CC BY
59
Том 152, кн. 4
Естественные науки
2010
УДК 579.22:577.21
ВЫДЕЛЕНИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ БЕЛКОВ, АКТИВИРУЮЩИХСЯ В УСЛОВИЯХ ОГРАНИЧЕННОГО РОСТА БАЦИЛЛ
А.М. Черёмин, А.А. Тойменцева, А.Р. Сабирова, А.Р. Каюмов, А.Б. Маргулис, М.Р. Шарипова
Аннотация
Регуляторные белки бацилл DegU, SpoOA и TnrA выделены и очищены из клеточных экстрактов рекомбинантных штаммов-продуцентов E. coli аффинной хроматографией на колонке с сефарозой, содержащей никель-нитрилотриуксусную кислоту (Ni-NTA). Проведена идентификация соответствующих регуляторных белков с помощью иммуноблоттинга с использованием специфических кроличьих антител против His-tag-последовательностей.
Ключевые слова: регуляторные белки, TnrA, DegU, SpoOA, экспрессионные векторы.
Введение
Для активации экспрессии многих генов, участвующих в адаптационных процессах, кроме о-факторов РНК-полимеразы необходимы также факторы транскрипции. Белок DegU - мастер-регулятор системы сигнальной трансдукции DegS-DegU в клетках B. subtilis - в фосфорилированной форме активирует экспрессию генов внеклеточных ферментов деградации: протеиназ, амилаз, липаз и др. [1]. Нефосфорилированная форма DegU необходима для достижения клетками состояния компетентности [2]. Фактор транскрипции SpoOA регулирует комплексный процесс перехода бацилл к споруляции - финальный ответ микроорганизмов на голодание [3]. Фосфорилирование фактора SpoOA происходит по N-концевому домену белка, а С-концевой домен взаимодействует с консен-сусной последовательностью нуклеотидов в промоторной области [4]. С-концевой домен белка SpoOA способен также связываться со SpoOA-боксом в промоторах генов, будучи в нефосфорилированной форме [5]. Фактор транскрипции TnrA в условиях азотного голодания активирует или подавляет экспрессию большого числа генов и оперонов [6].
Бактерии Bacillus intermedius в стационарной фазе роста активно секрети-руют сериновые протеиназы: субтилизиноподобную протеиназу AprBi и глу-тамилэндопептидазу GseBi [7, 8]. Уровень синтеза ферментов снижается в Deg-регуляторных мутантах B. subtilis, полностью подавлен в SpoOA-штаммах и отзывается на TnrA-регуляцию, что может служить косвенным доказательством участия этих систем в регуляции экспрессии генов протеиназ [9-11].
Целью настоящей работы являлось выделение и очистка регуляторных белков DegU, TnrA и SpoOA для исследования ДНК-белковых взаимодействий с промоторами генов протеиназ B. intermedius.
1. Материалы и методы исследования
В работе использовали плазмиду pMF14, несущую фрагмент гена SpoOA из генома B. subtilis, который кодирует С-концевой домен белка SpoOA, участвующий во взаимодействии с ДНК, а также содержащий последовательность, соответствующую шести гистидинам (His-tag) на N-конце. Плазмида pMF14 содержит ген устойчивости к ампициллину и была любезно предоставлена для работы профессором Ричардом Лозиком (Гарвардский университет, Кэмбридж) [5]. Экспрессионный вектор pTYB-degU несет рекомбинантный ген белка DegU с шестью остатками гистидина на N-конце, а также ген устойчивости к ампициллину. Плазмида предоставлена для работы профессором K. Цукахара (Институт океанических исследований, Токио) [12]. Плазмида pET15b-TnrA, несущая ген регуляторного белка TnrA и штамм-реципиент плазмид E. coli BL21 любезно предоставлены профессором К. Форшхаммером (Университет г. Тюбингена, Германия).
