CC BY
58
© Коллектив авторов, 2019
Трофимов А.В.1, Горбунов Н.П.1, Ищенко А.М.1, Рак А.Я.1, Симбирцев А.С.1, Гамалея Н.Б.2, Ульянова Л.И.2, Берзина А.Г.2, Климова Т.А.2
Морфин-специфические антигенные и функциональные свойства поли- и моноклональных антиидиотипических антител
1 ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России, 197110, г. Санкт-Петербург, Россия
2 ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр психиатрии и наркологии им. В.П. Сербского» Минздрава России, 119034, г. Москва, Россия
Антиидиотипические антитела, имитирующие образ антигена, могут быть использованы в качестве вакцин для профилактики и лечения различных болезней, в том числе наркотической зависимости. Их использование особенно актуально в тех случаях, когда применение в качестве антигенов препаратов, обладающих психотропным действием, ограничено законом. В настоящей работе исследованы антигенные и функциональные свойства нескольких типов антиидиотипических моно-и поликлональных антител (Ab2) к производным морфина. Для получения АЬ2 были использованы два типа первичных моноклональных антител (МкАт) (АЬ1): 3К11 и 6G1, обладающие различной специфичностью, которые в свою очередь были получены в ответ на иммунизацию конъюгатами производных морфина с бычьим сывороточным альбумином. Иммунизация кроликов всеми полученными типами Ab2 стимулировала продукцию антител III поколения (Ab3), которые, подобно первичным антителам АЬ1, взаимодействовали с исходными антигенами - производными морфина. Наблюдалось различие в специфичности Ab1 и Ab3, выявленное с использованием дифференциального иммунофер-ментного анализа. МкАт АЫ типов 3К11 и 6G1 обладали более узкой специфичностью и распознавали только свои иммуногены, обозначенные как конъюгаты КММ-БСА, ФАМ-БСА и ГСМ-БСА. При этом Ab1 К11 взаимодействовали с первыми двумя конъюгатами, а 6G1 - c ГСМ-БСА. В отличие от них Ab3, полученные при иммунизации типами Ab2 К11 и G1, взаимодействовали со всеми конъюгатами производных морфина, которыми проводилась первичная иммунизация. Концентрация Ab3 в ответ на иммунизацию МкАт многократно превышала титр антител, полученных при введении поликлональных антител, что свидетельствует о принадлежности МкАт Ab2 к ß-типу. Изучение функциональной активности Ab2 показало, что все типы данных антител при концентрациях 37,5-75 нМ, подобно морфину, стимулировали пролиферацию клеток глиобластомы линии T98G, на мембране которых присутствует значительное количество опиоидных рецепторов преимущественно ¡х- и к-типов. В то же время морфин оказывал максимальный пролиферативный эффект при концентрации 20 мкМ. Антагонист опиатных рецепторов налоксон полностью блокировал пролиферативные эффекты Ab2 и морфина, что подтверждает специфичность действия полученных антиидиотипических антител.
Ключевые слова: антиидиотипические антитела; антитела; глиобластома человека линии T98G; синтез ДНК; иммуноферментный анализ; моноклональные антитела; поликлональные антитела; производные морфина
Статья поступила 05.03.2019. Принята в печать 16.04.2019.
Для цитирования: Трофимов А.В., Горбунов Н.П., Ищенко А.М., Рак А.Я., Симбирцев А.С., Гамалея Н.Б., Ульянова Л.И., Берзина А.Г., Климова Т.А. Морфин-специфические антигенные и функциональные свойства поли-и моноклональных антиидиотипических антител. Иммунология. 2019; 40 (4): 5-12. doi: 10.24411/0206-4952-201914001
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки. Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Для корреспонденции
Трофимов Александр Викторович -руководитель группы лаборатории биохимии белка ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия E-mail: [email protected]
Trofimov A.V.1, Gorbunov N.P.1, Ischenko A.M.1, Rak A.Ya.1, Simbirtsev A.S.1, Gamaleya N.B.2, Ul'yanova L.I.2, Berzina A.G.2, Klimova T.A.2
Morphine-specific antigenic and functional properties of poly- and monoclonal anti-idiotypic antibodies
1 State Research Institute for Highly Pure Biopreparations of FMBA of Russia, 197110, St. Petersburg, Russia
2 V.P. Serbsky National Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology of National Scientific Research Centre on Addictions, 119034, Moscow, Russia
Anti-idiotypic antibodies that mimic the image of an antigen can be used as vaccines for the prevention and treatment of various diseases, including drug addiction. Their use is especially relevant in cases when the use of drugs with psychotropic effects as antigens is limited by law. In the present work, the antigenic
For correspondence
Trofimov Aleksander V. -Group Leader of Protein Biochemistry Laboratory, State Research Institute for Highly Pure Biopreparations of FMBA of Russia, St. Petersburg, Russia E-mail: [email protected]
