CC BY
33
https://doi.org/10.33647/2074-5982-15-2-63-68
(«О
BY 4.0
АНТИИДИОТИПИЧЕСКИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К МОРФИНУ: ПОЛУЧЕНИЕ, СВОЙСТВА И ПЕРСПЕКТИВЫ
ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
А.В. Трофимов1, А.Я. Рак1, А.Г. Берзина2*, Л.И. Ульянова2, Н.Б. Гамалея2, Т.А. Климова2, Н.В. Станкова3
1 ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России 197110, Российская Федерация, Санкт-Петербург, Пудожская ул., д. 7
2 ФГБУ «(Национальный медицинский исследовательский центр психиатрии и наркологии им. В.П. Сербского» Минздрава России 119034, Российская Федерация, Москва, Кропоткинский пер., д. 23
3 ФГБУН «(Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства России» 143442, Российская Федерация, Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, владение 1
|В работе описана методика получения антиидиотипических моноклональных антител (АЬ2) к двум производным морфина. Представлены результаты исследования специфичности полученных антител с помощью иммуноферментного анализа. Проведена оценка биологической активности на модели пролиферации культур перевиваемой клеточной линии глиобластомы человека T98G in vitro.
I Ключевые слова: антиидиотипические антитела, гибридома, клеточная культура, морфин, налок-сон, синтез ДНК
Конфликт интересов: авторы заявили об отсутствии конфликта интересов.
Для цитирования: Трофимов А.В., Рак А.Я., Берзина А.Г., Ульянова Л.И., Гамалея Н.Б., Климова Т.А., Станкова Н.В. Антиидиотипические моноклональные антитела к морфину: получение, свойства и перспективы использования. Биомедицина. 2019;15(2):63-68. https://doi.org/10.33647/2074-5982-15-2-63-68
Поступила 28.03.2019
Принята после доработки 03.04.2019
Опубликована 10.06.2019
ANTI-IDIOTYPIC MONOCLONAL ANTIBODIES AGAINST MORPHINE: PRODUCTION, PROPERTIES AND PROSPECTS OF USE
Alexandr V. Trofimov1, Alexandra Ya. Rak1, Asya G. Berzina2*, Lyudmila I. Ulyanova2, Natalia B. Gamaleya2, Tatyana A. Klimova2, Natalia V. Stankova3
1 State Research Institute of Highly Pure Biopreparations of the Federal Medical and Biological Agency of Russia 197110, Russian Federation, Saint Petersburg, Pudozhskaya str., 7
2 V. Serbsky Federal Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology 119034, Russian Federation, Moscow, Kropotkinskiy lane, 23
3 Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia 143442, Russian Federation, Moscow region, Krasnogorsk district, Settlement Svetlye Gory, building 1
■ This paper describes a technique for producing anti-idiotypic monoclonal antibodies (Ab2) against two morphine derivatives. The specificity of the obtained antibodies was investigated using enzyme immunoas-say. The biological activity of the antibodies was studied using an in-vitro model of human glioblastoma T98G cell line prolifer ation.
■ Keywords: antiidiotypic antibodies, hybridoma, cell culture, morphine, naloxone, DNA synthesis Conflict of interest: the authors declare no conflict of interest.
For citation: Trofimov A.V., Rak A.Ya., Berzina A.G., Ulyanova L.I., Gamaleya N.B., Klimova T.A., Stan-kova N.V. Anti-Idiotypic Monoclonal Antibodies against Morphine: Production, Properties and Prospects of Use. JournalBiomed. 2019;15(2):63-68. https://doi.org/10.33647/2074-5982-15-2-63-68
Submitted 28.03.2019 Revised 03.04.2019 Published 10.06.2019
Введение
Разработка вакцины для лечения опиат -ной зависимости имеет важное практическое значение, поскольку предупреждение дальнейших рецидивов у больных, прошедших курс лечения, является наиболее эффективной мерой. В качестве одного из перспективных направлений может рассматриваться использование для вакцинации иммунобиологических препаратов, полученных на основе антиидиотипиче-ских (вторичных) антител, являющихся белковыми имитаторами исходных антигенов [2, 4]. Для получения антиидиотипи-ческих антител к двум производным морфина нами были использованы первичные моноклональные антитела (МАЬ1) к 3-кар-боксиметильному (КММ) и 6-гемисукци-нильному (ГСМ) производным морфина, а именно — производным по гидроксиль-ным остаткам при атомах углерода в 3-м и 6-м положениях фенантренового кольца молекулы морфина.