Для культивирования бактерий использовали среду Лоури - Бертони (LB) [13]. Культивирование проводили в колбах объемом 100 и 1000 мл при соотношении объема 1 : 7.5 на лабораторных качалках с интенсивностью качания 200 об/мин. Клетки E. coli выращивали при температуре 37 °С с добавлением антибиотика в конечной концентрации 1 мМ. В качестве инокулята использовали 16-часовую культуру, выращенную на среде LB. Контроль за ростом культуры осуществляли, определяя изменение оптической плотности (0опт) культуры, нефелометрически на ФЭК-56М с красным светофильтром (590 нм), а также на планшетном фотометре «iEMS-Reader» (Labsystems, Финляндия, Thermo Fisher Scientific Inc.), в программе «Микроб-автомат». Для снятия репрессии 1ас-оператора и индукции гиперэкспрессии целевого белка к культуре клеток, находящихся в экспоненциальной фазе роста (ОП590 = 0.6), добавляли IPTG до конечной концентрации 1 мМ. После этого клетки выращивали 4-6 ч для получения целевого белка и собирали центрифугированием.
Клеточный лизат получали путем механического растирания клеточной биомассы с добавлением буфера L (50 мМ ТрисНС1, рН 8.0; 0.3% KCl; 2 мМ PMSF). Полученный лизат центрифугировали 15 мин при 4000 об/мин. Супер-натант, полученный в результате разрушений, центрифугировали 10 мин при 13000 об/мин и использовали для дальнейшей работы.
Очистку регуляторных белков DegU, TnrA и Spo0A проводили методом афинной хроматографии на Ni-NTA-колонке фирмы Sigma (США). Клеточный лизат наносили со скоростью 0.5 мл/мин на колонку, уравновешенную буфером А (20 мМ Трис HCl, рН 8.0; 400 мМ NaCl; 20 мМ имидазол) и промывали буфером А до снижения поглощения элюата при длине волны X = 280 до значения 0.01. Белок элюировали буфером B (20 мМ Трис HCl, рН 8.0; 400 мМ NaCl; 250 мМ имидазол) при скорости 0.5 мл/мин.
Количество белка в растворе определяли спектрофотометрически, измеряя поглощение раствора при длинах волн 260 и 280 нм, а также методом Брэдфорд [14].
Концентрацию белка подсчитывали по формуле: Сбелка (мг/мл) = 1.55-A280 -- 0.76-Л260, где Л280 - поглощение света при 280 нм, Л260 - поглощение света при 260 нм.
Степень чистоты полученных препаратов и их молекулярную массу определяли методом электрофореза, который проводили в 15%-ном ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-Na) [15].
Идентификацию белков SpoOA, DegU и TnrA проводили методом имму-ноблоттинга [16]. Для постановки метода использовали кроличьи антитела к последовательности из шести гистидинов на Л-концах белков. После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану, предварительно смоченную водой и наносили на фильтры, смоченные в буферах для анода I и II, затем на мембрану помещали гель и фильтры с буфером для катода III. Электро-блоттинг проводили при 30 мА в течение 30 мин. Для определения эффективности переноса белков на мембрану использовали метод обратимого окрашивания с помощью раствора PSS (Ponceau S staining solution). После появления картинки промывали мембрану водой несколько раз.
Буфер для анода I - 300 мМ Tris-HCl, 96%-ный этанол. Буфер для анода II -25 мМ Tris-HCl, 96%-ный этанол. Буфер для катода III - 25 мМ Tris-HCl, 96%-ный этанол, 40 мМ аминокапроновая кислота. Раствор PSS - 2% Ponceau S, 3%-ная трихлоруксусная кислота, 3%-ная сульфосалициловая кислота.
