CC BY
89УДК: 606:579.255
Савельев Сергей Николаевич
Студент, Кемеровский государственный университет,
г. Кемерово, Россия Руденская Елизавета Александровна Студент, Кемеровский государственный университет,
г. Кемерово, Россия Милентьева Ирина Сергеевна Кандидат технических наук, доцент кафедры бионанотехнологии Кемеровский государственный университет,
г. Кемерово, Россия DOI: 10.24411/2520-6990-2020-11727 ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА ПРИ ПОМОЩИ ШТАММА BACILLUS SUBTILIS SZMC 6179J
Saveliev Sergei Nikolaevich
Student Kemerovo State University, Kemerovo, Russia Rudenskaya Elizaveta Aleksandrovna
Student Kemerovo State University, Kemerovo, Russia
Milenteva Irina Sergeevna
PhD in technical, associate professor of the bionanotechnology Kemerovo State University, Kemerovo, Russia
GETTING RECOMBINANT PROTEIN BY USING A STRAIN BACILLUS SUBTILIS SZMC 6179J
Аннотация
В статье рассмотрены перспективные решения применения штамма Bacillus subtilis SZMC 6179J в промышленном получении белка. Представлен один из методов выделения плазмидной ДНК (культивирование проводилось на среде NBM) с геном экспрессии необходимого белка встроенной в клетку для контроля качества.
Abstract
In following article considered promising decisions of using Bacillus subtilis (strain SZMC 6179J) in industrial production of protein. Presented one of the methods for isolation of plasmid DNA (grown on NB-Medium) with expression of the necessary protein integrated into cell for quality control.
Ключевые слова: биотехнология, рекомбинантные белки, инновационные методы, штамм Bacillus subtilis SZMC 6179J, питательная среда NBM.
Keywords: biotechnology, recombinant proteins, innovative methods, bacillus subtilis (strain SZMC 6179J), growth medium NBM.
В настоящее время активно развивается такое перспективное направление в биотехнологии как получение рекомбинантных белков. На данный момент исследования в этой области продолжают расти. Учёные раз за разом открывают различные инновационные методы и способы получения рекомбинантных белков.
Несмотря на многочисленное разнообразие вариантов, большая часть продуктов, производимых сегодня, осуществляется либо с помощью рекомби-нантной кишечной палочки, либо в клетках животных, то есть в клетках яичника китайского хомячка (СНО) или в клетках гибридомы.
Развитие технологий рекомбинантной ДНК и гибридомы перевернуло рынок доступных фармацевтических продуктов.
В отличие от традиционных терапевтических средств, фармацевтические препараты, производимые по новым технологиям, являются в основном белковыми продуктами, которые включают в себя:
инсулин, гормон роста, интерферон. С появлением большого количества этих продуктов открываются новые клинические применения [3].
За последние годы взгляд особое внимание привлёк такой микроорганизм, как Bacillus subtilis. В настоящее время детально изучены физиологические, биохимические, молекулярно-биологические свойства, налаженная технология получения. Имеются хорошие результаты получения готовых продуктов, которые укрепили данный микроорганизм в качестве основного для крупномасштабного промышленного получения белков.
Полученные знания позволяют довольно легко конструировать векторы и подбирать оптимальные последовательности нуклеотидов для экспрессии необходимого белка.
Благодаря наличию 24 высокоактивных промоторов для экспрессии генов и продукции ферментов и относительной простой ген вставки,
TECHNICAL SCIENCE / <<Ш^ШМиМ~^©иГМа1>#Щ61)),2©2(1
Bacillus subtilis прочно вошёл в промышленное производство препаратов.
Однако, имеется как ряд преимуществ, так и недостатков. Bacillus subtilis относится к грамполо-жительным бактериям, клеточная стенка которых представляет собой жесткую структуру вне клетки. Она состоит из пептидогликана, представляющего собой полимер сахаров и аминокислот, также в состав входят тейхоевые кислоты, липотейхоевые кислоты и белки. Данная особенность строения клеточной стенки бактерии позволяет выделять экспрессионный продукт непосредственно в куль-туральную жидкость, в отличии от грамотрицатель-ных бактерий, которые накапливают продукт в периплазме. Это важная особенность в плане отчистки и выделения рекомбинантного продукта.
так как стоимость очистки может составлять 50 % или более от общей стоимости производства продукта, в зависимости от того, накапливается он в самой клетке или выделяется наружу.