Цель работы — получение, характеристика, проверка иммуногенных и морфи-ноподобных свойств антиидиотипических моноклональных антител (АЬ2) к двум производным морфина.
Материалы и методы
Мышей линии Ва1Ь/с иммунизировали ранее полученными МАЬ1 к двум производным морфина (клоны 3К11 и 6G1,
распознающие разные участки молекулы морфина) [1]. Антитела, конъюгиро-ванные с гемоцианином, вводили в дозе 10 мкг/мышь в смеси с полным адъюван-том Фрейнда (ПАФ). На 30-й день животным вводили внутривенно 5 мкг МАЬ1 в физ. р-ре, после чего (на 4-й день) животных умерщвляли и из паховых и брюшных лимфоузлов выделяли спленоциты и лимфоциты. Затем клетки смешивали с клетками миеломы мыши линии SP 2/0 в соотношении 2:1 и проводили гибридизацию по методу Мильштейна — Келера. Для выделения аффинных антиидиоти-пических (АИ, АЬ2) антител из асцитных жидкостей были приготовлены иммуно-сорбенты 3К11-сефароза и 6G1-сефароза. Специфичность моноклональных АЬ2 антител определяли с помощью ИФА в реакции с пероксидазными конъюгатами МАЬ1 — 3К11 и 6G1. АЬ3 иммунный ответ изучали на кроликах породы советская шиншилла. Схема иммунизации представлена в табл. 1.
Титр АЬ3 антител в сыворотках крови определяли с помощью непрямого метода ИФА, используя в качестве антигена на твердой фазе конъюгат фенилазопроиз-водного морфина по 2-му атому углерода с лизоцимом (ФАМ-лиз).
Для оценки АЬ2 антител по способности проявлять морфиноподобные свойства in vitro была использована культура глиобластомы человека линии T98G с ярко
Таблица 1. CxeMa иммунизации кроликов для получения Ab3 антительного ответа Table 1. A scheme describing immunization of rabbits for obtaining the antibody Ab3 response
Вводимый Способ введения антигена
антиген 1-я инъекция — 0 день 2-я инъекция — 15-й день
0,2 мг антигена в 2 точки внутримышечно с ПАФ, 1:1 0,2 мг антигена в 4 точки подкожно вдоль хребта с неполным адъювантом Фрейнда (НАФ), 1:1
АИ-К11В АИ-GI 3-я инъекция — 30-й день 4-я инъекция — 45-й день
0,2 мг антигена в 4 точки подкожно вдоль хребта с НАФ (1:1) 0,2 мг антигена в 2 мл физ. р-ра внутривенно
выраженной экспрессией опиоидных рецепторов. Биологический эффект АЬ2 антител в широком диапазоне доз (от 0,39 до 25 мкг на 1 мл полной питательной среды — 1111С) проверяли по их способности влиять на синтез ДНК в культуре клеток в сравнении с действием морфина и налок-сона, обладающих агонистическим и антагонистическим действием по отношению к ц-опиоидным рецепторам соответственно. Культивирование клеток и постановку экспериментов проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах, как было указано ранее [3]. Интенсивность биологического эффекта антител и ПАВ оценивали по активности синтеза ДНК в клеточных культурах, которую измеряли по скорости включения метил-3Н1-тимидина во вновь синтезируемую ДНК и выражали в импульсах в мин (имп/мин).
Результаты и их обсуждение
В результате проделанной работы были получены 3 клона-продуцента АЬ2, из которых два (АЬ2-К11А и АЬ2-К11В), по данным конкурентного ИФА, продуцировали антитела, специфичные к МАЫ-3К11, тогда как клон АЬ2^1 явился продуцентом АЬ2, распознающих МАb1-6G1. Известно, что в результате иммунизации первичным антигеном, согласно теории Ерне, образуется целый каскад идиотипов антител (рис. 1), причем АЬ3 антитела обладают АЬ1-подобными свойствами (рис. 2).
Иммунизация кроликов полученными АЬ2 антителами индуцировала продукцию АЬ3 антител у животных. Проверка специфичности выделенных АЬ3 антител методом ИФА с лизоцимными конъюга-тами трех производных морфина (табл. 2) показала, что они обладают способностью
Рис. 1. Каскад антител (Ab), образующихся при им- Рис. 2. Специфичность Abi, Ab2 и Ab3 антител пер-мунизации.
вичным антигеном (Ag). Fig. 2. The specificity of th to the primary antigen (Ag).