Для предотвращения неспецифического связывания антител мембрану обрабатывали 5%-ным раствором обезжиренного молока в TBS (Tris based solution) в течение 1 ч с интенсивностью качания 50 об/мин. Затем мембрану помещали в 1%-ный раствор молока в TBS, вносили антитела против исследуемого белка и инкубировали при +4 °С в течение ночи, после этого трижды отмывали в TBS-буфере по 5 мин. Далее инкубировали в 1%-ном растворе молока в TBS, содержащем антитела против антител кролика, коньюгированные с пероксидазой (Sigma, США), в течение 1.5 ч при 50 об/мин. После этого трижды отмывали в TBS-буфере по 5 мин. Для проявления мембраны обрабатывали в равном соотношении растворами ECL1 и ECL2 и инкубировали в течение 20 мин с рентгенографической пленкой (ООО «НПП «Тасма», г. Казань), затем фотопленку переносили в раствор проявителя (ООО «НПП «Тасма», г. Казань), далее в раствор закрепителя (ООО «НПП «Тасма», г. Казань).
TBS - 20 мМ Tris-HCl (pH 7.4), 9 г/л NaCl. ECL1 - 2.5 мМ люминол, 0.4 мМ паракумаровая кислота, 100 мМ Tris-HCl (pH 8.5). ECL2 - 5.4 мМ H2O2, 100 мМ Tris-HCl (pH 8.5).
Анализ последовательности проводили с помощью алгоритма BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) [17].
2. Результаты и их обсуждение
В промоторной области генов aprBi и gseBi, последовательность которых установлена ранее [ANY15136; ANAY754946], проводили поиск и идентифицировали участки с высокой гомологией (до 80%) к последовательностям для специфического взаимодействия с регуляторными белками DegU (AGAA Nn_i3 TTCAG) и Spo0A (TGNCGAA) (рис. 1).
aprBi
gaatggaaggtccttgattacaacgtggtcagccatttactccatcctcccctttt taaagaalcctgttattgtaacaggttntttttnaa|tgccaaa|accaaaaaataata
ttttttta
tatcgaaattcgaaatagatgctagacgtttctacctattttaaggct
tttcgggtatcgaatatttgtccgaaaatggatcataagaaaaaaagcacacttcc
tttttaatagataaccgctgaaacagcagaacaaacatattttcccaacgtttcca
agtgacttaattccccaattttcgctaggactttcacaaaaattcgggtctactct
Ltcattctta
tatttgcctacttcccttaaactgaatatacagaataatc
aaacgaa
tagactacgaatgattattctgaaataagaaaaaagggatgtggattgtgcgtgaa
aaagaaaaatgtgatg gseBi
c
actaggcgaagctcacctgtattttggctgtcgtcaccctcttgaagatgatctg
tattt
tgaggaaatgcagcttgcagcgcaaaaaggagttgttcacatccaccgggc
ttattctcgtcacaaagagcaaaaagtatatgtccagcatttgttgaaagaagacg
gcggcatgctgatcaagttacttgaccaaggtgggtatctttacgtgtgcggggac
ggaaaagttatggcaccagacgtagaggctacgcttatcgacctctatcaaaacgag aaacattgctcgaaggaaacagctgaaaattggctgacaacccttgcaaatgacaat agatatgtaaaagatgtgtggagctgaaaaattaggaagaccgccaattaggcggtt ttttctatttcatagagagagatcaatagaatgaaggttggaaagatacaaaacacc taatttaaaaatgaaatattttgtaaaaaataagaatattctctcatttactccaat atgaaacaatcgtatgatttttgatataggacataaaggaggaatatgatg
Рис. 1. Последовательности промоторной области генов субтилизиноподобной протеи-назы (аргБ1) и глутамилэндопептидазы ^ь'вЫ) Б. intermedius. Сайты связывания с регу-ляторным белком 8ро0Л выделены рамками, с регуляторным белком DegU подчеркнуты, канонические последовательности в пределах DegU-бокса выделены. Инициирующий кодон выделен курсивом и подчеркнут
Эти последовательности расположены в виде прямых тандемных повторов на протяжении 460 п.о. Характерной особенностью расположения этих участков в регуляторной области генов субтилизиноподобных протеиназ является тот факт, что 8ро0Л-боксы располагаются близко или частично перекрываются с последовательностями для связывания с белком DegU. Этот факт позволяет предположить, что обе системы не могут одновременно участвовать в регуляции экспрессии генов протеиназ и активируются в ответ на различные стрессовые условия.