and functional properties of several types of anti-idiotypic monoclonal and polyclonal antibodies (Ab2) to morphine derivatives were investigated. To obtain Ab2, two types of primary monoclonal antibodies (Ab1) with different specificity were used: 3K11 and 6G1, which in turn were obtained in response to immunization with conjugates of morphine derivatives with bovine serum albumin. Immunization of the rabbits with all Ab2 obtained types stimulated the production of the third generation antibodies (Ab3), which, like the primary antibodies Ab1, interacted with the original antigens (morphine derivatives). There was a difference in the specificity of Ab1 and Ab3, detected using differential enzyme immunoassay. Monoclonal Ab1 types 3K11 and 6G1 had a narrower specificity and recognized only their immunogens, designated as conjugates KMM-BSA, FAM-BSA and GSM-BSA. In this case, Ab1 K11 interacted with the first two conjugates, and 6G1 - with GSM-BSA. In contrast, Ab3, obtained by immunization with the Ab2 types K11 and G1, interacted with all morphine derivatives conjugates, which were used for primary immunization. The concentration of Ab3 in response to immunization with monoclonal antibodies repeatedly exceeded the titer of antibodies obtained with the injection of polyclonal antibodies, which indicates that monoclonal Ab2 belongs to the P-type. The study of Ab2 functional activity showed that all types of these antibodies at concentrations of 37.5-75 nM, like morphine, stimulated the proliferation of T98G line glioblastoma cells, having a significant amount of opioid receptors mainly ¡¡- and K-types at the membrane. At the same time, morphine exerted a maximum proliferative effect at a concentration of 20 ¡M. The opiate receptor antagonist naloxone completely blocked the proliferative effects of Ab2 and morphine, which confirms the specificity of the obtained anti-idiotypic antibodies action.
Keywords: anti-idiotypic antibodies; antibodies; human glioblastoma line T98G, DNA synthesis; ELISA; monoclonal antibodies; polyclonal antibodies; morphine derivatives
Received 05.03.2019 . Accepted 16.04.2019.
For citation: Trofimov A.V., Gorbunov N.P., Ischenko A.M., Rak A.Ya., Simbirtsev A.S., Gamaleya N.B., Ul'yanova L.I., Berzina A.G., Klimova T.A. Morphine-specific antigenic and functional properties ofpoly- and monoclonal anti-idiotypic antibodies. Immunologiya. 2019; 40 (4): 5-12. doi: 10.24411/0206-4952-2019-14001 (in Russian)
Acknowledgements. The study had no sponsor support.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Активная иммунизация (вакцинация) в настоящее время широко применяется в мире для защиты организма от инфекционных заболеваний и при лечении опухолей. Однако не менее актуальной является разработка вакцин для иммунопрофилактики наркомании [1-4]. При разработке вакцин против действия наркотиков возникает ряд проблем, затрудняющих использование традиционных подходов к их получению. В частности, использование самих психотропных молекул в качестве антигенов для вакцинации людей затруднено, а в ряде стран, включая Россию, невозможно из-за законодательных запретов. Помимо этого, психотропные молекулы, такие как морфин, героин и другие, относятся к низкомолекулярным веществам и, следовательно, являются слабыми иммуногенами. В этих случаях для стимуляции Т- и В-зависимого иммунного ответа исследователи идут по пути создания комплексов, представляющих собой конъюгаты целевого психоактивного вещества с молекулами-носителями, в качестве которых используются высокомолекулярные белки и гликопротеины. Однако в этом случае возможен риск возникновения побочных эффектов, включающих анафилактические реакции, аутоиммунный ответ и др.
Перспективным подходом к созданию вакцин против опиатов является использование для иммунизации в качестве антигенов вторичных антиидиотипических (АИ) антител (Ab2) [5-7]. Как известно, по своим свойствам они подразделяются на три типа: Ab2a, Ab2ß и Ab2y. Ab2a взаимодействуют с Abi, но не блокируют взаимодействие Abi с антигеном. Антитела Ab2y способны к взаимодействию с активным центром Abi и блокируют связывание Abi с антигеном, но при иммуниза-
ции не вызывают образования антител, специфичных к антигену (Ab3). Антитела Ab2, относящиеся к ß-типу, воссоздают паратопом молекулярную мимикрию отдельных участков исходного антигена, к которым были получены первичные антитела Abi [8]. Таким образом, главной задачей при создании эффективной вакцины для профилактики и лечения опиатной зависимости является получение Ab2, стимулирующих продукцию высокоспецифических антител к опиатам.
