CC BY
44
Том 152, кн. 3
Естественные науки
2010
УДК 577.21+579.258+57.044
ВЛИЯНИЕ ДЕЛЕЦИЙ В ПРОМОТОРЕ НА ЭКСПРЕССИЮ ГЕНА ГЛУТАМИЛЭНДОПЕПТИДАЗЫ BACILLUS INTERMEDIUS
А.А. Тойменцева, Е.И. Шагимарданова, А.Р. Каюмов, М.Р. Шарипова
Аннотация
Исследована экспрессия гена глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius с различной длиной 5'-нетранслируемой области. Установлено, что изменение длины промотора приводит к снижению уровня экспрессии гена gseBi и сдвигу максимумов накопления фермента в среде относительно контроля. Обнаружено, что общие закономерности биосинтеза фермента в условиях солевого стресса не зависят от длины промотора гена, однако при полноценном промоторе продуктивность штамма в 1.5 раза выше. Установлено, что делеции в регуляторной области гена на расстоянии более 300 п.о. от точки инициации транскрипции, содержащие потенциальные сайты взаимодействия с регуляторными белками SpoOA, DegU, CcpA, приводят к потере чувствительности экспрессии гена gseBi в отношение глюкозо-катаболитной репрессии.
Ключевые слова: глутамилэндопептидаза, Bacillus intermedius, модифицация промотора, регуляция экспрессии, сайты регуляции, солевой стресс, катаболитная репрессия.
Введение
Большинство протеолитических ферментов, используемых в мировой промышленности, производится на основе микроорганизмов, принадлежащих к роду Bacillus [1, p. 3]. Эта практика обоснована непатогенностью бацилл и простотой выделения внеклеточных гидролаз. Кроме того, протеазы занимают центральное положение в физиологии микробной клетки. Они выполняют трофическую функцию, участвуют в споруляции, прорастании спор, расщеплении и круговороте белков, что является основанием для исследования регуляторных механизмов экспрессии и секреции этих стратегически важных клеточных ферментов, клонирования их генов и скрининга и модификаций целевых продуктов практического назначения [2].
Bacillus intermedius 3-19 в постэкспоненциональной фазе роста секретируют различные внеклеточные протеазы, среди которых менее 10% приходится на глутамилэндопептидазу (GseBi) [3]. Глутамилэндопептидаза B. intermedius -химотрипсинподобная сериновая протеаза, с высокой специфичностью гидро-лизующая пептидные связи, образованные а-карбоксильными группами глута-миновой и аспарагиновой аминокислот [4]. Фермент выделен из культуральной жидкости до гомогенного состояния [12], ген белка клонирован и секвенирован (AN Y15136) [5]. Изучены условия накопления глутамилэндопептидазы в реком-бинантных штаммах: фермент появляется в культуральной жидкости на стадии замедления роста культуры, его активность достигает максимума в стационарной фазе [6]. В этот период на синтез глутамилэндопептидазы не оказывает влияния
глюкозо-катаболитная репрессия [7]. Установлено оптимальное соотношение основных компонентов питательной среды для максимального накопления фермента [8]. Описана и проанализирована регуляторная область гена gseBi: выявлены потенциальные сайты взаимодействия с белками двухкомпонентных сигнальных систем, глобальных регуляторов и альтернативных сигма-факторов [7]. Показано, что сокращение З'-некодирующего региона гена gseBi, ответственного за терминацию, приводит к уменьшению активной продукции протеазы в клетках B. subtilis [9].
Исследование секретируемой глутамилэндопептидазы B. intermedius 3-19 является важным не только с точки зрения узкой субстратной специфичности фермента и его высокого потенциала практического использования, но также для понимания фундаментального механизма регуляции экспрессии гена фермента на поздних стадиях развития культуры и в условиях стресса. Настоящая работа посвящена изучению влияния длины промотора на экспрессию гена глутамилэндопептидазы, в том числе в условиях стресса.