В промоторе гена субтилизиноподобной протеиназы aprBi нами обнаружено 10 участков ДНК с высокой гомологией к 8ро0Л-консенсусам и 8 участков с высокой гомологией к DegU-боксам. В промоторе гена gseBi выявлено 4 сайта с высокой гомологией к 8ро0Л и 6 высокогомологичных участков к DegU. В то же время не обнаружено консенсусных последовательностей для ТигЛ-белка, что позволяет использовать этот белок в качестве отрицательного контроля при изучении взаимодействия с промотором.
Для изучения взаимодействия факторов транскрипции с промоторами генов протеиназ регуляторные белки выделяли и очищали до гомогенного со-
стояния. Для этого использовали рекомбинантные штаммы E. coli, характеризующиеся суперпродукцией SpoOA, TnrA и DegU регуляторных белков.
Все используемые в работе экспрессионные системы содержали промотор бактериофага Т7 [18, р. 322-323.]. Активация промотора осуществлялась специфичной Т7 РНК-полимеразой бактериофага. Ген Т7 РНК-полимеразы был интегрирован в хромосому клетки хозяина в lac-оперон, регулируемый индуктором IPTG. Такая экспрессионная система обеспечивает суперпродукцию целевого белка с промотора фага Т7, специфически активируемого индуцибель-ной Т7 РНК-полимеразой [19] (рис. 2).
В этом случае внесение индуктора - лактозы или ее синтетического аналога IPTG - снимает репрессию 1ас-оперона на хромосоме и на векторе. Начинается синтез Т7-РНК полимеразы, которая транскрибирует ген целевого белка на плазмиде. Благодаря высокой эффективности Т7 РНК-полимеразы через 4-6 ч целевой белок становится доминирующим белковым компонентом клетки.
В работе мы использовали векторы, которые позволили провести клонирование генов DegU-, TnrA- и SpoOA-белков с последовательностями из шести гистидинов. Такие белки обладают способностью специфически связываться с ионами никеля, что дает возможность применить для очистки белков аффинную хроматографию. Сорбент содержит аминополикарбоновую нитрилотриук-сусную кислоту, которая способна образовывать устойчивые растворимые комплексы с ионами металлов, в данном случае с ионами Ni. His-tag-последовательности рекомбинантных белков прочно связывались с ионами Ni, что позволило использовать процедуру аффинной хроматографии для селективной сорбции исследуемых белков.
Плазмиды pMF14, pET15b-TnrA и pTYB-DegU были трансформированы в бесплазмидный лабораторный штамм E. coli BL21. В результате скрининга трансформантов на среде с антибиотиком (ампициллином) были отобраны клоны E. coli BL21 pTYB-DegU, E. coli BL21 pET15b-TnrA и E. coli BL21 pMF14, которые использовали для получения и очистки белков DegU, TnrA и
Spo0A.
Проводили сравнительное изучение динамики роста рекомбинантных и бес-плазмидного штаммов. Для определения потребления субстрата штаммами E. coli BL21 pTYB-DegU, E. coli BL21 pMF14 и E. coli BL21 pET15b-TnrA использовали планшетный фотометр iEMS-Reader. Бесплазмидный штамм E. coli BL21 служил в качестве контроля (рис. 3).