В связи с этим ранее в ответ на иммунизацию 3-О-карбоксиметильным и 6-гемисукцинильным производными морфина были получены два типа Abi моно-клональных антител (МкАт) - 3Kii и 6Gi, обладающих различной специфичностью по отношению к молекуле морфина [9], которые были использованы в качестве антигенов для получения поли- и моноклональных антител II поколения Ab2. Было показано, что полученные антитела являются АИ. При этом антитела НАМ-Kii и АИ-KiiB распознают идиотип МкАт 3Kii, а НАМ-Gi и АИ-Gi - идиотип МкАт 6Gi. В настоящей работе были исследованы иммуноспецифические свойства полученных антител и их способность стимулировать продукцию антител Ab3 к исходным опиатам. Была также изучена способность Ab2-антител связываться с опиат-ными рецепторами, присутствующими на клетках глио-бластомы человека линии T98G.
Материал и методы
МкАт АИ-KiiB и АИ-Gi были получены иммунизацией мышей линии Balb/c конъюгатами гемоциа-нина лимфы улитки с моноклональными антителами 3Kii и 6Gi в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ) в дозе
10 мкг на мышь. На 30-й день после иммунизации животным вводили внутривенно 5 мкг МкАт 3К11 или 6в1 в физиологическом растворе. На 4-й день после инъекции животных забивали цервикальной дислокацией и выделяли спленоциты и лимфоциты паховых и брюшных лимфоузлов. Полученные клетки смешивали с клетками миеломы мыши линии 8Р 2/0 в соотношении 2 : 1. Гибридизацию клеток проводили 50% раствором по-лиэтиленгликоля (ПЭГ) по стандартной технологии [9].
МкАт мыши АЬ1 и АЬ2 были наработаны в перитоне-альной полости сингенных мышей линии БАЬБ/с (ФГУП «Питомник лабораторных животных Рапполово») введением клеток-продуцентов и выделены из асцитной жидкости методом аффинной хроматографии на сорбенте ЫаЪ8е1ес1-сефароза (вБ, США) согласно инструкции, предложенной производителем.
Поликлональные АИ-антитела АЬ2 были получены иммунизацией лошади первичными антителами АЬ1: 3 К11 и 6в1. Поликлональные антитела НАМ-К11 и НАМ-в1 на первом этапе истощали из гипериммунной сыворотки крови лошади с использованием сорбента с иммобилизованными общими иммуноглобулинами мыши с целью удаления антител против видоспецифических детерминант иммуноглобулина мыши. Далее с использованием им-муносорбентов 3К11-сефарозы и 6в1-сефарозы, синтезированных путем иммобилизации первичных антител АЬ1 на сефарозу-6СЬ (вБ, США), получали препарат очищенных поликлональных АИ-антител.
Определение АИ-специфичности поли- и моноклональных АЬ2 антител проводили посредством иммуно-ферментного анализа (ИФА). При этом в лунки планшетов с сорбированными первичными МкАт 3К11 или 6в1 вносили растворы АЬ2, а затем после инкубации и отмывки в лунки добавляли конъюгаты соответствующих первичных антител с пероксидазой хрена. Реакцию, подтверждающую специфичность АИ-антител, проявляли добавлением субстрата.
Для получения антител III поколения АЬ3 использовали МкАт мыши АИ-К11Б и АИ-в1, а также поликлональные антитела лошади НАМ-К11 и НАМ-в1. Антитела вводили кроликам-самцам породы советская шиншилла в возрасте 5-6 мес и массой 1,5-2,0 кг (ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр вирусологии и микробиологии», пос. Вольгинский, Пету-шинский район, Владимирская обл.).
Э
4
О
НО'^ CH.
Э
BSA О НО
Э
BSA
НО О НО
НО О
CH3 BSA'
Рис. 1. Химическая структура молекулы морфина (А) и схематическое изображение конъюгатов: КММ-БСА (Б), ФАМ-БСА (В) и ГСМ-БСА (Г). В молекуле морфина пронумерованы атомы углерода
Для изучения иммуноспецифичности были использованы производные морфина КММ, ФАМ и ГСМ, конъюгированные с бычьим сывороточным альбумином с помощью бифункционального реагента 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимида гидрохлорида, которые далее обозначены как КММ-БСА, ФАМ-БСА и ГСМ-БСА конъюгаты [10]. Строение этих конъюгатов схематически показано на рис. 1.
Для изучения антигенных свойств полученных АИ-антител АЬ2 проводили иммунизацию кроликов очищенными поликлональными антителами НАМ-К11 и НАМ-в1, а также МкАт АИ-К11Б и АИ-в1 способами, схематично представленными в табл. 1.
