CC BY
60
ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНОГО ФЕРМЕНТНОГО МИКРОДИАГНОСТИКУМА МЕТОДАМИ НАНОТЕХНОЛОГИИ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В КЛИНИКО-БИОХИМИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ
Сухоруков Б.И., Тихоненко С.А., Сабурова Е.А, Дубровский А.В., Стаменов М.Н., Шабарчина Л.И.
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино,
Московская обл. E-mail: bisukhorukov@rambler.ru
Разрабатывается новый тип диагностикума. основным элементом которого является мультислойная полиэлектролитная нано- и микрокапсула с включенным в нее ферментом. Исходным субстратом, инкапсулированного фермента является один из компонентов анализируемой среды. По сравнению с существующими в медицине ферментативными методами анализа биожидкостей предлагаемый микродиагностикум имеет явные преимущества, поскольку инкапсулированный фермент, во-первых, сохраняет свою активность в течение нескольких месяцев, в то время как активность фермента в растворе в «свободном» состоянии падает практически до нуля через несколько дней, во-вторых, сохраняет активность в анализируемой биологической жидкости, содержащей протеиназы, исключая тем самым необходимость их удаления из анализируемой среды, в-третьих, может быть использован многократно, уменьшая тем самым расход фермента.
Введение
Клинико-биохимические анализы относятся к числу самых распространенных методов используемых для диагностики заболеваний человека. Такого рода исследования, как известно, включают общие анализы крови и мочи, изучение состава ряда других биожидкостей организма, Общим недостатком существующих методов качественного и количественного анализа нативных биологических жидкостей является необходимость их фракционирования. До недавнего времени эти анализы проводились с помощью химических методов, но в связи с токсичностью многих из них, низкой чувствительностью и другими недостатками, в настоящее время широкое распространение получили энзимологические методы, когда используется «свободный» фермент. Однако, наряду с явными преимуществами такого подхода, есть и ряд недостатков: неоднозначность анализа в присутствии других, агрессивных к ферменту высокомолекулярных соединений, в частности, протеаз и других внутриклеточных компонентов, одноразовое использование фермента и т.д. Таким образом, появляется необходимость защитить фермент-сенсор от неблагоприятного воздействия сохранив при этом к нему доступ субстрата. Одним из видов такой защиты нам представляется инкапсулирование ферментов в полиэлектролитные нано-и микрокапсулы (ПНМК) изготавливаемые методом поочередного наслаивания противоположно заряженных полиэлектролитов на дисперсные частицы нано- и микро размеров с последующим разрушением и удалением этих частиц. Это можно рассматривать как один из подходов нанотехнологии понимая, что ее основной задачей является получение новых материалов и изделий исходя из наноразмерных объектов в результате их самосборки в объеме или на определенной функциональной поверхности.
Цель и результаты работы .
Целью данной работы является создание и изучение полиэлектролитного ферментного микродиагностикума как средства микро- и наноразмерной величины, позволяющеего распознавать и количественно определять низкомолекулярные вещества в нативных биологических жидкостях. Такой микродиагностикум выполнен в виде ансамбля полиэлектролитных микрокапсул (ПЭ-микрокапсул) с включенным в
них ферментом, оболочки которых состоят из чередующихся слоев поликатиона и полианиона.
Разработанная нами технология получения содержащих ферменты полиэлектролитных нано- и микрокапсул состоит из: 1- стадии получения в качестве «кора» микросферолита СаСО3 с включенным в него ферментом; 2,3- стадии поочередного наслаивания селективно подобранных противоположно заряженных полиэлектролитов на частицы кора и формирования мультислойной оболочки; 4,5-стадии разрушения и удаления карбонатного компонента кора с последующим контролем за функциональным сотоянием инкапсулированного фермента. Схематически эта технология представлена на рис.1.