Полученные данные показали, что приращение оптической плотности штаммов-продуцентов рекомбинантных белков по сравнению с контролем начинает уменьшаться на 10-й час роста, что свидетельствует о наличии в них дополнительной генетической информации в виде рекомбинантных векторов, требующих дополнительных ресурсов источников питания для поддержания жизнедеятельности бактерий. В отличие от штаммов-продуцентов, бесплазмидный штамм переходит в стационарную фазу позднее - на 16-й час роста. Как следует из рис. 3, вплоть до 18-го часа оптическая плотность растет, тогда как у штаммов-продуцентов снижается после 8-10 ч культивирования.
pLink
Рис. 2. Схема pET вектора экспрессии (а): 1 - ген lacI; 2 - Т7-промотор; 3 - 1ас-оператор; 4 - полилинкерный сайт. 5 - фаговый сайт инициации репликации; 6 - ген устойчивости к антибиотику (ампициллин); 7 - сайт инициации репликации E. coli. Хромосома штамма реципиента (б): 1 - ген lacI, 2 - lac-промотор, 3 - 1ас-оператор; 4 -открытая рамка считывания гена T7 РНК полимеразы с терминатором, интегрированным в хромосому клетки-хозяина
I =
|
Е
0000 01:00 02:00 03:00 04:00 05:00 06:00 07 00 08:00 09 00 1 0:00 11:00 1 2:00 13:00 14 00 15:00 16:00 17:00 13:00
период измерения (в часах)
Рис. 3. Кривые роста бесплазмидного (1) E. coli BL21 и рекомбинантных штаммов: 2 -E. coli BL21 pMF14, 3 - E. coli BL21 pET15b-TnrA, 4 - E. coli BL21 pTYB-DegU
Концентрация белка, мг/мл
Объем фракций, мл
Рис. 4. Профиль элюции белка DegU с Ni-NTA-колонки
Табл. 1
Очистка белка Deg U при помощи хроматографии на Ni-NTA-сефарозе
Стадии Концен- Общее коли- Общее ко- Степень Выход
очистки трация чество экс- личество очистки белка,
белка, тракта/ белка, мг белка %
мг/мл элюата, мл
Клеточный экстракт 7 15 105 1 100
Хроматография на Ni-NTA се- 0.009 15 0.13 807 0.12
фарозе
Клетки рекомбинантных штаммов E. coli BL21 pTYB-DegU, E. coli BL21 pET15b-TnrA и E. coli BL21 pMF14 выращивали на среде LB. После индукции IPTG клетки разрушали и проводили выделение целевых белков из клеточных лизатов путем аффинной хроматографии.
Клеточные экстракты рекомбинантного штамма E. coli BL21 pTYB-DegU подвергали очистке путем хроматографии на колонке с Ni-NTA-сефарозой. В этих условиях при нанесении экстракта на колонку сорбция на сефарозе составила не более чем 2%, что свидетельствует о селективности процесса. При промывке буфером А до поглощения А280 = 0.01 белок не элюировал с колонки. Элюцию белка осуществляли буфером В с повышенной концентрацией имида-зола. В процессе элюции получали один белковый пик (рис. 4).
Белок элюировал с колонки в объеме 5 мл с содержанием 0.02 мг по белку. В результате одноступенчатой хроматографии белок очищен в 807 раз, выход DegU в процессе очистки составил 0.12%. (табл. 1). Степень чистоты препарата тестировали электрофорезом в 15% полиакриламидном геле (рис. 5).
5 6 7
9 10 11 М кДА
45 кДа
28
кДА,
Рис. 5. Электрофорез фракций, содержащих DegU белок, после элюции с №-№ТЛ-сефа-розы (дорожки 3-10), М - стандарты молекулярной массы
Концентрация белка, мг/мл 0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Объем фракций, мл
Рис. 6. Профиль элюции белка SpoOA с Ni-NTA-колонки
На рисунке видно, что очищенный препарат после электрофореза представлен в виде единственной белковой полосы с молекулярной массой 28 кДа, что соответствует ожидаемой молекулярной массе белка, рассчитанной по аминокислотной последовательности. Таким образом, в результате очистки мы получили хроматографически и электрофоретически гомогенный препарат для ДНК-белкового взаимодействия.