Определение специфичности АЬ3 в сыворотке крови кроликов проводили методом ИФА. В качестве захватывающих антигенов использовали КММ-БСА, ФАМ-БСА и ГСМ-БСА, которые иммобилизовали на дне лунок планшетов для ИФА путем инкубации раствора конъю-гата 10 мкг/мл в 20 мМ боратном буфере (рН 8,0), содержащем 0,15 М №С1 (посадочный буфер), 20 ч при комнатной температуре. По окончании сорбции планшеты отмывали промывочным буфером (посадочный буфер, содержащий 0,05% Tween-20) и в лунки вносили по 100 мкл тестируемых антител: АЬ3 кролика, МкАт АЬ1 3К11 и 6в1. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при перемешивании при 37 °С. Затем в трижды промытый
Таблица 1. Условия иммунизации кроликов антителами Ab2
Вводимый антиген Способ введения антигена
1-я инъекция - 0-й день 2-я инъекция - 14-й день
НАМ-К11 НАМ-Gl АИ-К11В АИ-Gl 0,2 мг антигена в 2 точки в области крупа с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ), в соотношении 1 : 1 по объему, внутримышечно 0,2 мг антигена в 2 точки верхней части шеи с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ), 1 : 1, подкожно
3-я инъекция - 33-й день 4-я инъекция - 47-й день
0,2 мг антигена в 2 точки в области крупа с НАФ (1 : 1), внутримышечно 0,2 мг антигена в 2 мл физиологического раствора, внутривенно
планшет вносили растворы антивидового пероксидаз-ного конъюгата антител козы против иммуноглобулинов кролика или мыши (Sigma, США) в концентрации 0,5 мкг/мл. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при перемешивании при 37 °С, после чего тщательно отмывали и проводили окрашивание с помощью раствора субстрата тетраметилбензидина (XEMA, Россия).
Для определения временной динамики образования антител кровь из ушной вены кроликов отбирали на 16, 28, 31, 37 и 50-й дни после последней иммунизации. Уровень антител Ab3 в сыворотке крови кроликов определяли методом ИФА. В этом варианте анализа на дно лунок планшетов для ИФА смесь конъюгатов КММ-БСА и ГСМ-БСА иммобилизовали путем инкубации раствора, содержащего в посадочном буфере по 5 мкг/мл каждого конъюгата в течение 20 ч. По окончании сорбции антигена планшеты отмывали промывочным буфером и в лунки вносили по 100 мкл тестируемых Ab3, которые предварительно готовили в виде 10-кратных серийных разбавлений. В качестве стандарта для определения концентрации специфических антител в сыворотках иммунных животных использовали выделенные с помощью иммуноаффинной хроматографии антитела Ab1 кролика, иммунизированного конъюгатами КММ-БСА и ГСМ-БСА. Все дальнейшие стадии анализа совпадали с завершающими стадиями при определении специфичности антител. По калибровочной кривой зависимости интенсивности OD450 от концентрации антител с учетом разбавления определяли содержание Ab3 в сыворотке.
Оценку биологической активности поли- и моно-клональных Ab2 по сравнению с морфином проводили in vitro на перевиваемой клеточной линии глиобластомы человека T98G с двойным набором хромосом (2n = 46, модальное число хромосом - 128-132), которая экспрес-сирует на своей поверхности опиоидные рецепторы [11]. Культивирование клеточной линии проводили на куль-туральной среде (КС) DMEM (Sigma, США), которая содержала 2 мМ L-глутамина, 1% пирувата натрия, 10% фетальной телячьей сыворотки (Sigma, США) и 1% набор аминокислот (NEAA, Sigma, США). Для постановки анализа определения функциональной активности АИ-антител предварительно готовили в КС серии двукратных разбавлений исследуемых препаратов в диапазоне 5-300 нМ. В 96-луночные плоскодонные культуральные планшеты (Sigma, США) вносили по 100 мкл на ячейку приготовленных проб и КС, содержащую клетки линии T98G с концентрацией 5 • 105 клеток в 1 мл КС. Контролем служила КС, не содержащая испытуемых веществ. Планшеты помещали на 48 ч в термостат с влажностью 80%, содержанием 5% СО2 и температурой 37 °С. За 16 ч до окончания инкубации в лунки вносили метил-3Н1-тимидин. Интенсивность биологического эффекта психоактивного вещества оценивали по активности синтеза ДНК клеточных культур, которую измеряли по скорости включения метил-3Н1-тимидина во вновь синтезируемую ДНК. Для этого из культуральных планшетов удаляли КС и вносили в каждую лунку по
0,2 мл 0,25% раствора Трипсин/ЭДТА. Планшеты помещали в термостат при 37 °С на 15 мин. После отделения клеток от пластика проводили осаждение полученной суспензии клеток T98G на стекловолокнистом фильтре с помощью полуавтоматического сборщика клеток Cell Harvester (Flow Lab, США). Фильтры помещали в стеклянные флаконы со сцинтилляционной жидкостью, содержащей 0,35% РРО и 0,005% РОРОР в толуоле. Интенсивность реакции образцов измеряли на ß-счетчике TRI-CARB 2100TR (Perkin Elmer, США). Результаты измерения выражали в имп/мин и рассчитывали для каждой культуры. Каждая экспериментальная группа состояла из 2 идентичных культур.
