Получение поликлональных и моноклональных антиидиотипических антител к морфин-специфическим иммуноглобулинам Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Медицинская иммунология Medical Immunology (Russia)/

2020, Т. 22, № I Иммунологические методы Meditsinskaya Immunologiya

стр. 187-196 T J i ' i i J 2020, Vol. 22, No 1, pp. 187-196

© 2020, спбро рааки Immunological methods © 2020, spb raaci

ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИИДИОТИПИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К МОРФИН-СПЕЦИФИЧЕСКИМ ИММУНОГЛОБУЛИНАМ

Трофимов А.В.1, Атанесян В.А.1, Ищенко А.М.1, Карабанова Е.А.1, Рак А.Я.1' 2, Симбирцев А.С.1, Гамалея Н.Б.3, Берзина А.Г.3, Станкова Н.В.4, Капанадзе Г.Д.4, Ульянова Л.И.3, Климова Т.А.3

1ФГУП«Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия

2 ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет», Санкт-Петербург, Россия

3 ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр психиатрии и наркологии имени В.П. Сербского» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия

4 ФГБУН«Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России, п. Светлые горы, Красногорский район, Московская обл., Россия

Резюме. Получение и изучение антиидиотипических (вторичных) антител (Ab2) к моноклональ-ным первичным антителам (Abi), специфичным к биологически активным молекулам с известной структурой, имеет большую научную и практическую значимость. В связи с частичным антигенным подобием структур Ab2 и исходного антигена эти антитела могут стать основой вакцины в том случае, если использование антигена невозможно или ограничено законодательством. В частности, на основе Ab2 могут быть созданы препараты, предназначенные для иммунизации с целью профилактики и лечения наркологической зависимости. Ценность свойств Ab2 еще более возрастает, если для их получения используют Abi, распознающие разные участки молекулы антигена, что позволяет получить антитела второго поколения с широким спектром специфичности. В данной работе были получены морфиноподобные поликлональные и моноклональные Ab2. В каждом случае в качестве иммуноглобулинов первого поколения для иммунизации мы использовали два мышиных моноклональных антитела (мАт), специфичных к различным производным морфина: антитела 3K11 — к 3-0-карбок-симетильному (КММ) и 2-р-карбокси-фенилазометильному (ФАМ) производным, а также антитела 6G1 — к 6-гемисукцинильному производному (ГСМ). После проведения иммунизации лошади данными Abi и развития иммунного ответа из сыворотки крови животного были выделены три пула специфических поликлональных антител — антивидовые антитела лошади к тотальным иммуноглобулинам мыши (HAM), антиидиотипические антитела лошади к антителам 3K11 (HAM-K11) и к антителам 6G1 (HAM-G1). Параллельно в результате иммунизации мышей антителами 3K11 и 6G1 и проведения слияния лимфоцитов животных с клетками миеломы мыши линии Sp2/0 по методу Мильштейна—Кёлера были получены три продуцента антиидиотипических антител: клон, продуци-

Адрес для переписки:

Трофимов Александр Викторович ФГУП«Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России

197110, Россия, Санкт-Петербург, ул. Пудожская, 7. Тел.: 8 (904) 632-07-27. E-mail: a.v.trofimov@hpb.spb.ru

Образец цитирования:

А.В. Трофимов, В.А. Атанесян, А.М. Ищенко, Е.А. Карабанова, А.Я. Рак, А.С. Симбирцев, Н.Б. Гамалея, А.Г. Берзина, Н.В. Станкова, Г.Д. Капанадзе, Л.И. Ульянова, Т.А. Климова «Получение поликлональных и моноклональных антиидиотипических антител к морфин-специфическим иммуноглобулинам» // Медицинская иммунология, 2020. Т. 22, № 1. С. 187-196. doi: 10.15789/1563-0625-P0P-1658 © Трофимов А.В. и соавт., 2020

Address for correspondence:

Trofimov Alexander V.

State Research Institute of Highly Pure Biopreparations, Federal Medical-Biological Agency 197110, Russian Federation, St. Petersburg, Pudozhskaya str., 7. Phone: 7(904) 632-07-27. E-mail: a.v.trofimov@hpb.spb.ru

For citation:

A.V. Trofimov, V.A. Atanesyan, A.M. Ischenko, E.A. Karabanova, A.Ya. Rak, A.S. Simbirtsev, N.B. Gamaleya, A.G. Berzina, N.V. Stankova, G.D. Kapanadze, L.I. Ulyanova, T.A. Klimova "Preparation of polyclonal and monoclonal anti-idiotypic antibodies against morphine-specific immunoglobulins", Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya, 2020, Vol. 22, no. 1, pp. 187-196.

doi: 10.15789/1563-0625-POP-1658 DOI: 10.15789/1563-0625-POP-1658

рующий мышиные моноклональные АЬ2, специфичные к мАт-6G1 (АИ^1), а также клоны, продуцирующие анти-мАт-3К11 антитела (АИ-К11А и АИ-К11В). В исследовании охарактеризованы физико-химические и антигенные свойства всех полученных АЬ2. Показано, что антиидиотипические иммуноглобулины лошади не только относятся к различным классам, но и являются поливалентными по специфичности, в то время как все полученные моноклональные АЬ2 представлены иммуноглобулинами класса ^М и строго специфичны к соответствующим антителам первого поколения. В дальнейшем на клеточной модели будут исследованы морфиноподобные свойства полученных в работе первых отечественных поликлональных и моноклональных АЬ2, а также изучена возможность индукции ими появления антител третьего поколения, как и АЬ1, специфичных к морфину.