1. Материалы и методы
Штаммы и плазмиды. В работе использовали мультикопийную плазмиду Д58.21, содержащую полный ген глутамилэндопептидазы B. intermedius 3-19 [5]. Для клонирования модифицированных генов gseBi был использован вектор pUP110 из музея Казанского университета. В качестве штаммов-реципиентов плазмидной ДНК использовали штамм В. subtilis JB 20-36 дефицитный по собственным внеклеточным протеазам (Ferrari, USA). Плазмиды, использованные и полученные в работе, перечислены в табл. 1.
Табл. 1.
Использованные в работе плазмиды
Название плазмиды Генотип Размер, т. п. н. Ссылки
Д58.21 Сша *, gseBi (с длиной промотора - 665 п.о.) 6.136 ИМГ РАН [5]
pUP110 Кш* 3.571 КФУ
pLAD Кша, gseBi (модифицированный промотор - 364 п.о.) 4.860 Получена в работе
pPD Кша, gseBi (модифицированный промотор - 215 п.о.) 4.710 Получена в работе
* Km - канамицин, Cm - хлорамфеникол, R - резистентность.
Питательные среды. Для культивирования рекомбинантных штаммов В. тЫШъ использовали среду ЬБ [10, р. 756]. Для создания условий солевого стресса в среду дополнительно вносили хлорид натрия до конечных концентраций 0.5 и 1 М. Посевным материалом служила 15-часовая ночная культура (1 об. %), выращенная на контрольной среде с добавлением антибиотика. Культивирование клеток рекомбинантных штаммов проводили в колбах объемом 100 мл при соотношении объема среды к объему колбы 1/7 на качалке (200 об./мин) при 37 °С. Прирост биомассы измеряли нефелометрически на КФК-2 при длине волны 590 нм. Количество биомассы выражали в единицах светопоглащения в кювете с длиной оптического пути 1 см (культуральную жидкость с клетками разводили в соответствующее число раз в случае больших величин ОП).
1 aagctttcttctcagaaagaagcaagtcatttacctttagatcagccgattcaaatgaga
61 gaattacttgcgtcacatgttgagcttcaagagcctgcaacacgtacgcagctaagagag
121 ctcgcagcatatacagtttgtccgcctcaccgcgtggagcttgagcaaatggctggtgaa
181 gcatatcaagaagccgttttaaagaaacgagtaaccaTGCTGGActtattagatcaatat
241 gaagcgtgtgagctgccgtttg|tgcactttttagca|cttttaccaggtttgaagccgcgc
3 01 tattactcaatttctagctcaccaaaagtcgaagaaaaaagagtcagtatcacagTGGCG
3 61 GTtg|tgaaaggtaaagca|tggagcgccgcgagaatatcgccggagtcgcatcaaactatt
421 tatgcggtcttgcaggcaggagaagaagtcgcctgcttcctccacgaagcgcaggcagga
481 ttccagctgccaccttcatctgaagtaccgatgatcatgatcggaccgggtacaggaatc
541 gctccatttagagggtttgttcaggcaagagaagtgtggcagaaggaaggaaanccacta
601 ggcgaagctcacctgtattttggctgtcgtcaccctctTGAAGATgatctgtattttgag
661 gaaatgcagcttgcagcgcaaaaaggagttgttcacatccaccgggcttattctcgtcac
721 aaagagcaaaaagtatatgtccagcatttgttgaaagaagacggcggcatgctgatcaag OliHAD
7 81 ttacttgaccaaggtgggtatctttacgtgtgcggggacggaaaagttatggcaccagac
841 gtagaggctacgcttatcgacctctatcaaaacgagaaacattgctcgaaggaaacagct
901 gaaaattggc|tgacaacccttgca|aatgacaatagatatgtaaaagatgtgtggagc|tga|
961 |aaaattaggaa|gaccgccaattaggcggttttttctatttcatagagagagatcaataga
1021atgaaggt|tggaaagatacaaa|acacctaatttaaaaatgaaatattttgtaaaaaataa
-35 -10 +1
10 81gaatattctctcatttactccaatatgaaacaatcgtatgatttttgatataggacataa
SD M
1141aggaggaatatgatg