Результаты исследований выражали выборочным средним х ± s (выборочное стандартное отклонение). Нормальность распределения определяли по критериям Лиллиефорса и Шапиро-Уилка. Для переменных с нормальным распределением применяли дисперсионный анализ (ANOVA) повторных измерений. Множественные сравнения проведены по критериям Ньюмена-Кейлса и Даннета. Для сравнения трех зависимых групп и более по одному признаку (стимулирующей пролиферацию активности при одной и той же концентрации препарата) был проведен однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) повторных измерений, так как эксперименты по оценке влияния различных препаратов были выполнены на одних и тех же культурах клеток [12].
Результаты
В табл. 2 представлены результаты изучения иммунологической специфичности Abi-антител 3К11 и 6G1, а также антител Ab3 кроликов, иммунизированных Ab2-антителами - поликлональными НАМ-К11 и HAM-G1 или моноклональными АИ-К11В и АИ-GL В наименованиях антител Ab3 указан тип иммуногена.
Как видно из табл. 2, все типы Ab2-антител стимулируют продукцию поликлональных антител Ab3, которые распознают различающиеся по структуре три типа производных морфина (см. рис. 1). В то же время следует отметить, что Ab1 3K11 и 6G1, к идиотипу которых получены исследуемые Ab2, не распознают ГСМ-БСА или КММ-БСА и ФАМ-БСА соответственно.
В табл. 3 представлены данные по зависимой от времени динамике продукции Ab3 при иммунизации кролика МкАт АИ-К11В и АИ-GL Дни отбора крови отсчитывали после последней иммунизации.
Как видно из табл. 3, концентрация антител в крови кролика, иммунизированного МкАт Ab2, возрастала от 4,8 до 33,5 мкг/мл. Концентрация Ab3 при иммунизации поликлональными Ab2 не достигала 0,2 мкг/мл, находясь на уровне предела чувствительности используемой тест-системы, что не позволило изучить кинетику иммунного ответа НАМ-К11 и НАМ-GL
Влияние поли- и моноклональных Ab2 к морфину на интенсивность синтеза ДНК изучали на клеточной линии глиобластомы человека T98G. Первоначально было протестировано воздействие налоксона и нормальных
Таблица 2. Иммунологическая специфичность МкАт АЬ1 и АЬ3 кролика к производным морфина
Таблица 3. Временная динамика продукции поликлональных АЬ3 антител к производным морфина у кроликов, иммунизированных антителами АИ-К11Б и АИ-01
Антитело Антиген, сорбированный на планшете
КММ-БСА ФАМ-БСА ГСМ-БСА
АЬ1 3К11 + + -
АЬ1 6в1 - - +
АЬ3 НАМ-К11 + + +
АЬ3 АИ-К11В + + +
АЬ3 НАМ-в1 + + +
АЬ3 АИ-в1 + + +
День отбора АЬ3
крови АИ-К11В, нг/мл АИ-С1, нг/мл
16-й 4804 9964
28-й 12 636 19 158
31-й 24 756 31 692
37-й 33 531 28 634
50-й 30 864 19 646
Примечание. «+» — специфичны; «—» — неспецифичны в тесте иммуноферментного анализа.
^ мыши и лошади на этот процесс. Полученные данные представлены в табл. 4, они отражают воспроизводимость измерений и фоновое значение измеряемых величин.
На рис. 2 представлены результаты оценки влияния морфина на интенсивность пролиферативной активности клеток глиобластомы линии Т98в по включению метил-3Н1-тимидина во вновь синтезируемую ДНК.
Как видно из рис. 2, максимальный уровень интенсивности синтеза ДНК достигался при концентрации морфина 20 000 нМ, что значимо отличало эту величину от контроля (критерий Ньюмена-Кейлса q = 183,740, критерий Даннета q' = 129,924), а также от значений при всех других концентрациях.
На рис. 3 представлены данные, отражающие усиление пролиферативного ответа клеток глиобластомы линии Т98в при инкубации с поликлональными АЬ2-антителами лошади НАМ-К11 или НАМ-в1.
Как видно из рис. 3, пик стимулирующей пролиферацию активности антител НАМ-К11 соответствовал концентрации 75 нМ, что значимо отличало ее от контроля (критерий Ньюмена-Кейлса q = 362,457, критерий Даннета q' = 256,296), а также от значений при всех других концентрациях. Пик стимулирующей активности антител НАМ-в1 достигался при концентрации 37,5 нМ, что также значимо отличало эту величину от контроля (кри-
терий Ньюмена-Кейлса q составил 97,810, а критерий Даннета q' = 69,162) и от всех других исследованных концентраций.
Влияние МкАт АЬ2 АИ-К11Б или АИ-в1 на интенсивность синтеза ДНК в клетках культуры линии Т98в в диапазоне концентраций от 5 до 300 нМ представлено на рис. 4.