Ключевые слова: антиидиотипические антитела, антитела, иммуноферментный анализ, конкурентный анализ, моноклональные антитела, поликлональные антитела, производные морфина

PREPARATION OF POLYCLONAL AND MONOCLONAL ANTIIDIOTYPE ANTIBODIES AGAINST MORPHINE-SPECIFIC IMMUNOGLOBULINS

Trofimov A.V.a, Atanesyan V.A.a, Ischenko A.M.a, Karabanova E.A.a, Rak A.Ya.a' b, Simbirtsev A.S.a, Gamaleya N.B.c, Berzina A.G.c, Stankova N.V.d, Kapanadze G.D.d, Ulyanova L.I.c, Klimova T.A.c

a State Research Institute of Highly Pure Biopreparations, Federal Medical-Biological Agency, St. Petersburg, Russian Federation

b St. Petersburg State University, St. Petersburg, Russian Federation

c V. Serbsky National Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology, Moscow, Russian Federation d National Center of Biomedical Technologies, Federal Medical-Biological Agency, Svetlye gory, Moscow Region, Russian Federation

Abstract. The preparation and study of anti-idiotypic (secondary) antibodies (Ab2) against monoclonal primary antibodies (Ab1) specific to biologically active molecules with a known structure is of great scientific and practical importance. Due to partial antigenic similarity of Ab2 and the initial antigen structures, these antibodies can be the basis of the vaccine, if the antigen usage is not possible, or is limited by law. In particular, one may create Ab2-based preparations, designed for immunization, in order to prevent and treat the drug addiction. The value of Ab2 properties increases even more if Ab1, used to obtain them, recognize different parts of the antigen molecule, which makes it possible to obtain second-generation antibodies with a wide range of specificity. In this work, the morphine-like polyclonal and monoclonal Ab2 were obtained. In each case, as the first-generation immunoglobulins for immunization, we used two murine monoclonal antibodies (mAbs) specific to different morphine derivatives: 3K11 antibodies to 3-0-carboxymethyl (CMM) and 2-p-carboxy-phenylazomethyl (FAM) derivatives, as well as 6G1 antibodies to 6-hemisuccinyl derivative (GSM). After immunization of the horse with Ab1 and development of immune response, three pools of specific polyclonal antibodies were isolated from the animal blood serum: horse anti-species antibodies to the total mouse immunoglobulins (HAM); horse anti-idiotypic antibodies against 3K11 antibodies (HAM-K11), and against 6G1 antibodies (HAM-G1). In parallel, immunization of mice with 3K11 and 6G1 antibodies and fusion of obtained lymphocytes with Sp2/0 mouse myeloma cells by the Milstein-K hler method resulted in three producers of anti-idiotypic antibodies: a clone producing mouse monoclonal Ab2 specific for mAb-6G1 (AI-G1), as well as clones producing anti-mAb-3K11 antibodies (AI-K11A and AI-K11B). The physico-chemical and antigenic properties of all the Ab2 obtained were characterized. It was shown that the horse anti-idiotypic immunoglobulins not only belong to different classes, but are also polyvalent, while all monoclonal Ab2 obtained are represented by IgM immunoglobulins, being also strictly specific to the corresponding first-generation antibodies. Subsequently, the morphine-like properties of the first domestic polyclonal and monoclonal Ab2 obtained in the work will be investigated in a cellular model. Likewise, we shall study their ability to induce Ab3 as well as morphine-specific Ab1.

Keywords: anti-idiotypic antibodies, antibodies, competitive analysis, ELISA, monoclonal antibodies, morphine derivatives, polyclonal antibodies

Введение

Антиидиотипические (вторичные) антитела (Ab2) являются иммуноглобулинами, вырабатывающимися на идиотип, то есть на антигенные детерминанты активных центров первичного антитела (Abi) к определенному антигену (Ag) [5]. По своим свойствам они подразделяются на три типа: Ab2a, Ab2ß и Ab2y. Ab2a взаимодействуют с Ab1, но не блокируют взаимодействие Ab1 с Ag. Антитела Ab2ß несут на себе образ антигена, распознают паратоп или отдельный участок центра связывания Abi и при иммунизации вызывают образование антител следующего поколения (Ab3), которые, подобно Abi, способны распознавать Ag. Наконец, антитела Ab2y способны к взаимодействию с активным центром Abi и блокируют связывание Abi с Ag, но при иммунизации не вызывают образования антител, специфичных к антигену (Ab3). Наибольшую научную и практическую значимость имеют антитела Ab2ß, обладающие уникальными иммунологическими свойствами, в частности способностью индуцировать выработку антител к наркотикам (кокаину и производным морфина) [3, 6, 10].

В то время как поликлональные Ab2-антитела представлены сразу тремя подтипами антиидио-типических антител, моноклональные антитела, являясь по своей природе моноспецифическими, относятся только к одному подтипу. Поэтому сравнительная характеристика влияния различных типов Ab2 на иммунный ответ организма позволяет определить их возможную роль для лечения и профилактики наркотической зависимости.

Целью данного исследования было получение и изучение свойств антиидиотипических поли-клональных и моноклональных антител к полученным ранее моноклональным антителам: 3K11,

распознающему 3-0-карбоксиметильное (КММ) и 2-р-карбокси-фенилазометильное (ФАМ) производные морфина, и 6G1, распознающему 6-ге-мисукцинильное производное (ГСМ) [1].

Материалы и методы

Лабораторные животные и материалы

Работа выполнена с использованием мышей линии Ва1Ь/с (ФГУП «Питомник лабораторных животных Рапполово») и лошади (кобыла породы рысистая, 9 лет, вес 500 кг), которая была предоставлена ФГБНУ ФИЦВиМ (пос. Вольгин-ский, Петушинский район, Владимирская обл.).

Мышиные моноклональные антитела 3К11 и 6G1 были получены по схеме, описанной ранее в работе [1]. Конъюгаты моноклональных и поликлональных антител с пероксидазой хрена (Sigma-Aldrich, Германия) получали по методике [8].