Экстракты рекомбинантного штамма E. coli BL21 pMF14, продуцирующего бациллярный фактор транскрипции SpoOA, подвергали хроматографии аналогично штамму E. coli BL21 pTYB-DegU. После сорбции белок элюировал с колонки в объеме 6 мл с содержанием 0.1 мг (рис. 6).
В результате хроматографии белок был очищен в 65 раз, выход SpoOA-белка составил 1.5% (табл. 2).
Степень чистоты препарата тестировали электрофорезом в 15%-ном поли-акриламидном геле (рис. 7).
3
8
4
Табл. 2
Очистка белка SpoOA при помощи хроматографии на Ni-NTA-сефарозе
Стадии Концен- Общее коли- Общее ко- Степень Выход
очистки трация чество экс- личество очистки белка,
белка, тракта/ белка, мг белка %
мг/мл элюата, мл
Клеточный экстракт 7 15 105 1 100
Хроматография на Ni-NTA- 0.1 16 1.6 65 1.5
сефарозе
3 4 5 6 7 8 9 10 11 М 66 кДа
4
5 КДа
13.5 кД^
^23 кДа кДа
Рис. 7. Электрофорез фракций, содержащих SpoOA белок, после элюции с Ni-NTA-се-фарозы (дорожки 3-11), М - стандарты молекулярной массы
На рисунке видно, что очищенный препарат после электрофореза представлен одной белковой полосой с молекулярной массой 13.5 кДа, что соответствует молекулярной массе С-домена белка SpoOA, предназначенного для взаимодействия с ДНК [5]. Таким образом, в результате проведения аффинной хроматографии мы получили хроматографически и электрофоретически гомогенный препарат для исследования ДНК-белкового взаимодействия с промо-торной областью гена.
Экстракты рекомбинантного штамма E. coli BL21 pET15b-TnrA подвергали хроматографии аналогично штаммам E. coli BL21 pMF14 и E. coli BL21 pTYB-DegU. Профиль элюции представлен на рис. 8. В результате одноступенчатой хроматографии белок был очищен в 31 раз, выход TnrA белка составил 3.2% (табл. 3). Фракции элюата собирали и анализировали с помощью электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле (рис. 9).
На рисунке видно, что очищенный препарат после электрофореза представлен в виде единственной белковой полосы с молекулярной массой 16 кДа. Таким образом, в результате очистки мы получили хроматографически и элек-трофоретически гомогенный препарат для ДНК-белкового взаимодействия.
Идентификацию соответствующих регуляторных белков в полученных препаратах проводили с помощью иммуноблоттинга с использованием специфических кроличьих антител против His-tag-последовательностей (рис. 10).
Концентрация белка, мг/мл
Объем фракций, мл
Рис. 8. Профиль элюции белка ТпгА с №-ЫТА-колонки
Табл. 3
Очистка белка ТпгА при помощи хроматографии на №-ЫТА-сефарозе
Стадии очистки Концентрация белка, мг/мл Общее количество экстракта/ элюата, мл Общее количество белка, мг Степень очистки белка Выход белка, %
Клеточный экстракт 7.5 15 112.5 1 100
Хроматография на №-ЭТА-сефарозе 0.24 15 3.6 31 3.2
М 2
45 кДа^ 35 кДа
25 кДа ^ 18.4 кД^
14.4 кДа^
10
16 кДа
7
5
6
Рис. 9. Электрофорез фракций, содержащих ТпгА-белок, после элюции с №-№ТА-сефа-розы (дорожки 2-10), М - стандарты молекулярной массы
На рисунке представлен результат, полученный для ТпгА-белка. Аналогичные результаты получены для белков DegU и 8ро0А, что свидетельствует о получении целевых белков, которые предназначены для изучения взаимодействия с ДНК-промоторными областями клонированных генов протеаз
В. ¡МвгтвЛш.