Динамика синтеза ДНК в тестируемой культуре клеток, как следует из рис. 4, при стимуляции МкАт АИ АЬ2 не отличалась от таковой при использовании по-ликлональных антител. Пик стимулирующей активности антител АИ-К11Б соответствовал, как и в случае НАМ-К11, концентрации препарата 75 нМ, что значимо отличало ее от контроля (критерий Ньюмена-Кейлса q = 85,201, критерий Даннета q' = 60,246), а также от значений при всех других концентрациях антител. Максимум стимулирующей активности АИ-в1 достигался при концентрации 37,5 нМ. Значимость отличий пиковой концентрации от контроля и всех других исследованных концентраций антител подтверждалась соответствующими критериями (д = 94,218; q' = 66,622).
Изучение действия налоксона на стимуляцию синтеза ДНК проводили в пробах, в которых содержание морфина и АИ-антител соответствовало концентрации препарата с максимальной пролиферативной активно-
я
I 5
3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200
Морфин
НАМ-К11
20000 40000 60000 Концентрация препарата, нМ
80000
Рис. 2. Стимуляция морфином синтеза ДНК в культуре клеток глиобластомы человека Т98в
К Н
2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400
1200 0 50 100 150 200 250 300 Концентрация препарата, нМ
Рис. 3. Стимуляция синтеза ДНК поликлональными АЬ2 НАМ-К11 и НАМ-01 в культуре клеток глиобластомы человека линии Т98в
н
5
0
Таблица 4. Интенсивность синтеза ДНК (имп/мин) в культуре глиобластомы человека линии T98G in vitro в присутствии налоксона и иммуноглобулинов мыши и лошади в сравнении со спонтанной (без препаратов) пролиферативной активностью тех же культур in vitro, х ± s
Препарат и его концентрация, мкг/мл 0 Контроль (внесение культуры без препарата) Налоксон (n = 7) Ig мыши (П = 7) Ig лошади (n = 7)
1276,0 ± 70,8
0,39 1281,0 ± 83,39 1281,0 ± 83,43 1280,0 ± 82,78
0,781 1281,0 ± 84,01 1280,0 ± 83,37 1281,0 ± 83,55
1,562 1281,0 ± 83,07 1281,0 ± 83,04 1281,0 ± 83,43
3,125 1280,0 ± 82,91 1281,0 ± 82,70 1281,0± 82,71
6,25 1279,0 ± 84,48 1281,0 ± 83,02 1280,0 ± 84,38
12,5 1281,0± 82,78 1281,0 ± 83,16 1281,0± 83,53
25 1279,0 ± 82,30 1281,0 ± 84,11 1280,0 ± 83,38
Примечание. х - выборочное среднее; 5 - выборочное стандартное отклонение; п - количество экспериментов, проведенных на перевиваемой клеточной линии Т980 в различные сроки культивирования клеток.
Концентрация препарата, нМ
Рис. 4. Стимуляция синтеза ДНК МкАт Ab2 АИ-КНВ и АИ-Gi в культуре клеток глиобластомы человека линии T98G
стью (см. рис. 3, 4). Концентрация налоксона составляла 6,25 мкг/мл. Во всех вариантах анализа налоксон эффективно подавлял до контрольных значений синтез ДНК, стимулированный морфином и АИ-антителами. На рис. 5 представлены результаты влияния налоксона на стимуляцию пролиферативной активности клеток культуры линии T98G, вызванную Ab2 и морфином.
Обсуждение
Как видно из полученных результатов, поли- и моно-клональные Ab2 индуцировали выработку третичных поликлональных Ab3-антител к производным морфина у иммунизированных кроликов. Ab3 по иммунологическим свойствам отличались от моноклональных Abi 3КН и 6Gi, к которым были получены АИ-антитела Ab2. В противоположность тому, что МкАт 3КН не взаимодей-
я
I S
3000 2800 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200
1 - Контроль
2 - Морфин
3 - Морфин + налоксон
4 - НАМ-К11
5 - НАМ-К11 + налоксон
6 -НАМ G1
7 - НАМ G1 + налоксон
8 - АИ-К11В
9 - АИ-К11В + налоксон
10 - АИ-G!
11 - АИ-G! + налоксон
123456789 10 11
Рис. 5. Подавление налоксоном стимуляции синтеза ДНК, вызванной морфином и антиидиотипическими антителами, в культуре клеток глиобластомы человека линии Т980
ствовали с конъюгатом ГСМ-БСА, а МкАт 6G1 - с конъю-гатами КММ-ВСА и ФАМ-БСА, все Ab3 проявляли кросс-реактивность по отношению к трем вышеописанным конъюгатам производных морфина (см. рис. 1). Поскольку МкАт 3К11 и 6G1 распознавали разные участки морфина, АИ-антитела, полученные к Ab1, должны имитировать конформацию этих участков. Иммунизация животных разными по специфичности Ab2 привела к генерации Ab3 одинаковой специфичности. Как правило, к молекулам малого размера, к которым относится морфин с молекулярной массой 324 Да, трудно получить антитела к двум независимым участкам. Мы полагаем, что полученные Ab1 3К11 и 6G1 обладают перекрестной специфичностью к определенному участку молекулы морфина. Возможно, этот участок конформационно представлен в паратопах двух типах Ab2, что привело к синтезу антител более широкой специфичности.