В работе использовались производные морфина: 6-гемисукцинильное (ГСМ), 2-р-карбокси-фенилазометильное (ФАМ) и 3-0-карбокси-метильный эфир (КММ), конъюгированные с бычьим сывороточным альбумином (БСА) и лизоцимом с помощью бифункционального реагента — 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорид. Данные конъюгаты были получены ранее по методикам, описанным в статьях [2, 3].

Получение поликлональных антиидиотипических антител лошади (НАМ-K11 и НАМ^1)

Поликлональные антиидиотипические антитела АЬ2 (НАМ-К11 и НАМ^1) были выделены из гипериммунной сыворотки крови лошади. Схема иммунизации лошади моноклональными мышиными антителами мАт-3К11 и мАт-6G1, специфичными к антигенам — производным морфина - КММ-БСА и ГСМ-БСА соответственно, представлена в таблице 1.

Вводимый антиген Administered antigen Способ введения антигена Antigen administration method

1-я инъекция - 0 день 1st injection - day 0 2-я инъекция - 14-й день 2nd injection - day 14

МАТ 3K11 МАТ 6G1 mAbs 3K11 mAbs 6G1 10 мг антигена в 2 точки в области крупа с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ), в соотношении 1:1 по объему внутримышечно 10 mg of antigen at 2 points in the croup region with Freund's complete adjuvant (FCA), in a ratio of 1:1 by volume intramuscularly 10 мг антигена в 2 точки верхней части шеи с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ), 1:1 подкожно 10 mg of antigen in 2 points of the neck upper part with incomplete Freund's adjuvant (IFA), 1:1 subcutaneously

3-я инъекция - 75-й день 3rd injection - day 75 4-я инъекция - 100-й день 4th injection - day 100

2 мг антигена в 2 точки в области крупа с НАФ (1:1) внутримышечно 2 mg of antigen at 2 points in the croup region with FCA (1:1) intramuscularly 2 мг антигена в 2 мл физиологического раствора внутривенно 2 mg of antigen in 2 ml of saline intravenously

ТАБЛИЦА 1. СХЕМА ИММУНИЗАЦИИ ЛОШАДИ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИИДИОТИПИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ Ab2

TABLE 1. SCHEDULE OF HORSE IMMUNIZATION TO OBTAIN ANTI-IDIOTYPIC Ab2 ANTIBODIES

АЬ2-антитела выделяли с помощью аффинной хроматографии на иммуносорбенте, приготовленном на основе циан-бром-активированной сефарозы 4B (Sigma-Aldrich) по модифицированной методике [4]. В качестве лиганда использовались тотальные иммуноглобулины (Ig) мыши класса G, моноклональные антитела 3K11 или 6G1.

На первом этапе выделения АЬ2-антител сыворотку лошади истощали от антивидовых антител. Для этого лошадиную сыворотку пропускали через сорбент с иммобилизованными IgG мыши, уравновешенный 20 мМ фосфатно-солевым буфером, рН 7,4 (ФСБ). После нанесения образца колонку промывали пятью объемами уравновешивающего буфера. Далее для удаления неспецифически связавшихся белков через колонку пропускали один объем ФСБ, содержащего 1 М NaCl, после чего вновь уравновешивали колонку ФСБ и проводили элюцию раствором 0,1 М глицина, рН 2,5, при скорости потока 1 мл/мин. В ходе хроматографии пики детектировали при длине волны 280 нм. Полученный элюат нейтрализовали до рН 7,2-7,4. Концентрацию белка в элюате измеряли спектрофотометрически при длине волны 280 нм с учетом коэффициента молярной экстинции 1,4.

По результатам ИФА, когда остаточный титр антивидовых антител НАМ составлял не более 0,1% от исходного, истощенную сыворотку наносили последовательно на сорбенты с иммобилизованными мАт 3K11 и мАт 6G1. Выделение антиидиотипических антител НАМ-К11 и НАМ-G! методом аффинной хроматографии проводили по той же схеме, что и при выделении антивидовых антител НАМ.

Получение моноклональных антиидиотипических антител

Мышей линии Balb/c иммунизировали конъ-югатами гемоцианина лимфы улитки, конъгиро-ванными с моноклональными антителами 3K11 и 6G1, приготовленными по ранее описанной методике [8]. Для этого эмульгированный в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ) антиген в дозе 10 мкг на мышь вводили в подошвенный апоневроз задних конечностей. На 30-й день после иммунизации животным вводили внутривенно 5 мкг мАт 3K11 или 6G1 в физиологическом растворе. На 4-й день после инъекции животных умерщвляли цервикальной дислокацией и выделяли спленоциты и лимфоциты паховых и брюшных лимфоузлов. Полученные клетки смешивали с клетками миеломы мыши линии SP 2/0 в соотношении 2:1. Гибридизацию клеток проводили 50% раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массой 1500 дальтон в течение 1,5 мин с последующим 4-кратным добавлением через 1 мин среды RPMI-1640 в объеме, равном объему раствора ПЭГ. После слияния клетки дважды отмывали культуральной средой и высевали

в 96-луночные культуральные планшеты с суточными перитонеальными макрофагами (5 х 103 клеток на лунку) из расчета 5 х 104 клеток на лунку по миеломе. Селекцию гибридов проводили в среде RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Sigma, США), содержащей: 10-4 М гипоксантина, 4 х 10-7 М аминоптерина и 1,6 х 10-5 М тимидина [9]. Полученные анти-идиотипические моноклональные антитела были обозначены как АИ-К11А, АИ-К11Б и АИ-GL

Иммуноферментный анализ (ИФА)

Первичный отбор позитивных клонов проводили по связыванию секретируемых антител с мАт 3K11 или 6G1. Для этого в лунки полисти-рольных планшетов Corning (Sigma, США) в посадочном буфере (20 мМ боратный буфер, рН 8,0, содержащий 0,15 М NaCl) адсорбировали мАт К-11 или 6G1 с концентрацией 1,5 мкг/мл в течение 20 часов во влажной камере при комнатной температуре. По окончании сорбции планшеты отмывали промывочным буфером (посадочный буфер, содержащий 0,05% Tween-20). В лунки вносили 100 мкл промывочного буфера, содержащего 10% мышиной сыворотки, и 50 мкл культуральной среды. Планшеты инкубировали 1 час при перемешивании при 37 °С. Затем в промытый планшет вносили раствор конъюгатов 3К11-пероксидаза или 6G1-пероксидаза в концентрации 100 нг/мл. Планшеты инкубировали в течение 1 часа при перемешивании при 37 °С, после чего тщательно отмывали и проводили окрашивание с помощью раствора субстрата те-траметилбензидина (XEMA, Россия).