Отсутствует механизм альтернативного сплайсинга. Bacillus subtilis не умеет самостоятельно модифицировать и сворачивать белки, в результате чего белковые молекулы образуются не зрелые. Bacillus subtilis имеет одну круговую хромосому. Общий размер всей ДНК составляет 4 215 606 п.н. (4,2 Мбит / с). 4100 генов кодируют белки. 53% кодирующих белок генов видны только один раз, тогда как 25% генома относится к семействам генов, которые подверглись дупликации генов (рисунок 1).
Рисунок 1. Геном Bacillus subtilis
Для выделения плазмидной ДНК проводят культивирование штамма SZMC 6179J на среде NB-Medium (NBM) при температуре 37 oC в течении 20-24 ч при скорости роторной качалки-шей-кера 200-300 об/мин [4].
Для того чтобы выделить полученную плаз-мидную ДНК сначала необходимо осадить клетки. Отобрать 1,5 мл культуры в микроцентрифужную пробирку, провести центрифугирование при 10000 об/мин в течении 2 мин, повторить несколько раз, после удалить супернатант.
Ресуспензировать полученный осадок в 200 мкл раствора a, выдержать при комнатной температуре в течении 5 мин. Добавить 400 мкл раствора b, поместить образец на лёд на 5 мин. После добавить 500 мкл раствора c, несколько раз перевернуть пробирку и оставить на льду в течении 5 мин.
Раствор а: 100мМ Tris-HCl, pH 8,0; 10мМ ЭДТА; 50мМ глюкоза. Перед применением внести фермент лизоцим около 5 мг/мл.
Раствор b: 1% SDS; 0,2Н NaOH.
Раствор c: 3М CH3CO2K, рН 5,0. На 100 мл: 5M CH3CO2K - 60 мл; CH3COOH ледяная - 11,5 мл; H2O - 28,5 мл.
Далее, осадить хромосомную ДНК путём центрифугирования при 10000 об/мин в течении 5 минут. Отобрать супернатант, именно он содержит плазмидную ДНК, перенести в новую пробирку, добавить 500 мкл этанола для осаждения плазмидной ДНК, оставить на 8-10 минут. После чего провести центрифугирование для лучшего осаждения при 10000 об/мин в течении 10 минут.
Плазмидный осадок растворить в 100 мкл TE-буфера, провести фенольную депротеинизацию образца для более качественной очистки. Обработать рибонуклеазой для удаления РНК. Полученную плазмидную ДНК отправить на ПЦР для контроля нужного гена экспрессии белка [1, 2].
Bacillus subtilis используются в промышленности, если необходимо получить большой выход белковой продукции. На сегодняшний момент это один из основных перспективных кандидатов наработки белка в промышленных масштабах. Микроорганизм применяют для наработки белка в фармацевтике. В основном полученные белки идут как добавка в корма для сбалансированности кормового рациона животных, что является решающим фактором для высокой продуктивности мясного
животноводства. Производство такого белка можно осуществлять круглосуточно вне зависимости от погодных условий, а благодаря способности микроорганизма расти на дешёвом сырье, которое можно пустить на вторичное производство в качестве той же добавки в корма, делает биотехнологический процесс безотходным.
Работа выполнена в рамках гранта Президента РФ при государственной поддержке ведущих научных школ (НШ-2694.2020.4).
Список литературы:
1. Бабич, О.О. Клонирование и экспрессия гена pal Rhodosporidium toruloides и характеристика синтезируемой L-фенилаланин-аммоний-лиазы / О.О. Бабич, Л.С. Солдатова, А.Ю. Просеков // Биотехнология. - 2011. - №4. - С. 33-39.
2. Данилова, Ю.В. Среда для культивирования рекомбинантного штамма Bacillus subtilis с модифицированным геном глутамилэндопептидазы bacillus intermedin / Ю.В. Данилова, Н.П. Балабан, Т.Р. Шамсутдинов и др. // Ученые записки Казанского университета. Серия Естественные науки - 2011. - Т.153. - №2. - С. 51-62.
3. Essentials of Glycobiology 3-rd edition / A Varki, R.D. Cummings, J.D. Esko, et al. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2015-2017. - 823 p.
4. Proteins, Pathologies and Politics: Dietary Innovation and Disease from the Nineteenth Century / D. Gentilcore, M. Smith, et al. - New York (NY): Bloomsbury Academic, 2018. - 264 p.