Концентрация Ab3 при иммунизации животных поликлональными АИ-антителами НАМ-К11 и НАМ-G! не превышала 200 нг/мл, в то время как концентрация Ab3 в ответ на иммунизацию моноклональными АИ-К11В и АИ-G! достигала 30 мкг/мл. Низкий титр антител Ab3, вызванный поликональными АИ НАМ-К11 и НАМ-GL вероятно, является следствием их гетерогенной специфичности, так как они представлены тремя типами АИ (а, ß и у), причем антитела ß-типа наиболее полно могут имитировать конформацию антигена и способны индуцировать выработку антител, подобных Ab1. Кроме того, сами Ab2 ß-типа являются поликлональными, что определяет их антигенную поливалентность. В то же время высокий титр антител к морфину, полученный при иммунизации МкАт Ab2, является следствием того, что иммунный ответ происходит узконаправленно и с большей продуктивностью, чем при иммунизации поликлональными Ab2.
При анализе временной динамики продукции по-ликлональных Ab3-антител к производным морфина у кролика, иммунизированного антителами АИ-К11В и АИ^1, пик продукции Ab3 приходился на 30-3 5-й дни после последней иммунизации. Как правило, максимальный уровень концентрации антител наблюдается на 12-14-й дни после иммунизации животных. Вероятной причиной сдвига пика являются свойства АИ Ab2
■ Литература
1. Гамалея Н.Б., Берзина А.Г. Вакцины от наркотиков - новое перспективное направление профилактики злоупотребления ПАВ. Наркология. 2011; 10: 70-83.
2. Basak S., Eck S., Gutzmer R., Smith A.J. et al. Colorectal cancer vaccines: antiidiotypic antibody, recombinant protein, and viral vector. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2000; 910 (1): 237-52.
3. Bellati F., Napoletano C., Ruscito I., Antonilli M. et al. Past, present and future strategies of immunotherapy in gynecological malignancies. Curr. Mol. Med. 2013; 13 (4): 648-69.
4. Moreno A.Y., Janda K.D. Immunopharmacotherapy: vaccination strategies as a treatment for drug abuse and dependence. Pharmacol. Biochem. Behav. 2009; 92 (2): 199-205.
5. Гамалея Н.Б., Берзина А.Г., Шестаков К. А., Капанадзе Г. Д. и др. Иммуноген для лечения и профилактики зависимости от опиатов. Пат. РФ № 2548802; 2015.
связываться с опиоидными рецепторами лимфоцитов, циркулирующими в кровотоке, и, как следствие, к более позднему иммунному ответу.
Для определения морфин-имитирующих функциональных свойств АИ-антител были использованные клетки глиобластомы человека линии T98G, которые несут на своей поверхности большое число д- и к-опиоидных рецепторов и незначительное количество 5-опиоидных рецепторов [i3]. Результаты по изучению биологической активности агониста опиоидных рецепторов морфина, а также поли- и моноклональных Ab2-антител на пролиферативные процессы клеток линии T98G представлены на рис. 2-4. В то время как максимальная интенсивность пролиферативного эффекта наблюдалась при концентрации морфина 20 мкМ, поли-и моноклональные Ab2-антитела вызывали аналогичный эффект при концентрациях 37,5-75 нМ.
Данный эффект, как и в случае обработки клеток морфином гидрохлоридом, нейтрализовался действием антагониста опиоидных рецепторов налоксоном. Эти результаты служат доказательством взаимодействия Ab2 c опиодными рецепторами, которое приводит к проявлению функциональной активности.
Наряду с этим было выявлено, что поли- и моноклональные Ab2, полученные к идиотипу МкАт 3КИ, обладают меньшей стимулирующей активностью, чем Ab2 к 6Gi антителам, что может быть связано с различиями в константах связывания антител и/или со способностью взаимодействовать с опиоидными рецепторами разных типов. Получение трехмерных моделей антиген-связывающих центров Abi антител 3КИ и 6Gi и Ab2-антител АИ-КПВ и АИ-Gi, а также проведение сравнительного анализа взаимодействия АИ-антител с д-, к- и 5- опиоидными рецепторами позволит объяснить причину их различия.
Заключение
Таким образом, представленные результаты доказывают, что впервые полученные лошадиные поликло-нальные и мышиные моноклональные АИ Ab2-антитела НАМ-КИ, НАМ-Gi и АИ-КПВ, АИ-Gi обладают морфин-специфическими антигенными свойствами и могут быть в дальнейшем использованы для создания вакцины на их основе.