Культуральная среда клонов, показавшая специфическое связывание, повторно проверялась в конкурентном анализе по отмене связывания конъюгатов 3К11-пероксидаза или 6G1-пероксидаза с антигенами КММ-БСА или ГСМ-БСА, соответственно, в присутствии культуральной среды позитивных клонов. Для этого в лунки планшетов для ИФА сорбировали антигены в концентрации 5 мкг/мл. После отмывки в ячейки вносили по 50 мкл культуральной среды позитивных клонов и 50 мкл растворов конъюгатов 3К11-пероксидаза или 6G1-пероксидаза в концентрации 100 нг/мл. По отмене связывания конъюгатов с антигеном судили об антиидиотипической специфичности отобранных клонов.

Аналогичные схемы ИФА применялись для определения специфичности выделенных по-ликлональных и моноклональных АЬ2-антител. Определение изотипа мАт проводили с помощью набора kit ISO-2 (Sigma-Aldrich) по методике производителя.

Позитивные клоны реклонировали для отбора стабильных продуцентов и криоконсервировали.

Моноклональные антитела отобранных позитивных клонов нарабатывали в перитонеальной полости сингенных мышей (BALB/C). Для это-

го внутрибрюшинно вводили 2-3 х 106 клеток на мышь. На 14-20-й день мышей умерщвляли цервикальной дислокацией и отбирали асцитную жидкость, из которой выделяли мАт с помощью аффинной хроматографии на сорбентах 3K11-сефароза или 6G1-сефароза.

Электрофорез

Денатурирующий электрофорез белков в по-лиакриламидном геле осуществляли по ранее описанной методике [11]. В работе использовался разделяющий гель с градиентной концентрацией акриламида 4-20% и концентрирующий гель с концентрацией акриламида 5%. Результаты электрофореза визуализировали с помощью стандартного окрашивания раствором Кумасси G-250.

Иммуноблоттинг

В ряде случаев анализ результатов электрофо-ретического разделения проводили с помощью вестерн-блоттинга по стандартному протоколу [7]. Для переноса белков использовали буферный раствор, содержащий 47,9 мМ Трис-HCl, 38,6 мМ глицина и 20% метанола, и нитроцел-люлозную мембрану с диаметром пор 0,45 мкм. Перенос проводили в течение 1 часа при силе тока 350 мА, после чего мембрану инкубировали в блокирующем растворе (2% БСА в ФБ) в течение ночи при +4 °С. Затем вносили раствор первичных антител, поликлональных или моно-клональных в концентрации 5 мкг/мл в блокирующем растворе. После часовой инкубации и двукратной отмывки мембрану также в течение часа обрабатывали раствором антивидового пероксидазного конъюгата антител козы против иммуноглобулинов мыши или лошади (Sigma, США) с концентрацией 0,5 мкг/мл. Для проявления окрашивания использовали 0,05% раствор диаминобензидина (Sigma, США) в ФБ, содержащий 1% диметилсульфоксида (Sigma, США) и 1% перекиси водорода (НеваРеактив, Россия).

Результаты

На рисунке 1 представлена схема фракционирования лошадиной сыворотки.

На первом этапе выделения Ab2-антител проводили истощение сыворотки от антивидовых антител лошади к иммуноглобулинам мыши. Для этого сыворотку трижды пропускали через сорбент IgG-мыши-сефароза, содержание специфических антител контролировали на каждом этапе ИФА. После того, когда содержание элюированных антивидовых антител составило менее 0,1% от суммарного, образец истощенной сыворотки последовательно пропускали через сорбенты 3Ю1-сефароза и 6G1-сефароза.

В таблице 2 представлены концентрации по-ликлональных антивидовых НАМ и антиидио-типических антител НАМ-KH и НАМ-G!, вы-

Рисунок 1. Схема выделения антивидовых и антиидиотипических поликлональных антител из сыворотки лошади

Примечание. Антивидовые антитела НАМ*, НАМ**, НАМ*** - первая, вторая и третья стадии выделения; антиидиотипические антитела НАМ-К11 и НАМ-GI.

Figure 1. Scheme for the isolation of anti-species and anti-idiotypic polyclonal antibodies from horse serum Note. Anti-species antibodies HAM*, HAM**, HAM***, the first, second and third stages of isolation; anti-idiotypic antibodies HAM-K11 and HAM-G1.

ТАБЛИЦА 2. СОДЕРЖАНИЕ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИВИДОВЫХ АНТИТЕЛ НАМ И АНТИИДИОТИПИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ НАМ-К11 И НАМ-GI В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЛОШАДИ

TABLE 2. CONTENT OF POLYCLONAL ANTI-SPECIES HAM ANTIBODIES AND ANTI-IDIOTYPIC HAM-K11 AND HAM-G1 ANTIBODIES IN A HORSE SERUM

Антитела мг

Antibodies mg

НАМ* 192 77,73

НАМ** 37 14,98

НАМ*** 0,4 0,16

НАМ-К11 6,78 2,74

НАМ-GI 10,8 4,37

Примечание. НАМ* - первая стадия истощения, НАМ** -вторая стадия истощения, НАМ*** - третья стадия истощения.

