CC BY
72
НАНОБИОТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИКАНЦЕРОГЕННОЙ ВАКЦИНЫ
С.В. Апалько1, А.Н. Глушков1, , М.Л. Филипенко2, В.А. Матвеева2, Е.А. Храпов2, М.В. Костянко1'3 1 Институт экологии человека СО РАН, Кемерово, Россия, apalko@ngs.ru 2Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,
Новосибирск, Россия 3Кемеровский государственный университет, Кемерово, Россия
В данной работе описан новый подход к созданию пептида с внутренним иммунологическим образом канцерогена. Для этого были получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела (мАТ) В2 против бензо[а]пирена (БП), а также поликлональные АТ моноспецифические к БП. С помощью технологии фагового дисплея были селектированы клоны рекомбинантных бактериофагов, презентирующих пептид, специфично связывающийся с мАТ В2 и поликлональными АТ к БП. Иммуногенные свойства пептида подтверждены в эксперименте in vivo, после иммунизации мышей специфическим клоном фага в сыворотке крови животных обнаружены АТ против БП. Аминокислотная последовательность рекомбинантного пептида была идентична у всех полученных клонов. Таким образом, искомый пептид содержит в себе иммунологический образ БП и может рассматриваться как кандидат для антиканцерогенной вакцины.
Общепризнано, что 80 - 90% случаев онкологических заболеваний человека обусловлено действием факторов окружающей среды и особенностями образа жизни. Контакт человека с наноразмерными частицами (пыль, сажа) может приводить к повреждению поверхностного эпителия органов дыхания, желудочно-кишечного тракта, кожи с дальнейшим развитием заболеваний, в том числе онкологических. Опасность наночастиц может усугубляться тем, что на их поверхности могут быть адсорбированы низкомолекулярные органические соединения. Если таковыми соединениями являются химические канцерогены, то риск возникновения злокачественных опухолей под действием такого комплекса значительно возрастает. Это связано с тем, что канцерогены, адсорбированные на поверхности твердых частиц, например, сажи, действуют на живые клетки сильнее, чем те же канцерогены в чистом виде. В первую очередь это относится к бензо[а]пирену (БП).
Анализ известных литературных данных [1, 2] и результаты собственных исследований [3, 4] дают основание утверждать, что индукция специфического иммунного ответа против химических канцерогенов с помощью специальных вакцин теоретически должна приводить к угнетению их повреждающего действия. Кроме того, такие вакцины будут полезны для снижения онкологического риска при сочетанном воздействии наночастиц и химических канцерогенов.
До настоящего времени наиболее подходящими кандидатами на роль антиканцерогенной вакцины можно было рассматривать моноклональные антиидиотипические антитела к химическим канцерогенам [5]. Они не содержат в своем составе канцерогена и в то же время несут в себе так называемый его «внутренний иммунологический образ» и поэтому способны индуцировать синтез соответствующих анти-канцерогенных антител (АТ). В эксперименте показано, что моноклональные антиидиотипические АТ к БП тормозят появление и рост опухолей, индуцированных этим канцерогеном. Однако, производство подобного рода препаратов ограничено технико-экономическими трудностями, а применение - неизбежно сопровождается появлением сопутствующих АТ против видовых, аллогенных и изотипических эпитопов, развитием нежелательных аллергических реакций и др. осложнений.
Один из путей преодоления этих проблем состоит в использовании пептидов, имитирующих иммуногенные свойства конъюгатов канцероген-белок. Стремительное развитие нанобиотехнологий раскрывает принципиально новый
подход к созданию анти-канцерогенных вакцин с использованием фаговых пептидных библиотек. При этом можно получить пептиды-иммуномиметики химических канцерогенов, которые не содержат ни канцерогена, способного индуцировать возникновение опухоли, ни сопутствующих антигенных детерминант, способных вызвать побочные патологические осложнения.
Задачей данной работы является получение при помощи технологии фагового дисплея пептида-иммуномиметика БП и исследование его иммунологических свойств в in vitro и in vivo экспериментах.
Аффинную селекцию фаговых клонов, презентирующих специфические пептиды, проводили в ходе трех последовательных раундов аффинной селекции. Процедура биопеннинга представляла собой инкубацию исходной библиотеки с моноклональными АТ против БП (мАТ В2), отмывку несвязавшихся и элюцию связавшихся с АТ бактериофагов.
Для получения высокоаффинных пептидов в данной работе использовали перекрестное картирование АТ в третьем раунде биопеннинга. Популяцию рекомбинантных бактериофагов, полученную после второго раунда биопеннинга с мАТ В2, в третьем раунде наносили как на моно-, так и на поликлональные АТ. Популяцией, элюированной с поликлональных АТ, также картировали как моно-, так и поликлональные АТ. Такой подход позволил исключить обычно применяемые процедуры предварительного истощения исходной библиотеки на IgG интактных мыши и кролика, а также повысить вероятность выделения клонов фагов, содержащих искомые пептиды, специфичные к активному центру АТ против ПАУ.
Полученные после каждого раунда аффинной селекции популяции рекомбинантных бактериофагов, а также исходная пептидная фаговая библиотека были протестированы в ИФА на способность связываться с мАТ В2, а также с IgG интактной мыши. Результаты тестирования (рис.1) показали значительное увеличение интенсивности окрашивания при связывании с АТ фаговой популяции, полученной после третьего раунда аффинной селекции.