Fig. 1. The cascade of the antibodies (Ab) formed during Fig. 2. The specificity of the Abl, Ab2 and Ab3 antibodies immunization.
связываться с теми производными, которые были использованы для получения АЬ1 антител (КММ, ГСМ), а также с ФАМ-лиз. Полученные результаты свидетельствуют также о принадлежности АЬ3 антител к р2-типу.
Изучение динамики накопления АЬ3 антител в сыворотке кроликов, иммунизированных моноклональными АЬ2 антителами, показало, что пик продукции АЬ3 антител приходится на 31-е сут от последней иммунизации (табл. 3), при этом концентрация антител достигала 31692 нг/мл, что было существенно выше ранее полученных результатов, когда для иммунизации животных использовались поликло-нальные АЬ2 антитела (200 нг/мл) к тем же антигенам.
Проверка биологической активности анти-идиотипических антител (АЬ2) на культуре перевиваемой линии глиобластомы человека T98G, клетки которой несут на своей поверхности опиоидные к- и ц-рецепторы, показала, что антитела АЬ2-К11В и Аb2-G1, используемые в диапазоне доз 0,39-10 мкг/мл, активируют подобно морфину синтез ДНК в культуре клеток T98G (рис. 3). Причем максимальная интенсивность синтеза ДНК в клетках линии T98G у антиидиотипи-ческих антител АИ-К11В, полученных на основе АЫ-КПВ, достигалась при концентрации 6,25 мкг/мл, аналогично морфину, тогда как у АИ^1, полученных на основе АЫ^1 антител, этот эффект был более выражен в сравнении как с морфином, так и с АИ-К11В антителами, и достигал максимума при концентрации 3,125 мкг/мл. Далее мы попытались выяснить, является ли механизм действия АЬ2 антиидиотипи-ческих антител в культуре клеточной линии T98G аналогичным действию морфина, который активирует клетки, главным образом, через ц-опиоидные рецепторы. В клеточные культуры одновременно с морфином или АЬ2 антиидиотипическими антителами был введен налоксон, внесение
Таблица 2. Иммунологическая специфичность Ab3 антител
Table 2. The immunological specificity of Ab3 antibodies
Наименова- Антиген, иммобилизованный на плате
KMM-лиз. ФAM-лиз. ГСМ-лиз.
Ab1 K11 + + -
Ab1 G1 - - +
Ab3 АИ-К11В + + +
Ab3 АИ-GI + + +
Таблица 3. Динамика образования Ab3 антител Table 3. The dynamics of formation of Ab3 antibodies
Сутки АИ-К11В АИ^1
Ab3 нг/мл Ab3 нг/мл
16 4804 9964
28 12 636 19 158
31 24 756 31 692
37 33 531 28 634
50 30 864 19 646
которого в культивируемые лимфоциты человека, как мы показали ранее, нейтрализует эффект морфина, стимулирующий синтез ДНК в этих культурах [3]. Результаты оценки нейтрализующего эффекта на-локсона представлены на рис. 3, из которого видно, что налоксон полностью блокирует не только стимулирующий эффект синтеза ДНК в культурах T98G, вызванный морфином, но также полностью устраняет эффект стимуляции, вызванный АИ антителами, при всех испытанных концентрациях препаратов.
Заключение
Таким образом, полученные нами мо-ноклональные антиидиотипические АЬ2 антитела к двум производным морфина по своей способности индуцировать иммунный АЬ1-подобный АЬ3 ответ могут рассматриваться в дальнейшем как белковый имитатор производных морфина. Специфичность выделенных из кроличьей сыворотки крови АЬ3 антител шире, чем
A концентрация каждого препарата, мкпмт Б концет р.ация н.аждою npen,a|),ai,a, mKilrni
Рис. 3. Оценка биологической активности морфина (А) и Ab2 (Б) в культуре клеток T98G. Fig. 3. The assessment of the biological activity of morphine (А) and Ab2 (Б) in a T98G cell culture.