Рис. 1. Схема промотора гена gseBi. Жирным шрифтом и прописными буквами выделены участки с гомологией к SpoOA-боксу. Двойным подчеркиванием выделены потенциальные сайты связывания с белком DegU. Обведены в рамку предполагаемые последовательности для связывания с белком CcpA. Тенью обозначена область с гомологией к последовательности для связывания с белком AbrB. -35 и -10 - области узнавания РНК полимеразы; +1 - точка инициации транскрипции; SD - последовательность Шайна - Дальгарно. Стрелочками на рисунке показаны выбранные участки, по которым проводили укорачивание регуляторной области
Конструирование укороченной области регуляции гена gseBi. При использовании алгоритма BLAST и комплекса программ, представленных на сервере NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), был проведен поиск консервативных мотивов в промоторной области гена глутамилэндопептидазы. Вероятное расположение потенциальных сайтов связывания с регуляторными белками DegU и SpoOA, глобального регулятора CcpA [7] послужило основанием для модификации регуляторной области гена. Схема получения модифицированных генов gseBi приведена на рис. 1, 2. На рис. 1 указаны оставшиеся участки промотора, которые содержат плазмиды pLAD и pPD. На первой стадии амплифи-цирвали ген протеазы при использовании пар праймеров GluLAD-GluSTOP и GluPD-GluSTOP (табл. 2). Полученные фрагменты ДНК рестрицировали по сайтам BamHI, HindIII и лигировали в бациллярный вектор pUP110, предварительно рестрицированный по этим же сайтам. Полученные конструкции были обозначены pLAD, pPD соответственно.
стн
КгшИ
Рис. 2. Схема конструирования плазмид, несущих ген gseBi с различной длиной 5'-не-транслируемой области регуляции. На первой стадии получали амплификаты, содержащие ген протеазы и участок промотора. Для этого были сконструированы синтетические олигонуклеотиды специфичные к 5'-концевой области промотора и З'-концевой структурной области гена (табл. 2). При использовании олигонуклеотидных пар (01иЬАЭ-в1и8Т0Р и 01иРБ-01и8Т0Р) регуляторная 5'-область гена глутамилэндопептидазы укорачивалась до 364 и 215 п.о. соответственно. Полученные амплифицированные фрагменты полностью расщепляли по сайтам ВатН1, НтйШ и клонировали по одноименным сайтам в бациллярный вектор риР110. Отобранные конструкции получили названия рЬАБ, рРБ соответственно
Табл. 2
Олигонуклеотиды, использованные в работе (производство фирмы "ЗуШоГ, г. Москва). Сайты узнавания для рестриктаз ВатН1 и ШМШ подчеркнуты
Название Нуклеотидная последовательность (5' ^ 3')
в1иЬАБ (5') 5' АОТТАСООАТССААООТОООТАТСТТТАСО 3'
в1иРБ (5') 5' вАСААТООАТССОТААААОАТОТОТООАв 3'
аиБТОР (3') 5 АТААООААОСТТСАОТОАТССАвССТСТТС 3'
Трансформацию клеток В. тЫШъ плазмидной ДНК проводили как описано в [11]. Определение протеолитической активности проводили по методу, описанному ранее [12]. Субстратом служил пара-нитроанилид карбобензокси-Ь-глута-миновой кислоты (2-01и-рКА). За единицу протеолитической активности принимали количество фермента, гидролизующего в условиях эксперимента 1 мкмоль субстрата за 1 мин. Полученный результат умножали на коэффициент 1000.
Продуктивность культуры в отношении синтеза глутамилэндопептидазы (удельная активность) определяли как отношение величины протеолитической активности в культуральной жидкости к величине биомассы и выражали в условных единицах.