Важным свойством оболочки ПНМК является ее полупроницаемость -проницаемость для низкомолекулярных соединений и непроницаемость для высокомолекулярных веществ и крупных частиц. Благодаря этому свойству полиэлектролитной оболочки, содержащая фермент микрокапсула помещенная в многокомпонентную среду становится анализатором в ней низкомолекулярных веществ - субстратов, ингибиторов или активаторов инкапсулированного фермента. Включение ферментов в ПЭ-микрокапсулу и свойства инкапсулированного фермента продемонстрирлованы на примере лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и уреазы. Инкапсулирование ЛДГ позволило получить микродиагностикум на пировиноградную и молочную кислоты, а уреазы - микродиагностикум на мочевину. При формировании мультислойных полиэлектролитных оболочек микрокапсул в работе использованы два полианиона - полистиролсульфонат (ПСС) и декстрансульфат (ДС) и два поликатиона - полиаллиламин (ПАА) и полидиаллилдиметиламмоний хлорид (ПДАДМА). С целью избежать или уменьшить вероятность прямого контакта фермента с полиэлектролитами оболочки, способными его инактивировать, мы разработали методологию подбора пары противоположно заряженных полиэлектролитов и конструирования оболочек капсул оптимальных для функционирования фермента. Для проведения аналитических исследований по определению мочевины в крови и моче были выбраны уреазные микрокапсулы с составом оболочки (ПСС/ПАА)3 ПСС и (ПСС/ПАА)5ПСС. Были изучены структура и свойства этих капсул.
Для микрокапсул содержащих ЛДГ были сформированы оболочки состава: (ПАА/ПСС)з, (ПАА/ДС)(ПАА/ПСС)2, (ПАА/ДС)з, (ПАА/ДСЬ(ПАА/ПСС). Последняя оказалась наиболее оптимальной для функционирования микродиагностикума. Для нее определены структурные параметры и свойства. Она же и была использована для определения пирувата в сыворотке крови. При изучении аналитических возможностей ПЭ микрокапсул содержащих уреазу и ЛДГ мы не только использовали известные, но
и разработали новые методы регистрации субстратов. Так предложен метод определения количества мочевины в среде по изменению скорости осаждения микрокапсул заполняемых карбонатом металлов образуемым при разложении мочевины инкапсулированной уреазой в присутствии Ме++.
Из полученных данных следует, что по сравнению с существующими в медицине ферментативными клинико-биохимическими методами анализа биожидкостей предлагаемый нами микродиагнотикум имеет явные преимущества.
• Фермент, включенный в мультислойную полиэлектролитную капсулу, может, по предварительным данным, сохранять свою активность в течение нескольких месяцев, в то время как активность фермента в растворе, «в свободном» состоянии падает практически до нуля в течение нескольких дней.
• Фермент, включенный в полиэлектролитную капсулу, полностью сохраняет свою активность в анализируемой биологической жидкости, содержащей протеиназы, что исключает необходимость удаления протеиназ из анализируемой биологической жидкости, что достаточно трудоемко. Микродиагностикум позволяет проводить анализ биожидкости без ее предварительного фракционирования.
• Предлагаемый нами способ дает возможность многократного использования микродиагностикума. Следует отметить, что в одной полиэлектролитной капсуле содержится лишь десятки пикограммов фермента.
• Предлагаемый способ в перспективе позволит определять концентрации анализируемого вещества с помощью нескольких или даже одной капсулы, когда оболочка помечена флуоресцентной или радиоактивной меткой.
Технология изготовления капсул позволяет варьировать их диаметр от 2 до 10 мкм и толщину оболочки от 10 до 100 нм. Малый расход материалов и использование простых аналитических устройств является еще одним преимуществом, указывающим на возможность коммерческого использования полиэлектролитных ферментных микродиагностикумов. Их потенциальный рынок охватывает большое количество медицинских учреждений, предприятия пищевой промышленности и центры мониторинга природно-технической сферы.
THE PRODUCTION OF POLYELECTROLYTE ENZYMATIC MICRODIAGNOSTICUM BY NAOTECNOLOGY METHODS AND ITS USING FOR CLINICAL BIOCHEMICAL ANALYSES
Sukhorukov B.I., Tikhonenko S.A., Saburova E.A, Dubrovsky A.V., Stamenov M.N., Shabarchina L.I.
Institute of Theoretical and Experimental Biophysics RAS, Pushchino, Moscow Region.
A new type of a wide-purpose diagnosticum including a medical use is developed. The major element of the diagnosticum is a multilayer polyelectrolyte nano- and microcapsule with included enzyme, which can provide qualitative and quantitative information on its substrate, inhibitor or activator present in the medium to be analyzed. Compared to enzymatic methods for analysis of biological fluids, available in medicine, the microdiagnosticum we propose has many advantages. An encapsulated enzyme, first, retains its activity for at least several months, whereas the activity of a “free” enzyme in solution falls actually to zero in several days, second, retains the activity in proteinase-containing biological fluids under analysis thus eliminating the need to remove proteinases from the medium, third, it can be used repeatedly thus decreasing consumption of enzyme.