1
2
15
10
70 50 40
35 25
TnrA
(16 кДа)
Рис. 10. Вестерн-блотт анализ клона E. coli Bl-21 pET15b-TnrA: 1 - стандарт молекулярной массы; 2 - иммуноблоттинг с антителами к His-Tag
Белки регуляторных систем взаимодействуют с ДНК, активируя либо подавляя экспрессию генов. Для исследования взаимодействия регуляторных белков с промоторной ДНК in vitro очистка нативных белков из клеток невозможна ввиду их малой концентрации. Использование экспрессионных систем позволяет наработать достаточное количество целевого белка, а конструирование рекомбинант-ных белков, несущих аффинную метку, делает возможной их очистку методом аффинной хроматографии в одну стадию и получение при этом высокоочи-щенного белка.
В результате проделанной работы нами получены регуляторные белки SpoOA, DegU и TnrA в количестве 1.6, 0.13 и 3.6 мг соответственно, необходимые для исследования их взаимодействия с промоторами генов внеклеточных протеиназ B. intermedius.
Работа выполнена при финансовой поддержке грантов: РФФИ (проект № 0904-99044), Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» (ГК № П.344), Аналитической ведомственной целевой Федеральной программы (РНП 2.11.1005).
A.M. Cheremin, A.A. Toymentseva, A.R. Sabirova, A.R. Kayumov, A.B. Margulis, M.R. Sha-ripova. Isolation of Regulatory Proteins Activated under Limited Growth Conditions of Bacilli.
Bacillus subtilis regulatory proteins DegU, SpoOA and TnrA were isolated and purified from cell lysates of E. coli recombinant strains by affinity chromatography on a column with nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA). The identification of corresponding regulatory proteins was carried out via immunoblotting analysis using specific rabbit antibodies targeting the His-tag sequences.
Key words: regulatory proteins, TnrA, DegU, SpoOA, expression vectors.
Заключение
Summary
Литература
1. Msadek T., Kunst F., Henner D., Klier A., Rapoport G., Dedonder R. Signal transduction pathway controlling synthesis of a class of degradative enzymes in Bacillus subtilis: expression of the regulatory genes and analysis of mutations in degS and degU // J. Bacte-riol. - 1990. - V. 172, No 2. - P. 824-834.
2. Kunst F., Rapoport G. Salt stress is an environmental signal affecting degradative enzyme synthesis in Bacillus subtilis // J. Bacteriol. -1995. - V. 177, No 9. - P. 2403-2407.
3. Hoch J.A. spo0 genes, the phosphorelay, and the initiation of sporulation // Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria: biochemistry, physiology and molecular genetics / By ed. A.L. Sonenshein, J.A. Hoch, R. Losick. - Washington D.C.: Amer. Soc. for Microbiol., 1993. - P. 747-755.
4. Ireton K., Rudner D.Z., Siranosian K.J., GrossmanA.D. Integration of multiple developmental signals in Bacillus subtilis through the SpoOA transcription factor // Genes Dev. -1993. - V. 7, No 2. - P. 283-294.
5. Losick R., Fujita M., Gonzalez-Pastor J.E. High- and low-threshold genes in the SpoOA regulon of Bacillus subtilis // J Bacteriol. - 2005. - V. 187, No 4. - P. 1357-1368.
6. Wray L. V., Ferson A.E., Rohrer K., Fisher S.H. TnrA, a transcription factor required for global nitrogen regulation in Bacillus subtilis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1996. -V. 93, No 17. - P. 8841-8845.
7. Шарипова М.Р., Балабан Н.П., Габдрахманова Л.А., Шилова М.А., Кадырова Ю.М., Руденская Г.Н., Лещинская И.Б. Гидролитические ферменты и спорообразование у Bacillus intermedius // Микробиол. - 2002. - Т. 71, № 4. - С. 494-499.
