetics. 1990. No. 126. Pp. 201-205.
14. LeffM.A., Epstein P.N., Doll M.A., Fretland A.J., Devanaboyina U.S., Rustan T.D., Hein D.W. Prostate-specific human N-acetyltrans-ferase 2 (NAT2) expression in the mouse // J. Pharmacol. exp. ther. 1999. No. 290(1). Pp. 182-187.
15. Nebert D.W. Polymorphisms in drug metabolising enzymes: what is their clinical relevance and why do they exist? // Am. J. hum. genet.
1997.No. 60. Pp. 265-271.
16. Nelson D.R., Koymans L., Kamataki T., Stegeman J.J., Feyereisen R., Waxman D.J., Waterman M.R., Gotoh O., Coon M.J., Estabrook R.W., Gunsalus I.C., Nebert D.W. P450 superfamily: update on new sequences, gene mapping, accession numbers and nomenclature // Pharmacogenetics. 1996. No. 6. Pp. 1-42.
17. Sim E., Pinter K., Mushtaq A., Upton A., Sandy J., Bhakta S., Noble M. Arylamine N-acetyltransferases: a pharmacogenomic approach to drug metabolism and endogenous function // Biochem. soc. trans. 2003. No. 31. Pp. 615-619.
18. Sugamori K.S., Wong S., Brenneman D., Lu X., Grant D.M. NAT3 knockout or over expression in mice has no influence on N-acetylation activity // Drug metab. rev. 2004. No. 36. 164 p.
19. Sugamori K.S., Wong S., Gaedigk A., Yu V, Abramovici H., Rozmahel R., Grant D.M. Generation and functional characterization of arylamine N-acetyltransferase Nat1/Nat2 double-knockout mice // Mol. pharmacol. 2003.No. 64. Pp. 170-179.
20. Wong L.-L. Cytochrome P450 monooxygenases // Curr. opin. chem. biol.
1998. No. 2. Pp. 263-268.
Molecular and genetic aspects of technology of generation transgene mice with the integrated human of N-acetyltransferase genes (NAT1 and NAT2)
V.N. Karkischenko, V.P. Ryabykh, N.N. Karkischenko, M.S. Dulya, V.A. Ezerskiy, E.M. Koloskova, V.N. Lazarev, S.V. Maksimenko, N.V. Petrova, V.N. Stolyarova, T.P. Trubitsina
The DNA constructions with nucleotide sequences of human genes of NAT1 and NAT2 and promoter-enhancedregion of a mice albumin gene were created. The coding parts of NAT1 and NAT2 genes were amplified from a matrix ofgenomic human DNA with use ofNATl-Not and NATl-Xho oligonucleotides in case of NAT1 and NAT2-Not and NAT2-Xho in case of NAT2. Plasmids of pSI-NATl and pSI-NAT2 split by BamHI and EcoRV endonuclease (the site of a restriction of EcoRV was entered in enAlb-F oligonucleotide).
Synthesis of the oligonucleotide primers and detection of human genes expression and the created transgene animals with the use of specific oligonucleotide primers was carried out in parallel.
At the following stages allocation of DNA/RNA from blood plasma test, amplification of genomic DNA, identification of PCR products was carried out by method of a horizontal electrophoresis. Existence in gel of DNA strip corresponding size testified to existence in a sample of a required gene.
Transgene mice (FO) with the designs integrated into their genome including nucleotide sequences of genes ofhuman NAT1 and NAT2 under the albumin gene mice promoter were generated. Total effectiveness of a transgenesis for NAT1 gene is l,l% and for NAT2 - O,6%. The analysis of integration of transgenes in various descendants (Fl) organs and tissues of primary transgene mice (FO) showed that human genes NAT1 and NAT2 was found in the cells ofall three germinal leaves.
Key words: DNA constructions NAT1 and NAT2 genes, promoter-enhanced region of gene, plasmids, high-specific primers, detection ofagenes expression, amplification, transgenesis.