При анализе результатов экспериментов использовали общепринятые методы статистической обработки. При этом статистический анализ результатов проводили с использованием пакета программ SPSS 12.0. Рассчитывали среднеквадратичное отклонение (о), результаты считали достоверными при о < 10%. При расчете достоверности получаемых разностей использовали критерий Стью-дента, принимая P < 0.05 за достоверный уровень значимости.
2. Результаты и их обсуждение
Анализ регуляторной области гена gseBi. Особенностью экспрессии гена глутамилэндопептидазы B. intermedius 3-19 является его способность к индукции в период формирования клетками различных адаптивных реакций в ответ на дефицит питательных веществ, стрессовое воздействие, переход в анабиотическое состояние [8, 13]. Подобная регуляция, вероятно, достигается путем смены регуляторных факторов в разные периоды роста бациллярной клетки. Ранее в 5'-регуляторной области гена gseBi обнаружены потенциальные последовательности для специфического взаимодействия с регуляторными белками DegU (AGAA Nn-i3TTCAG) и Spo0A (TGTCGAA), сайт связывания с белком катаболитного контроля CcpA (TGWAARCGYTWNCW), а также идентифицирована последовательность для взаимодействия с белком AbrB (WAWWTTTWCAAAAAAW) (рис. 1) [7]. Для выяснения вклада данных систем в контроль экспрессии гена фермента были получены две модификации гена gseBi с укороченными промоторами. В первом случае создана плазмида pLAD, несущая ген gseBi, в промоторе которого имеются следующие потенциальные сайты взаимодействия с регуляторными белками: три CcpA, два DegU и по одному Spo0A и AbrB. Плазмида pPD несет регуляторную область гена gseBi, которая содержит два DegU и два CcpA бокса.
Биосинтез глутамилэндопептидазы под контролем делеционных промоторов. Исследованы динамика роста культуры и изменение накопления глу-тамилэндопептидазы в культуральной жидкости в процессе роста двух реком-бинантных штаммов B. subtilis (pLAD и pPD) на среде LB. Результаты представлены на рис. 3. Рост клеток рекомбинантных штаммов практически не отличался друг от друга: через 10-12 ч заканчивается логарифмическая фаза роста и обе культуры переходят в стационарную фазу роста к 20-му часу. Глутами-лэндопептидаза появляется в культуральной жидкости обоих штаммов на стадии замедления роста культуры. Обнаружено два пика с максимальной протеолити-ческой активностью фермента в отношении специфического субстрата для глу-тамилэндопептидазы - Z-Glu-pNA (рис. 3). Первый пик в рекомбинантном штамме B. subtilis pLAD приходится на 24-й час роста бактерий. У штамма B. subtilis, трансформированного плазмидой pPD, первый пик синтеза фермента приходится на 28-й час, что соответствует началу стационарной фазы. Второй максимум накопления активности протеазы в культуральной жидкости приходится
12
20
о о <0
15
4 акт. рРР
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52
Время,ч
Рис. 3. Динамика роста культуры и биосинтеза глутамилэндопептидазы в рекомбинатном штамме В. ииЫШи, содержащем плазмиды рЬЛЭ и рБЯ с укороченной 5'-областью регуляции гена gseBi на среде ЬБ: удельная скорость роста клеток В. ииЫйНи рЬЛЭ (1), В. ииЫйНи рРБ (2); продуктивность фермента штаммами В. ииЫйНи рЬЛБ (3), В. ииЫМШ рРБ (4)
на 44-й (В. тЫШи рЬЛБ) и 48-й (В. subtilis рРБ) часы роста бактерий, то есть в поздней стационарной фазе. Результаты в отношении накопления глутамилэндопептидазы с полной регуляторной областью в рекомбинантном штамме В. ииЫ^Ш Д58.21 были представлены ранее: первый пик активности приходится на 20-й час роста, второй - на 48-й [13].