Note. НАМ*, the first stage of absorption; НАМ**, the second stage of absorption; НАМ***, the third stage of absorption.

деленных из 100 мл сыворотки лошади на всех этапах истощения, и их процентный состав.

Для определения специфичности выделенных антител в планшеты с сорбированными IgG мыши, мАт 3K11 или мАт 6G1 вносили се-

ГО o^

m _

SÜ

-o . E

О O)

o ¡=

H

o m

X

Ш

120 100 80 60 40 20 0

'НАМ НАМ-К11 i HAM-G1

IgG мыши MAT 3K11 MAT 6G1 mouse Ig mAbs 3K11 mAbS 6G1

Сорбированные на планшет антитела Immobilized antibodies

Рисунок 2. Сравнительная характеристика специфичности поликлональных антител НАМ, НАМ-К11 и НАМ-GI

Figure 2. Comparative characteristics of the polyclonal antibodies НАМ, НАМ-К11 and НАМ-GI specificity

А (А)

-АИ-GI AI-G1 ■АИ-К11А AI-K11A ■АИ-К11В AI-K11B

0,0625 0,25 1

16 64

Концентрация антител АЬ2, нг/мл Ab2 concentration, ng/ml

Б (B)

4

Q

О

2,5 2 1,5 1

0,0625 0,25 1

-АИ-GI AI-G1 ■АИ-К11А AI-K11A "АИ-К11В AI-K11B

16 64

Концентрация антител Ab2, нг/мл Ab2 concentration, ng/ml

Рисунок 3. Определение специфичности моноклональных АЬ2-антител АИ-GI, АИ-К11А и АИ-К11В

Примечание. А - анализ в планшете с сорбированными мАт 3К11 и конъюгатом 3К11-пероксидаза. Б - анализ в планшете с сорбированными мАт 6G1 и конъюгатом 601-пероксидаза.

Figure 3. Determination of the specificity of monoclonal Ab2 antibodies AI-G1, AI-K11A and AI-K11B Note. A, analysis in a plate with immobilized mAb-3K11 and conjugate 3K11-peroxidase. B, analysis in a plate with immobilized mAbs-6G1 and conjugate 6G1-peroxidase.

2,5

2

НАМ-К11

S 1 5" 5 НАМ-Г1

4

HAM-G1

о

о

1 АИ-Г1

AI-G1

1

0,5 1

ft

г

0 5 10 15 20 25 30

Концентрация Ab2 антител, мкг/мл Ab2 concentration, pg/ml

Рисунок 4. Конкурентный анализ АЬ2-антител на сорбированном производном морфина ГСМ-БСА

Figure 4. Competitive analysis of Ab2 antibodies using the immobilized GSM-BSA morphine derivative

1,6 1,4 1,2 1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

5 4

Q

О

HAM-G1 HAM-K11 MAT АИ-К11А mAbs AI-K11A . MAT АИ-К11В mAbs AI-K11B

0 5 10 15 20 25 30

Концентрация Ab2 антител, мкг/мл Ab2 concentration, pg/ml

Рисунок 5. Конкурентный анализ АЬ2-антител на сорбированном производном морфина КММ-БСА

Figure 5. Competitive analysis of Ab2 antibodies using the immobilized KMM-BSA morphine derivative

рии двукратных разбавлений НАМ, НАМ-К11 и НАМ^1. На последней стадии анализа планшеты инкубировали с антивидовым пероксидаз-ным конъюгатом. По результатам ИФА для всех антител была построена калибровочная кривая зависимости оптической плотности при длине волны 450 нм от их концентрации. С их помощью были определены концентрации, при которых наблюдалось 50% связывание антител при условии, что препарат с минимальной концентрацией иммуноглобулина обладает 100% специфичностью. По соотношению минимальной концентрации иммуноглобулина и концентрации антител в исследуемых препаратах в точке, соответствующей 50% интенсивности связывания, рассчитывали процент специфичности. На рисунке 2 представлены полученные результаты.

Определение изотипа мышиных моноклональных АЬ2-антител отобранных клонов показало, что все они являются иммуноглобулинами класса ^М.

4

4

Определение специфичности антиидио-типических моноклональных антител проводили в планшетах с сорбированными мАт 3K11 или 6G1. В ячейки вносили приготовленные концентрационные разбавления Ab2-антител: АИ-G^ АИ-Ю1А и АИ-Ю1В. После инкубации в лунки вносили раствор конъюгата пероксида-зы с антителами, аналогичными тем, что сорбированы в планшете. На рисунке 3 представлены данные по определению специфичности полученных антител.

Для определения антиидиотипической специфичности полученных поликлональных и моноклональных Ab2-антител был проведен конкурентный ИФА. В планшете сорбировали производные морфина ГСМ-БСА или КММ-БСА в концентрации 5 мкг/мл. На следующей стадии вносили пробы с разными концентрациями исследуемых антител в промывочном буфере, содержащем 10% мышиной сыворотки и 100 нг/мл коньгата 6G1-пероксидаза или 3K11-пероксидаза соответственно. На рисунках 4 и 5 представлены результаты анализа в планшетах с сорбированными конъюгатами ГСМ-БСА и КММ-БСА соответственно.

В таблице 3 приведены молярные соотношения взаимодействия поликлональных и моно-клональных Ab2-антител с конъюгатами 3K11-пероксидаза и 6G1-пероксидаза, при которых наблюдается 50% подавление связывания конъ-югатов с антигенами КММ-БСА и ГСМ-БСА соответственно.

На рисунке 6 представлены электрофоре-граммы аффинно выделенных поликлональных антимышиных НАМ и Ab2 НАМ-Ю1 и НАМ-G! антител.