6. Bonese K.F., Wainer B.H., Fitch F.W., Rothberg R.M. et al. Changes in heroin self-administration by a rhesus monkey after morphine immunization. Nature. 1974; 252 (5485): 708-10.
7. Schabacker D.S., Kirschbaum K.S., Segre M. Exploring the feasibility of an anti-idiotypic cocaine vaccine: analysis of the specificity of anticocaine antibodies (Ab1) capable of inducing Ab2b anti-idiotypic antibodies. Immunology. 2000; 100: 48-56.
8. Huang J.Y., Ward R.E., Kohler H. Biological mimicry of antigenic stimulation: analysis of the in vitro antibody responses induced by monoclonal antiidiotypic antibodies. Immunology. 1988; 63: 1-8.
9. Берзина А. Г., Гамалея Н.Б., Сергеева В.Е., Трофимов А. В. и др. Получение поликлональных и моноклональных антител к двум производным морфина. Вопр. наркологии. 2016; 11-12: 39-54.
10. Берзина А.Г., Гамалея Н.Б., Ульянова Л.И, Шестаков К.А. и др. Методологические подходы к разработке вакцины для лечения зависимости от опиатов. Наркология. 2015; 11 (167): 25-31.
11. Гамалея Н.Б., Ульянова М.А., Кротов Г.И., Берзина А.Г., Ульянова Л.И. Оценка биологической активности морфина, лопе-рамида и налоксона на культуре перевиваемой клеточной линии глиобластомы человека T98G. Наркология. 2017; 1: 39-44.
■ References
1. Gamaleya N.B., Berzina A.G. Vaccines against drugs - a new promising trend in drug abuse prevention. Narkologiya. 2011; 10: 70-83. (in Russian)
2. Basak S., Eck S., Gutzmer R., Smith A.J., et al. Colorectal cancer vaccines: antiidiotypic antibody, recombinant protein, and viral vector. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2000; 910 (1): 237-52.
3. Bellati F., Napoletano C., Ruscito I., Antonilli M., et al. Past, present and future strategies of immunotherapy in gynecological malignancies. Curr. Mol. Med. 2013; 13 (4): 648-69.
4. Moreno A.Y., Janda K.D. Immunopharmacotherapy: vaccination strategies as a treatment for drug abuse and dependence. Pharmacol. Biochem. Behav. 2009; 92 (2): 199-205.
5. Gamaleya N.B., Berzina A.G., Shestakov K.A., Kapanadze G.D., et al. Immunogen for the treatment and prevention of opiate dependence. Patent RF N 2548802; 2015. (in Russian)
6. Bonese K.F., Wainer B.H., Fitch F.W., Rothberg R.M., et al. Changes in heroin self-administration by a rhesus monkey after morphine immunization. Nature. 1974; 252 (5485): 708-10.
7. Schabacker D.S., Kirschbaum K.S., Segre M. Exploring the feasibility of an anti-idiotypic cocaine vaccine: analysis of the specificity of anticocaine antibodies (Ab1) capable of inducing Ab2b anti-idiotypic antibodies. Immunology. 2000; 100: 48-56.
12. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М. : Медиа Сфера, 2003.
13. Lazarczyk M., Matyja E., Lipkowski A.W. A comparative study of morphine stimulation and biphalin inhibition of human glioblastoma T98G cell proliferation in vitro. Peptides. 2010; 31: 1606-12.
8. Huang J.Y., Ward R.E., Kohler H. Biological mimicry of antigenic stimulation: analysis of the in vitro antibody responses induced by monoclonal antiidiotypic antibodies. Immunology. 1988; 63: 1-8.
9. Berzina A.G., Gamaleya N.B., Sergeeva V.E., Trofimov A.V., et al. Production of polyclonal and monoclonal antibodies against two morphine derivatives. Voprosy narkologii. 2016; 11-12: 39-54. (in Russian)
10. Berzina A.G., Gamaleya N.B., Ul'yanova L.I., Shestakov K.A., et al. Methodological approaches to development of a vaccine for the treatment of opiate dependence. Narkologiya. 2015; 11 (167): 25-31. (in Russian)
11. Gamaleya N.B., Ul'yanova M.A., Berzina A.G., Krotov G.I., et al. Evaluation of biological activity of morphine, loperamide, and naloxone in the human glioblatoma T98G continuous cell line in vitro. Narkologiya. 2011; 1: 39-44. (in Russian)
12. Rebrova O.Yu. Statistical analysis of medical data. Application of STATISTICA software package. Moscow: Media Sfera, 2003. (in Russian)
13. Lazarczyk M., Matyja E., Lipkowski A.W. A comparative study of morphine stimulation and biphalin inhibition of human glioblastoma T98G cell proliferation in vitro. Peptides. 2010; 31: 1606-12.