8. Балабан Н.П., Марданова А.М., Шарипова М.Р., Габдрахманова Л.А., Соколова Е.А., Гарусов А.В., Милготина Е.И., Руденская Г.Н., Лещинская И.Б. Получение и характеристика глутамилэндопептидазы 2 Bacillus intermedius 3-19 // Биохимия. - 2003. -Т. 68, Вып. 11. - С. 1514-1521.
9. Каюмов А.Р., Балабан Н.П., Марданова А.М., Костров С.В., Шарипова М.Р. Биосинтез субтилизиноподобной сериновой протеиназы Bacillus intermedius в условиях солевого стресса // Микробиол. - 2006. - Т. 75, № 5. - С. 557-563.
10. SharipovaM.R., Chastukhina I.B., Shagimardanova E.I., Shamsutdinov T.R., Balaban N.P., Mardanova A.M., Rudenskaya G.N., Demiduk I.V., Kostrov S.V. The expression of Bacillus intermedius glutamyl endopeptidase gene in Bacillus subtilis recombinant strains // Mol. Biol. Rep. - 2007. - V. 34, No 2. - P. 79-87.
11. Sharipova M., Balaban N., Kayumov A., Kirillova Y., Gabdrakhmanova L., Mardanova A., Leshchinskaya I., Rudenskaya G., Akimkina T., Safina D., DemidyukI., Kostrov S. The expression of the serine proteinase gene of Bacillus intermedius in Bacillus subtilis // Microbiol. Res. - 2008. - V. 163, No 1. - P. 39-50.
12. Tsukahara K., Ogura M. Promoter selectivity of the Bacillus subtilis response regulator DegU, a positive regulator of the fla/che operon and sacB // BMC Microbiol. - 2008. -V. 8, No 8. - URL: http://www.biomedcentral.com/1471-2180/8/8, свободный.
13. Sambrook J., Russell D.W., Irwin N., Janssen K.A. Preparation and transformation of competent E. coli using calcium chloride. Protocol 25 // Sambrook J., Russell D.W. (eds.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. - N. Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press, 2001. -V. 1, Ch. 1. - P. 1.116-1.118.
14. BradfordM.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. - 1976. -V. 72, No 7. - P. 248-254.
15. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacte-riophage T4 // Nature. - 1970. - V. 227, No 5259. - P. 680-685.
16. Burnette W.N. Western blotting: electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A // Anal. Biochem. - 1981. - V. 112, No 2. -P. 195-203.
17. Altschul S.F., Madden T.L., Schaumluffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lip-man D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic. Acids Res. - 1997. - V. 25, No 17. - P. 3389-3402.
18. Purves W., Heller H., Orians G., Sadava D. Life: the science of biology. - Sunderland, MA: Sinauer Associates, Inc., 2001. - 1100 p.
19. Unger T.F. Show Me The Money: Prokaryotic Expression Vectors and Purification Systems // The Scientist. - 1997. - V. 11, No 17. - URL: http://f1000scientist.com/article/ display/17700/0901_1t0.pdf, свободный.
Поступила в редакцию 09.08.10
Черёмин Андрей Михайлович - аспирант кафедры микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета.
E-mail: andrey4eremin@mail.ru
Тойменцева Анна Александровна- аспирант кафедры микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета.
E-mail: knoopka@list.ru
Сабирова Альбина Рушановна - аспирант кафедры микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета.
E-mail: albina-12@mail.ru
Каюмов Айрат Рашитович - кандидат биологических наук, ассистент кафедры генетики Казанского (Приволжского) федерального университета.
E-mail: kairatr@yandex.ru
Маргулис Анна Борисовна - кандидат биологических наук, старший преподаватель кафедры микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета.
E-mail: Anna.Margulis@ksu.ru
Шарипова Маргарита Рашидовна - доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета.
E-mail: Margarita.Sharipova@ksu.ru