Изучение динамики роста и накопления фермента в культуральной жидкости на среде ЬБ показало, что отсутствие последовательности (содержащей большинство потенциальных сайтов связывания с белками DegU, 8ро0Л, СсрЛ) выше 365 п.о. от точки +1 приводит к снижению уровня экспрессии гена gseBi в ре-комбинантных штаммах В. ииЫ^Ии pLAD и pPD по сравнению со штаммом, несущим полную регуляторную область гена фермента.
Влияние солевого стресса на биосинтез модифицированных генов gseBi.
Согласно данным литературы секреция щелочных протеаз у бацилл коррелирует с активностью двухкомпонентной системы трансдукции сигнала DegS-DegU [14]. Наличие в промоторе гена глутамилэндопептидазы В. Шетте^ш последовательностей нуклеотидов, характерных для связывания с регуляторным белком DegU, предполагает индукцию биосинтеза фермента в условиях солевого стресса. Нами исследовано влияние высоких концентраций солей на уровень биосинтеза глутамилэндопептидазы в рекомбинантных штаммах В. ииЫ^Ш несущих плазмиды pLAD и pPD. Динамика роста культуры и биосинтеза фермента рекомбинантными штаммами на средах, содержащих хлорид натрия, представлена на рис. 4 и 5. Внесение в среду 0.5 М №С1 подавляло рост обоих рекомбинантных штаммов. При этом продуктивность клеток в отношении синтеза протеазы также уменьшалась в 2-3 раза (рис. 4). Увеличение концентрации соли в среде до 1 М вызывало значительное увеличение продуктивности биосинтеза глутамилэндопептидазы в 6-10 раз в рекомбинантных штаммах В. ииЫ^Ш (pPD
20
18
16
о 14 0
<о 12 □
О 10
ё 8 о.
6 4 2 0
2,5
20 24 28 32 Время, ч
ч
ш
с
о
1,5
0,5
о о £ ш
X
н
*
ч о
р
с
2
1
0
Рис. 4. Влияние 0.5 М №С1 на динамику роста и продуктивность фермента глутами-лэндопептидазы в рекомбинантных штаммах B. subtilis: удельная скорость роста клеток B. subtШs с плазмидами рЬЛО (1) и рРБ (2); продуктивность протеазы в штаммах B. subtilis рЬЛБ (3) и рРБ (4)
12 16 20 24 28 32 36 Время, ч
Рис. 5. Влияние 1 М №С1 на динамику роста и продуктивность глутамилэндопептида-зы в рекомбинантных штаммах B. subtШs: удельная скорость роста клеток B. suЫШs с плазмидами рЬЛЭ (1) и рРБ (2); продуктивность протеазы в штаммах B. subtШs рЬЛБ (3) и рРБ (4).
и рЬЛБ соответственно) (рис. 5). Полученные данные в отношении влияния №С1 на биосинтез глутамилэндопептидазы говорят о положительной регуляции экспрессии гена gseBi со стороны сохранившихся участков промотора, содержащих два потенциальных сайта регуляции для системы DegS-DegU.
Влияние глюкозо-катаболитной репрессии на биосинтез модифицированной глутамилэндопептидазы. Интересные данные получены при культивировании рекомбинантных штаммов на среде, содержащей 1%-ную глюкозу. По данным исследователей известно, что в присутствии глюкозы активизируется механизм катаболитной репрессии [15, 16]. Ранее в нашей лаборатории установлено, что синтез глутамилэндопептидазы подвержен влиянию данной системы
18
20
16
18
0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52
Время, ч
Рис. 6. Влияние 1%-ной глюкозы на динамику роста и продуктивность глутамилэндо-пептидазы в рекомбинантных штаммах В. зиЫШ^. удельная скорость роста клеток В. 8иЪШ18 с плазмидами рЬЛЭ (1) и рРБ (2); продуктивность протеазы в штаммах В. яиЪа^ рЬЛБ (3) и рРБ (4)
регуляции, если глюкозу вносить в среду в начальной стадии культивирования (0-10-й часы роста, вегетативный рост) [7]. После 20-го часа роста, то есть в стационарной фазе, биосинтез фермента не чувствителен к добавлению глюкозы в среду, активность фермента не снижается после добавления индуктора [7]. Тем не менее наши результаты показали, что экспрессия гена глутамилэндо-пептидазы сохраняется на достаточно высоком уровне в присутствии глюкозы в среде (рис. 6).