у исходных моноклональных Ab1 антител. Пик продукции Ab3 антител приходится на 30-35 дни после последней иммунизации. У Ab2 антител, полученных на основе Ab1-K11B антител, максимальная интенсивность индукции пролиферативного ответа в клетках линии T98G достигается при концентрации 6,25 мкг/мл, как в слу-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ | REFERENCES
1. Берзина А.Г., Гамалея Н.Б., Сергеева В.Е., Трофимов А.В., Кротов Г.И., Ульянова Л.И. Получение поликлональных и моноклональных антител к двум производным морфина. Вопросы наркологии. 2016;(11-12):39-53. [Berzina A.G., Ga-maleya N.B., Sergeeva V.E., Trofimov A.V., Krotov G.I., Ul'yanova L.I. Poluchenie poliklonal'nyh i monoklon-al'nyh antitel k dvum proizvodnym morfina [Preparation of polyclonal and monoclonal antibodies to two morphine derivatives]. Voprosy narkologii [The questions of narcology]. 2016;(11-12):39-53. (In Russian)].
2. Гамалея Н.Б., Берзина А.Г. Вакцина от наркотиков — новое перспективное направление профилактики злоупотребления психоактивными веществами. Наркология. 2010;(11):70-83. [Gama-leya N.B., Berzina A.G. Vaktsina ot narkotikov — novoe perspektivnoe napravlenie profilaktiki zlou-potrebleniya psikhoaktivnymi veshhestvami [Drug vaccine — a new promising area of prevention of
чае морфина, а у полученных на основе G1 антител — при концентрации 3,125 мкг/мл. Таким образом, мы установили, что АИ-К11В и АИ^1, как и морфин, оказывают стимулирующее влияние на пролифератив-ные процессы перевиваемой клеточной линии T98G, что свидетельствует об их мор-финоподобных свойствах.
substance abuse]. Narcology. 2010;(11):70-83. (In Russian)].
3. Гамалея Н.Б., Ульянова М.А., Берзина А.Г., Кротов Г.И., Ульянова Л.И. Оценка биологической активности морфина, лоперамида и налоксона на культуре перевиваемой клеточной линии человека T98G. Наркология. 2017;(1):39-44. [Gama-leya N.B., Ul'yanova M.A., Berzina A.G., Krotov G.I., Ul'yanova L.I. Otsenka biologicheskoj aktivnosti morfina, loperamida i naloksona na kul'ture perevivaemoj kletochnoj linii cheloveka T98G [Assessment of biological activity of morphine, loperamide and naloxone on human cell line culture T98G]. Narcology. 2017;(1):39-44. (In Russian)].
4. Schabacker D.S., Kirschbaum K.S., Segre M. Exploring the feasibility of an anti-idiotypic cocaine vaccine: analysis of the specificity of anticocaine antibodies (Ab1) capable of inducing Ab2p anti-idiotypic antibodies. Immunology. 2000;100:48-56.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ | INFORMATION ABOUT THE AUTHORS
Трофимов Александр Викторович, ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России;
e-mail: honevagaric@vandex.ru
Рак Александра Яковлевна, ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» ФМБА России;
Берзина Ася Григорьевна*, к.б.н., ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр психиатрии и наркологии им. В.П. Сербского» Минздрава России; e-mail: berzina07@mail.ru
Ульянова Людмила Ивановна, д.б.н., ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр психиатрии и наркологии им. В.П. Сербского» Минздрава России; e-mail: oulvanova.46@mail.ru
Гамалея Наталия Борисовна, д.м.н., проф., ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр психиатрии и наркологии им. В.П. Сербского» Минздрава России; e-mail: natgam@mail.ru
Климова Татьяна Андреевна, к.б.н., ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр психиатрии и наркологии им. В.П. Сербского» Минздрава России;
Станкова Наталия Владимировна, к.б.н., ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства России»; e-mail: sinavva@vandex.ru
Alexandr V. Trofimov, State Research Institute of Highly Pure Biopreparations of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: honevagaric@vandex.ru
Alexandra Ya. Rak, State Research Institute of Highly Pure Biopreparations of the Federal Medical and Biological Agency of Russia;
Asya G. Berzina*, Cand. Sci. (Biol.), V. Serbsky Federal Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology; e-mail: berzina07@mail.ru
Lyudmila I. Ulyanova, Dr. Sci. (Biol.), V. Serbsky Federal Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology;
e-mail: oulvanova.46@mail.ru
Natalia B. Gamaleya, Dr. Sci. (Med.), Prof., V. Serbsky Federal Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology; e-mail: natgam@mail.ru
Tatyana A. Klimova, Cand. Sci. (Biol.), V. Serbsky Federal Medical Research Centre for Psychiatry and Narcology;
Natalia V. Stankova, Cand. Sci. (Biol.), Scientific Center of Biomedical Technologies of the Federal Medical and Biological Agency of Russia; e-mail: sinayva@yandex.ru
* Автор, ответственный за переписку / Corresponding author
