CC BY
102
Л. О. Ягодина, Ю. В. Чернохвостов
ИММОБИЛИЗАЦИЯ АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ИНКАПСУЛЯЦИЕЙ В ПОЛИМЕРНЫХ НАНО- И МИКРОКАПСУЛАХ
Ключевые слова: капсулирование в ПНМК, ацетилхолинэстераза.
Получены полимерные капсулы с порами наноразмера, включающие активный фермент ацетилхолинэстеразу (AChE) способную функционировать длительное время. Рассмотрена возможность использования капсул с AChE в потенциометрических микроэлектродах для экспресс-анализа на содержание вредных примесей в промышленных отходах
Keywords: microcellularpolyelectrolytic coating, acetylholynesterase.
The microcellular polyelectrolytic coating containing acetylholinesterase has been investigated. The activity of coatining AChE is consistent about 40% of nonimmobilized enzyme.
Введение
Ацетилхолинестераза (АСИБ) - фермент класса гидролаз, отвечающий за гидролиз нейромедиатора ацетилхолина. Реакция гидролиза ацетилхолина до холина и остатка уксусной кислоты, катализируемая ацетилхолинэстеразой, необходима для инактивации нейромедиатора в синаптической щели и перехода клетки-мишени в состояние покоя (например, при расслаблении мышечной клетки). Современные синтетические ингибиторы ацетилхолинэстеразы - это чаще всего фосфороорганические соединения, которые, как правило, являются ядами для человека и присутствие их в окружающей среде крайне нежелательно. Необходимость обнаружения в среде ингибиторов ацетилхолинэстеразы привела к созданию датчиков, улавливающих различные концентрации ядов. Так, например, описаны различные биосенсоры для обнаружения пестицидов, в частности и на основе иммобилизованной ацетилхолинэстеразы [1-3]. Значительный интерес, как нам кажется, представляет задача создания портативного прибора на основе рН-метра, позволяющего определять ингибирование АСИБ вредными примесями в промышленных отходах [4]. Мы предполагаем, что создание ацетилхолинэстеразного наносенсора по методике, разработанной М.М. Монтрелем [5] и впервые примененной в его работе [6], позволит впервые зарегистрировать изменения в активности АСИБ с большой степенью точности.
В работе [6] используется созданный по оригинальной методике мультислойный материал, который служит основой для создания биосенсоров и биокаталитических систем, поскольку ферменты при таком способе иммобилизации:
• свободно размещаются внутри микрокапсул и не связаны со стенками микрокапсул;
• защищены слоями полиэлектролитов от неблагоприятных воздействий внешней среды (микробы, протеазы и другие инактивирующие факторы);
• имеют свободный доступ субстратов, проходящих через стенки ячеистых полиэлектролитов [5].
Приведенные выше свойства, как мы надеемся, позволят успешно применить методику иммобилизации ацетилхолинэстеразы (AChE) капсулированием в полиэлектролитные нано- и микрокапсулы (ПНМК) для разработки ферментативного биосенсора с целью решения задач современной биотехнологии.
Материалы и методы
Использовали ацетилхолинэстеразу (AChE) из эритроцитов быка фирмы Sigma. В качестве заряженных полиэлектролитов использовали
полистиролсульфонат натрия (ПСС) с молекулярной массой 70 000 и полиалиламин гидрохлорид (ПАА) с молекулярной массой 56 000 фирмы Sigma (США). Составные микросферолиты СаСО3-белок (коровые частицы) и полиэлектролитные микрокапсулы,
содержащие АХЭ, получали, как это описано ранее [5]. ПНМК изготавливали путем поочередного наслаивания противоположно заряженных
полиэлектролитов на дисперсные частицы нано- и микроразмеров, так называемых коров, с последующим разрушением этих частиц [7,8]. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорда [9]. Активность фермента,
инкапсулированного в ПНМК, определяли методом Эллмана [10]. Использовали субстрат -
ацетилтиохолин фирмы Sigma. Все растворы
готовили непосредственно перед опытом. Измерения скорости реакции, катализируемой AChE, проводили на спектрофотометре Perkin-Elmer (USA) в 1 см термостатируемой кювете при 36° С. pH растворов определяли на рН-метре OP-204/1 с точностью 0,02 ед. в термостатируемой ячейке при 36° С.
Результаты и их обсуждение
В данной работе проводили инкапсуляцию AChE из эритроцитов быка, как это описано в методах, наслаивая 3, 5, 6, 9 или 10 слоев полиионов, начиная с ПАА или ПСС. Попытка начинать инкапсуляцию с ПАА не привела к созданию активного инкапсулированного фермента. Количество слоев, начинающихся с ПСС, влияло на активность инкапсулированного фермента незначительно, вероятно, в виду малой молекулы
субстрата. При этом, АОИБ инкапсулированная в ПНМК, проявляла ферментативную активность, сравнимую со свободным ферментом (рис. 1).