ТАБЛИЦА 3. МОЛЯРНОЕ СООТНОШЕНИЕ АЬ2-АНТИТЕЛ ПРИ 50% ПОДАВЛЕНИИ СВЯЗЫВАНИЯ КОНЪЮГАТОВ К11-Пх И Gl-Пх С ПРОИЗВОДНЫМИ МОРФИНА

TABLE 3. MOLAR RATIO OF Ab2 ANTIBODIES FOR 50% INHIBITION OF THE BINDING OF K11-Px AND G1-Px CONJUGATES TO MORPHINE DERIVATIVES

Конкуратор Competitor 3К11-Пх 3K11-Px 6G1^x 6G1-Px

НАМ - -

НАМ-К11 1,35 -

НАМ-GI - 1,25

аи-GIA AI-G1A - 1,46

АИ-К11А AI-K11A 50,01 -

АИ-К11В AI-K11B 4,09 -

Примечание. Подавления не наблюдается.

Note. Inhibition is not observed.

+

А Б В А Б В

A B C A B C

Рисунок 6. Электрофореграммы поликлональных антител НАМ, НАМ-К11 и НАМ-GI (нагрузка белка 5 мкг на дорожку градиентного денатурирующего геля) Примечание. Поликлональные антитела лошади: А -антимышиные антитела НАМ; Б - антиидиотипические антитела НАМ-К11; В - антиидиотипические антитела НАМ-GI; «+» - восстанавливающие и «-» - невосстанавливающие условия.

Figure 6. Electrophoregrams of polyclonal antibodies НАМ, НАМ-К11 and НАМ-GI (protein loading 5 цд per track of denaturing gradient gel)

Note. Horse polyclonal antibodies: A, HAM anti-mouse antibodies; B, anti-idiotypic antibodies HAM-K11; C, anti-idiotypic antibodies HAM-G1; "+", reducing and "-", non-reducing conditions.

+

» r—-

225

150 * •

102 76 52 38 31 24

1=1- ftf M ШЩ

17 12

»_

А Б В А Б В

A B C A B C

Рисунок 7. Электрофореграммы моноклональных антител АИ-GI, АИ-К11А и АИ-К11В (нагрузка белка 5 мкг на дорожку градиентного денатурирующего геля) Примечание. Моноклональные антиидиотипические антитела мыши: А - АИ-G^ Б - АИ-К11А; В - АИ-К11В; «+» -восстанавливающие и «-» - невосстанавливающие условия Figure 7. Electrophoregrams of monoclonal antibodies AI-G1, AI-K11A and AI-K11B (protein loading 5 ^g per track of denaturing gradient gel)

Note. Mouse monoclonal anti-idiotypic antibodies: A, AI-G1; B, AI-K11A; C, AI-K11B; "+" reducing and "-", non-reducing conditions.

ЩПШ

225 Nil

76 52 38 24 17

АИ-GI AI-G1

АИ-К11А АИ-К11В AI-K11A AI-K11B

АИ-GI АИ-К11А АИ-К11В AI-G1 AI-K11A AI-K11B

170

56 27

170

56

+ - +

мАт 6G1 mAbs 6G1

+ - +

мАт ЗК11 mAbs 3K11

Рисунок 8. Результат вестерн-блот анализа связывания мышиных моноклональных антиидиотипических антител АИ-G^ АИ-К11А и АИ-К11В с мАт 6G1 и 3К11 (нагрузка белка 1 мкг на дорожку градиентного денатурирующего геля) Примечание. «+» - восстанавливающие и «-» -невосстанавливающие условия.

Figure 8. Result of a Western blot analysis of mouse monoclonal anti-idiotypic antibodies AI-G1, AI-K11A and AI-K11B binding with mAbs 6G1 and 3K11 (protein loading 1 |ig per track of denaturing gradient gel) Note. "+" reducing and "-", non-reducing conditions.

HAM-G1

НАМ-К11 Г •

HAM-G1 НАМ-К11

170

мАт 6G1 mAbs 6G1

мАт ЗК11 mAbs 3K11

Рисунок 9. Результат вестерн-блот анализа связывания

поликлональных антиидиотипических антител лошади

НАМ-К11 и НАМ^1 с мАт 6G1 и 3К11 (нагрузка белка

1 мкг на дорожку градиентного денатурирующего геля)

Примечание. «+» - восстанавливающие и «-» -

невосстанавливающие условия.

Figure 9. Result of a Western blot analysis of horse polyclonal

anti-idiotypic antibodies НАМ-К11 and НАМ-GI binding

with mAbs 6G1 and 3K11 (protein loading 1 |ig per track of

denaturing gradient gel)

Note. "+" reducing and "-", non-reducing conditions.

На рисунке 7 представлены электрофоре-граммы моноклональных АЬ2-антител АИ^1, АИ-К11А и АИ-К11В.

На рисунке 8 представлен результат вестерн-блот анализа связывания моноклональных АЬ2-антител АИ^1, АИ-К11А и АИ-К11В с мАт 6G1 и 3К11.

На рисунке 9 представлен результат анализа связывания поликлональных АЬ2-антител лошади НАМ-К11 и НАМ^1 с мАт 6G1 и 3К11 методом вестерн-блоттинга.

Обсуждение

Как видно из результатов, представленных на рисунке 2, использование предложенной схемы аффинного фракционирования сыворотки лошади, иммунизированной иммуноглобулинами 3К11 и 6G1, впервые позволило выделить три пула специфических антител: антивидовые АЬ1-антитела НАМ, которые, разумеется, одинаково связываются со всеми сорбированными IgG мыши в твердофазном ИФА; АЬ2-антитела НАМ-К11 и НАМ^1, специфичные только к мАт-3К11 и мАт-6G1 соответственно. Тот факт, что полученные АЬ2-антитела являются поли-клональными, заставляет предположить их гетерогенность по антиидиотипическим свойствам, то есть присутствие в каждом пуле АЬ2а, АЬ2р и АЬ2у типов АЬ2-антител. Кроме того, иммунизация мышей мышиными иммуноглобулинами к производным морфина впервые позволила получить к ним мышиные антиидиотипические антитела. Анализ данных, приведенных на рисунке 3, показал, что АИ^1, АИ-К11А и АИ-К11В специфичны только к своим мАт, при этом специфичность антител АИ-К11В выше, чем АИ-К11А.