Первый пик активности рекомбинантного штамма В. тЫШъ рЬЛБ на среде с глюкозой наблюдали на 24-й час, а второй - на 48-й. Что касается штамма, содержащего плазмиду рРБ, активность наблюдалась на 24-й и 52-й часы культивирования.
Таким образом, нами впервые получены данные, свидетельствующие о том, что модификация промоторов приводит к потере чувствительности к катаболит-ной репрессии. По-видимому, в результате делеций в модифицированных промоторах гена gseBi нет либо недостаточно сайтов для запуска системы катабо-литной репрессии. Можно предположить, что идентифицированные нами в ходе геноинформационного анализа сайты регуляции (СсрА боксы) либо неактивны в данной системе экспрессии, либо близко расположены относительно стартовой точки гена gseBi, что может являться препятствием для правильного связывания РНК-полимеразы с модифицированным промотором гена gseBi.
Работа поддержана грантами: РФФИ (проект № 09-04-99044), Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» 2009-2013 годы (ГК № П323), Аналитической ведомственной целевой Федеральной программы (РНП 2.11.1005).
Summary
A.A. Toymentseva, E.I. Shagimardanova, A.R. Kayumov, M.R. Sharipova. Biosynthesis of Bacillus intermedius Glutamyl Endopeptidase under Control of Promoter Region with Different Lengths.
The expression of the Bacillus intermedius glutamyl endopeptidase gene was investigated for different length of its regulatory region. It was proved that the change of the length of the promoter region results in the decrease of the gseBi gene expression level and the shift of the protease accumulation maximums in the medium relative to control. It was also found that the enzyme biosynthesis in salt stress conditions does not depend on the length of the 5'-region. However, with the full-length promoter region the strain's productivity is 1.5 times higher. It was ascertained that the reduction of the promoter region up to 365 bp, when there is no potential binding sites for the regulatory SpoOA, DegU, and CcpA proteins, leads to the loss of sensitivity of the gseBi gene expression to the glucose catabolite repression.
Key words: glutamyl endopeptidase, Bacillus intermedius, promoter modification, expression control, potential binding sites, salt stress, catabolite repression.
Литература
1. Godfrey T., West S. Introduction to industrial enzymology // Industrial enzymology / Eds. T. Godfrey, S. West. - N. Y.: Macmillan Publ. Inc., 1996. - P. 1-8.
2. Mala B.R., Aparn M.T., Mohini S.G., VasantiI V.D. Molecular and Biotechnological Aspects of Microbial Proteases // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 1998. - V. 62, No 3. -P. 597-635.
3. Шарипова М.Р., Балабан Н.П., Габдрахманова Л.А., Шилова М.А., Кадырова Ю.М., Руденская Г.Н., Лещинская И.Б. Гидролитические ферменты и спорообразование у Bacillus intermedius // Микробиол. - 2002. - Т. 71, № 4. - C. 494-499.
4. Руденская Г.Н. Глутамилэндопептидазы микроорганизмов - новое подсемейство химотрипсиноподобных протеиназ // Биоорган. химия. - 1998. - Т. 24, № 4. -С. 256-261.
5. Rebrikov D.V., Akimkina Т.К, Shevelev A.B., Demiduyk I.V., Bushueva A.M., Kost-rov S.V., Chestukhina G.G., Stepanov V.M. Bacillus intermedim glutamyl endopeptidase. Molecular cloning and nucleotide sequence of the structural gene // J. Prot. Chem. -1999. - V. 18, No 1. - P. 21-27.