Рис. 1 - Оценка активности капсулированной ацетилхолинэстеразы по методу Эллмана: концентрация AChE по Брэдфорду составляла 1,6 мкг/мл. Свободный фермент брали в той же концентрации; в контроле проверяли активность всех компонентов в буфере, исключая только ацетилхолинэстеразу
Как видно из рисунка, активность фермента в ПНМК составляет 4З-З0% от активности свободного фермента, что является хорошим результатом для иммобилизованных ферментов.
Нами была проведена проверка стабильности капсулированной ацетилхолинэстеразы, как
известно, неустойчивого фермента, быстро разрушающегося с потерей активности при комнатной температуре. Мы выдерживали капсулированный, как описано в методах, фермент, капсулы которого содержали З слоев в последовательности ПСС-ПАА-ПСС-ПАА-ПСС при комнатной температуре от І до 4-х суток. В качестве сравнения брали свободную AChE, находящуюся при тех же условиях в 0,ІМ K-фосфатном буфере. Свободная ацетилхолнэстераза теряла активность уже на вторые сутки, тогда как капсулированная AChE работала и через 4 дня. Фермент в капсулах сохранял ферментативную активность длительное время (около 2-х недель) при хранении при +4С°, что позволяет считать AChE достаточно перспективным ферментом для работы в микрослоях потенциометрического наносенсора на основе электрода рН-метра. Данный потенциометрический наносенсор ранее был применен при капсулировании уреазы [б] с последующей фиксацией капсул полиэлектролитными
мультислоями. Причем наиболее высокую чувствительность биосенсора и линейность его ответа авторы [б] наблюдали при изменении концентрации субстрата от 0,2 до 20 mM.
Рис. 2 - Активность свободной и
инкапсулированной ацетилхолинэстеразы в зависимости от времени хранения при комнатной температуре. Активность дана в отношении к свободному ферменту сразу же после разведения в
0,01 М К-фосфатном буфере. Активность инкапсулированного в ПНМК фермента показана на рисунке черным цветом
С целью уточнения рабочих концентраций ингибиторов, действующих на капсулированную в ПНМК АОИБ, нами была проведена оценка условий ингибирования капсулированной в ПНМК ацетилхолинэстеразы. На рис. 3 прерывистой линией показана кривая скорости реакции, катализируемой АОИБ, инкапсулированной в трех микрослоях ПСС-ПАА-ПСС, в сравнении со свободной ацетилхолинэстеразой в зависимости от концентрации ингибитора в реакционной смеси.
.0
о
р
о
прозерин, тМ
Рис. 3 - Начальная скорость реакции ДОИБ в капсулах (прерывистая линия на рисунке) и в свободном состоянии (непрерывная линия): 5 тМ ацетилтиохолина, 2 тМ йТМБ, 0,1 М К-
фосфатный буфер, рН 8,0; 1 =36С°
Таким образом, нами показано, что ацетилхолинэстераза инкапсулированная в ПНМК не является в широком смысле «иммобилизованной», поскольку она проявляет кинетику свободного фермента в растворе, кроме того, фермент проявляет функциональную активность и стабильность
ІІ8
фермента значительно увеличивается - фермент не Литература
1. R.Sinha, M.Ganesana, S.Andreescu, L. Stanciu. Anal Chim Acta, 661, 195-199 (2009).
2. Qu Y., Sun Q, Xiao F, Shi G, Jin L. Bioelectrochemistry, 77, 139-144 (2010).
3. Х. Май Тхи Тхань, Э.П. Медянцева, Р.М. Варламова,
Г.Р. Сахапова, О.В.Николаева. Вестник Казанского технологического университета, 15, 15, 149-157 (2012).
4. С.М. Романова, В.И. Трескова, М.В. Шулаев. Вестник Казанского технологического университета, 14, 22, 68 -74 (2011).
5. М.М. Монтрель, В.И. Терновский, М.Г. Фомкина, А.И. Петров. Пат. РФ 2333231 (2008).
теряет активность до двух недель при +4°С.
6. В.И. Терновский, Ю.В. Чернохвостов, М.Г. Фомкина, М.М. Монтрель. Биофизика, 52, 825-829 (2007).
7. G. B. Sukhorukov, E. Donath, S. Davis, H. Lichtenfeld, F. Caruso, V. I. Popov, and H. Mohwald, Polym. Adv. Technol. 9, 759-767 (1998).
8. М.Г. Фомкина, Л.О. Ягодина, А.М. Монтрель, Г.В. Минкабирова, И.С. Занавескина, Е.И. Маевский. Международный форум по нанотехнологиям Rusnanotech (Москва, 3-5 декабря 2008), Москва, с. 97, 2008,
9. G.L. Ellman, K.D.Courtney, V.J.Andres. Biochem. Pharmacol. 7 , 88-95 (1961).
10. M.M. Bradford. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
© Л. О. Ягодина - канд. биол. наук, доц. каф. химической кибернетики КНИТУ, floral2010@mail.ru; Ю. В. Чернохвостов -инженер Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского) федерального университета.