Как видно из результатов, представленных на рисунках 4, 5 и в таблице 3, антитела НАМ^1 и АИ^1А подавляют связывание конъюгата 6G1-Пх с ГСМ-БСА. При этом 50% точка подавления связывания близка к их эквимоляр-ному соотношению, что указывает на высокую специфичность процесса конкуренции идио-тип — антиидиотип. В то же время эти антитела не подавляют связывание конъюгата 3К11-Пх с КММ-БСА. Антитела НАМ-К11, а также АИ-К11А и АИ-К11В имеют другую антиидио-типическую специфичность, подавляя связывание конъюгата 3К11-Пх с КММ-БСА и не подавляя связывание конъюгата 6G1-Пх с ГСМ-БСА. НАМ-К11 имеет более высокую специфичность, чем АИ-К11В. 50% точка подавления связывания 3К11-Пх с КММ-БСА для АИ-К11А наблюдается только при 50-кратном избытке.

На рисунке 6 представлены электрофоре-граммы трех фракций поликлональных антител лошади. Электрофоретический профиль аф-финно выделенных антител, имеющий разную

+

+

+

+

+

- +

специфичность, практически полностью совпадает. Наличие двух полос тяжелой цепи в восстановленных условиях и присутствии иммуноглобулинов с молекулярной массой более 225 кДа указывает на то, что, несмотря на длительную иммунизацию животных, в сыворотке лошади циркулируют не только IgG-иммуноглобулины, но и IgM.

По результатам изотипирования все полученные мАт относятся к классу IgM, что согласуется с данными электрофореза АИ^1, АИ-Ю1А и АИ-Ю1В (рис. 7). Обсчет показал, что молекулярная масса основной части препарата в не-восстанавливающих условиях составляет около 800 кДа, то есть представлена пентамером иммуноглобулина класса IgM.

По результатам проведенного вестерн-блот анализа, представленным на рисунке 8, видно, что мАт АИ^1 распознают не только молекулу антитела 6G1 с молекулярной массой 160 кДа, но и его тяжелую и легкую цепи, которые участвуют в формировании идиотипа, ответственного за связывание с АИ^1, и не распознают мАт 3Ю1. АИ-Ю1А и АИ-Ю1В связывают цельную молекулу антитела 3Ю1 и его тяжелую цепь. По результатам анализа методом вестерн-блот-

тинга (рис. 9) поликлональные Ab2-антитела НАМ-KH способны к распознаванию нефраг-ментированной молекулы мАт 3K11. Вполне возможно, что лошадиные Ab2-антитела по причине своей поликлональности распознают конформа-ционные детерминанты антиопиатных антител, которые в случае SDS-фореза в восстанавливающих условиях теряют свои антигенные свойства.

Таким образом, в результате проведенной работы были впервые получены и охарактеризованы поликлональные и моноклональные антиидиотипические Ab2-антитела к морфин-специфическим иммуноглобулинам. В ходе дальнейшей работы будет исследовано влияние полученных Ab2-антител на синтез ДНК в клетках глиобластомы человека линии T98G in vitro и проведено сравнение их биологического эффекта с действием морфина и налоксона. Также планируется проверить, обладают ли Ab2 свойствами вакцины, то есть способностью индуцировать появление антител, способных связывать производные морфина, при иммунизации ими животных. Будет также изучена возможность применения Ab2-антител в разработке тест-систем по определению антител, специфичных к опиатам.

Список литературы / References

1. Берзина А.Г., Гамалея Н.Б., Сергеева В.Е., Трофимов А.В., Кротов Г.И., Ульянова Л.И. Получение поли-клональных и моноклональных антител к двум производным морфина // Вопросы наркологии, 2016. № 1112. С. 39-54. [Berzina A.G., Gamaleya N.B., Sergeeva V.E., Trofimov A.V., Krotov G.I., Ulyanova L.I. Production of polyclonal and monoclonal antibodies against two morphine derivatives. Voprosy narkologii = Journal of Addiction Problems, 2016, no. 11-12, pp. 39-54. (In Russ.)]

2. Берзина А.Г., Гамалея Н.Б., Ульянова Л.И, Шестаков К.А., Ульянова М.А., Капанадзе К.Д., Стан-кова Н.В., Ревякин А.О., Фокин Ю.В., Кротов Г.И., Родченков Г.М. Методологические подходы к разработке вакцины для лечения зависимости от опиатов // Наркология, 2015. № 11. С. 25-31. [Berzina A.G., Gamaleya N.B., Ulyanova L.I., Shestakov K.A., Ulyanova M.A., Kapanadze G.D., Stankova N.V., Revyakin A.O., Fokin Yu.V., Krotov G.I., Rodchenkov G.M. Methodological approaches to development of a vaccine for the treatment of opiate dependence. Narkologiya = Narcology, 2015, no. 11, pp. 25-31. (In Russ.)]

3. Гамалея Н.Б., Берзина А.Г., Ульянова Л.И. Методологические основы создания вакцины для иммунотерапии зависимости от опиатов // Вопросы наркологии, 2017. № 4-5. С. 32-56. [Gamaleya N.B., Berzina A.G., Ulyanova L.I. Methological bases for creating a vaccine for immunotherapy of opioid use disorder. Voprosy narkologii = Journal of Addiction Problems, 2017, no. 4-5, pp. 32-56. (In Russ.)]