Рис. 1. Связывание фаговых популяций с мАТ В2 после каждого раунда биопеннинга.
После трех раундов биопеннинга было отобрано 40 индивидуальных клонов (по 10 клонов из каждой комбинации: мм3, мп3, пп3, пм3), которые были проскринированы на способность связываться с мАТ В2 в ИФА. В результате было выявлено 5 положительных клонов (2мм, 2мп, 4мп, 6мп, 9мп) (рис.2).
А45С
11 10 9 8 7 6
10 10 10 10 10 10
кое/лунка
Рис. 2. Связывание положительных клонов с мАТ В2 (клоны 2 мп и 4 мп имели схожую картину связывания, данные не представлены).
Установили, что связывание рекомбинантных фагов с адсорбированными на пластике мАТ против БП значительно превышает таковое в отрицательном контроле. Наблюдается дозозависимое уменьшение способности специфического связывания клонов - максимальное значение при концентрации 1011 кое/лунке, а минимальное при 107 кое/лунке.
Результаты секвенирования ДНК данных клонов показали, что все 5 клонов имели идентичную аминокислотную последовательность рекомбинантного пептида - LHLPHHDGVGWG. Возможно, это связано с условиями элюции. В литературе отмечено радикальное снижение разнообразия селектируемых клонов при использовании неспецифической элюции глицином [6]. Кроме того, идентичность последовательности рекомбинантного пептида в данном случае можно объяснить конформационной жесткостью структуры исходного эпитопа (низкомолекулярное органическое соединение - БП).
С помощью вестерн-блот-анализа исследовали связывание искомого пептида в составе pIII белка выделенного клона 2мм с мАТ В2 и моноспецифическими поликлональными АТ против БП. Ни те, ни другие АТ не реагировали с белком pIII дикого фага M13mp8. Не выявлено связывания белков исследуемых фагов с IgG интактных мыши и кролика.
В то же время мАТ В2 и поликлональные против БП и БА активно реагировали с белком pIII выделенного клона 2мм. Это подтверждает наличие искомого пептида в составе белка pIII клона 2 мм (рис.3).
М13тр8 2мм
поликлональные АТ против БП
Рис. 3. Вестерн-блот-анализ дикого типа фага M13mp8 и специфического клона фага 2мм с мАТ В2 и поликлональными моноспецифическими АТ против БП.
Для исследования полученного пептида на способность индуцировать образование антител против бензо[а]пирена in vivo нами был проведен пилотный эксперимент, в котором мышей иммунизировали: 1 - амплифицированным клоном фага 2мм, презентирующим специфический пептид; 2 - диким фагом M13mp8 в качестве отрицательного контроля и 3 - конъюгатом БП-БСА в качестве положительного контроля. Через 3 недели после начала иммунизации был проведен анализ сыворотки крови на содержание специфических АТ к БП (рис.4.).
А
Рис. 4. ИФА сыворотки крови мышей на наличие АТ к БП.
Выяснилось, что после иммунизации диким фагом M13mp8 АТ к БП не появляются. В то же время обнаружено наличие специфических АТ к БП в сыворотках крови мышей, иммунизированных конъюгатом БП-БСА и селектированным клоном фага 2мм. Положительные значения были получены лишь при низких разведениях сыворотки. Это можно объяснить недостаточным для полноценной иммунизации количеством антигена. В литературе отмечено, что при иммунизации фагами, экспрессирующими рекомбинантный пептид на поверхности минорного pIII белка, число копий которого составляет всего 3-5 молекул, титр индуцированных АТ невелик [7].
Таким образом, получен специфический пептид-иммуномиметик химического канцерогена, специфически взаимодействующий с антителами против БП и способный индуцировать образование антител против БП после иммунизации in vivo.
Результаты настоящего исследования раскрывают новые подходы к получению антиканцерогенных вакцин пептидной природы, основанных на высокой конформационной гомологии с молекулами канцерогенов. Подобные пептиды с заданными свойствами, по-видимому, могут оказаться полезными и для изучения взаимодействия химических канцерогенов с эндогенными лигандами.
1. Moolten F.L., Schreiber B., Rizzone A. Protection of mice against 7.12-dimethylbenz(a)antracene-induced skin tumors by immunization with a fluorinated asnalog of carcinogen. Cancer Res. 1981, v.41: p.452-459.
2. Peck R.M., Peck E.B. (1971) Cancer Res., 31, 1550-1554.
3. Глушков А.Н. (2000) Антитела в канцерогенезе, Изд-во Кузбассвузиздат, Кемерово.
4. Glushkov A.N., Kostyanko M.V., Anosova T.P., Polenok E.G., Mun S.A., Anosov M.P., Cherno S.V. Immunological images of polycyclic aromatic hydrocarbons. Experimental ncology. 2006. v.28: p. 93-176.
5. Chagnaud J.L., Faiderbe S., Geffard M. Effects of a monoclonal anti-idiotypie antybody, internal image of benzo(a)pyrene, on rat sarcomas. Acad.Sci. Paris, Sciences de la vie. 1993, v.316: p.1266-1269.
6. Lunder M., Bratkovic T., Kreft S., Strukelj B. (2005) J Lipid Res., 46, 1512-1516.
7. Guang Yang, Yaping Gao, Jie Dong, Chuan Liu, Yanning Xue, Ming Fan, Beifen Shen, Ningsheng Shao (2005) J Biol Chem, 280, 27431-27435.