6. Балабан Н.П., Шарипова М.Р., Габдрахманова Л.А., Марданова A.M., Токмакова Ю.С., Соколова Е.А., Руденская Г.Н., Лещинская И.Б. Синтез и секреция протеиназ Bacillus intermedius 3-19 на поздних стадиях спорообразования // Микробиол. - 2003. - Т. 72, № 3. - С. 338-342.
7. Sharipova M.R., Shagimardanova E.I., Chastukhina I.B., Shamsutdinov T.R., Balaban N.P., Mardanova A.M., Rudenskaya G.N., Demidyuk I.D., Kostrov S.V. The expression of Bacillus intermedius glutamyl endopeptidase gene in Bacillus subtilis recombinant strains // Mol. Biol. Rep. - 2007. - V. 34, No 2. - P. 79-87.
8. Частухина И.Б., Шарипова М.Р., Балабан Н.П., Габдрахманова Л.А., Сафина Д.Р., Костров С.В., Руденская Г.Н., Лещинская И.Б. Регуляция биосинтеза внеклеточной глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius в рекомбинантном штамме Bacillus subtilis на стадии спорообразования // Микробиол. - 2004. - Т. 73, № 3. - С. 335-342.
9. Gasanov E.V., Romanova D.V., Gromova T.Iu., Demidiuk I.V. Effect of deletion of 3'-noncoding region of the Bacillus intermedius glutamyl endopeptidase gene on the active protein production level in the culture of the B. subtilis cells // Mol. Gen. Mikrobiol. Vi-rusol. - 2007. - No 2. - P. 31-32.
10. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. - N. Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. - 1659 p.
11. Chang S., Cohen S.N. High frequency transformation of Bacillus subtilis protoplasts by plasmid DNA // Mol. Gen. Genet. - 1979. - V. 168, No 1. - P. 111-115.
12. Leshchinskaya I.B., Shakirov E.V., Itskovitch E.L., Balaban N.P., Mardanova A.M., Sharipova M.R., Viryasov M.B., Rudenskaya G.N., Stepanov V.M. Glutamyl endopepti-dase of Bacillus intermedius, strain 3-19 // FEBS Lett. - 1997. - V. 404, No 2-3. -P. 241-244.
13. Частухина И.Б., Шарипова М.Р., Балабан Н.П., Костров С.В., Руденская Г.Н., Ле-щинская И. Б. Особенности биосинтеза глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius рекомбинантными клетками Bacillus subtilis в стационарной фазе роста // Микро-биол. - 2005. - Т. 74, № 1. - С. 39-47.
14. Steil L., Hoffmann T., Budde I., Volker U., Bremer E. Genome-wide transcriptional profiling analysis of adaptation of Bacillus subtilis to high salinity // J. Bacteriol. - 2003. -V. 185, No 21. - P. 6358-6370.
15. Henkin T.M. The role of the CcpA transcriptional regulator in carbon metabolism in Bacillus subtilis // FEMS Microbiol. Lett. - 1996. - V. 135, No 1. - P. 9-15.
16. Fujita Y. Carbon catabolite control of the metabolic network in Bacillus subtilis // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 2009. - V. 73, No 2. - P. 245-259.
Поступила в редакцию 22.03.10
Тойменцева Анна Александровна - аспирант кафедры микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета.
E-mail: TojmencevaAA@mail.ru
Шагимарданова Елена Ильясовна - аспирант кафедры микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета.
E-mail: elenakazan@yahoo.com
Каюмов Айрат Рашитович - кандидат биологических наук, ассистент кафедры генетики Казанского (Приволжского) федерального университета.
E-mail: kairatr@yandex.ru
Шарипова Маргарита Рашидовна - доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета.
E-mail: Margarita.Sharipova@ksu.ru