4. Кулаев Д.В., Насибов С.М., Маркин С.С., Бобков Ю.Г., Семенов М.П. Хроматографический способ выделения альфа-фетопротеина. Патент на изобретение RU № 2094078, 1997. [Kulaev D.V., Nasibov S.M., Markin S.S., Bobkov Yu.G., Semenov M.P. Chromatografic method of alfa-fetoprotein isolation. Patent RU 2094078, 1997].

5. Jerne N.K., Cocteau J. Idiotypic networks and other preconceived ideas. Immunol. Rev., 1984. Vol. 79, no. 1, pp. 5-24.

6. Ho M., Segre M. Inhibition of cocaine binding to the human dopamine transporter by a single chain anti-idiotypic antibody: its cloning, expression, and function properties. BBA, 2003, Vol. 1638, no. 3, pp. 257-266.

7. Mahmood T., Yang P.C. Western blot: technique, theory, and troubleshooting. N. Am. J. Med. Sci., 2012, Vol. 4, no. 9, pp. 429-434.

8. Hermanson G.T. Bioconjugate techniques. Academic Press, 2008. 1323 p.

9. Pandey S. Hybridoma technology for production of monoclonal antibodies. Int. J. Pharm. Sci. Res., 2010, Vol. 1, no. 1, pp. 88-94.

10. Schabacker D.S., Kirschbaum K.S., Serge M. Exploring the feasibility of an anti-idiotypic cocaine vaccine: analysis of the specificity of anticocaine antibodies (Ab1) capable of inducing Ab2p anti-idiotypic antibodies. Immunology, 2000, Vol. 100, no. 1, pp. 48-56.

11. Walker J.M. Gradient SDS polyacrylamide gel electrophoresis. In: Methods in Molecular Biology, Vol. 1. Proteins. Ed. Clifton N.J. Humana Press, Inc., 1984, pp. 57-61.

Авторы:

Трофимов А.В. — руководитель группы лаборатории биохимии белка ФГУП«Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия

Атанесян В.А. — старший научный сотрудник лаборатории биохимии белка ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия

Ищенко А.М. — к.б.н., заведующий лабораторией биохимии белка ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия

Карабанова Е.А. — инженер лаборатории биохимии белка ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия

Рак А.Я. — младший научный сотрудник лаборатории биохимии белка ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России; аспирант ФГБОУ ВО «Санкт-Петербургский государственный университет», Санкт-Петербург, Россия

Симбирцев А.С. — д.м.н., профессор, член-корр. РАН, научный руководитель ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия

Гамалея Н.Б. — д.м.н., профессор, заведующая лабораторией иммунохимии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр психиатрии и наркологии имени В.П. Сербского» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия Берзина А.Г. — к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории иммунохимии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр психиатрии и наркологии имени В.П. Сербского» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия Станкова Н.В. — к.б.н., заведующая лабораторией спортивной медицины и экстремальных состояний ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия

Капанадзе Г.Д. — д.б.н., начальник научно-организационного отдела ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий» ФМБА России, п. Светлые горы, Красногорский район, Московская обл., Россия

Ульянова Л.И. — д.б.н., ведущий научный сотрудник лаборатории иммунохимии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр психиатрии и наркологии имени В.П. Сербского» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия Климова Т.А. — к.б.н., научный сотрудник лаборатории иммунохимии ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр психиатрии и наркологии имени В.П. Сербского» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия

Поступила 12.03.2019 Отправлена на доработку 30.10.2019 Принята к печати 01.11.2019

Authors:

Trofimov A.V., Head of a Research Group, Laboratory of Protein Biochemistry, State Research Institute of Highly Pure Biopreparations, Federal Medical-Biological Agency, St. Petersburg, Russian Federation

Atanesyan V.A., Senior Research Associate, Laboratory of Protein Biochemistry, State Research Institute of Highly Pure Biopreparations, Federal Medical-Biological Agency, St. Petersburg, Russian Federation

Ischenko A.M., PhD (Biology), Head, Laboratory of Protein Biochemistry, State Research Institute of Highly Pure Biopreparations, Federal Medical-Biological Agency, St. Petersburg, Russian Federation

Karabanova E.A., Engineer, Laboratory of Protein Biochemistry, State Research Institute of Highly Pure Biopreparations, Federal Medical-Biological Agency, St. Petersburg, Russian Federation

Rak A.Ya., Junior Research Associate, Laboratory of Protein Biochemistry, State Research Institute of Highly Pure Biopreparations, Federal Medical-Biological Agency; Postgraduate Student, St. Petersburg State University, St. Petersburg, Russian Federation

Simbirtsev A.S., PhD, MD (Medicine), Professor, Corresponding Member, Russian Academy of Sciences, Research Director, State Research Institute of Highly Pure Biopreparations, Federal Medical-Biological Agency, St. Petersburg, Russian Federation Gamaleya N.B., PhD, MD (Medicine), Professor, Head, Immunochemistry Laboratory, V. Serbsky National Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology, Moscow, Russian Federation

Berzina A.G., PhD (Biology), Senior Research Associate, Immunochemistry Laboratory, V. Serbsky National Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology, Moscow, Russian Federation

Stankova N.V., PhD (Biology), Head, Laboratory of Sports Medicine and Extreme Conditions, National Center of Biomedical Technologies, Federal Medical-Biological Agency, St. Petersburg, Russian Federation

Kapanadze G.D., PhD, MD (Biology), Head, Scientific Organization Department, National Center of Biomedical Technologies, Federal Medical-Biological Agency, Svetlye gory, Moscow Region, Russian Federation

Ulyanova L.I., PhD, MD (Biology), Leading Research Associate, Immunochemistry Laboratory, V. Serbsky National Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology, Moscow, Russian Federation

Klimova T.A., PhD (Biology), Research Associate, Immunochemistry Laboratory, V. Serbsky National Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology, Moscow, Russian Federation

Received 12.03.2019 Revision received 30.10.2019 Accepted 01.11.2019