CC BY
164
Л. О. Ягодина
ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДА ЭЛЛМАНА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИНЕТИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ РЕАКЦИИ, КАТАЛИЗИРУЕМОЙ АЦЕТИЛХОЛИНЭСТЕРАЗОЙ КРЫС RATUS NORVEGICUS
Ключевые слова: ферментативная кинетика, ингибирование, ацетилхолинэстераза.
Определена область квазистационарности реакции гидролиза ацетилхолина ферментом AChE (ацетилхолинэстераза) из экстрактов локомоторных мышц и головного мозга крыс. Выделен стационарный участок эстеразной реакции, полученной на экстрактах тканей. Показано, что ингибитор прозерин неселективен для AChE из головного мозга и мышцы EDL, константа ингибирования составляет К|(прозерин)=0,4*10-5М. Прединкубация мышечных (EDL) экстрактов с ферментом коллагеназой существенно влияет на начальную скорость реакции, катализируемой AChE
Keywords: enzyme kinetics, inhibition, acetylholinesterase.
The reaction of acetylthioholin hydrolysis catalysed by AChE from brain and EDL of ruts Rutus Norvegicus has been investigated. The inhibition constants for neostigmin of AChE from extractshave have been determinate and consist of KI(neostigmin)=0,4*10-5M
Введение
Ацетилхолинэстераза (AChE) КФ 3.1.1.7. (ацетилхолин - ацетилгидролаза) - фермент класса гидролаз, катализирующий гидролиз ацетилхолина, а также других эфиров холина, обладает гидролаз-ной функцией. Ферментативная реакция, катализируемая ацетилхолинэстеразой, заключается в гидролизе нейромедиатора ацетилхолина:
Ацетилхолин — AChE ^ Холин + Уксусная кислота
Первичная структура AChE включает 543 остатка и практически не имеет отличий для белков из тканей разных органов одного организма. Активный центр AChE включает функциональный His 447, Ser 203, Glu 334 и консервативен для всех организмов. Физиологическая роль AChE состоит в ограничении действия нейромедиатора - ацетилхолина, секретируемого из нервного окончания в синаптическую щель, составленную постсинаптической и пресинаптической мембраной. В нервно-мышечном синапсе в норме ацетилхолин действует на постсинаптическую мембрану короткое время (1—2 мс), и сразу же начинает разрушаться под действием ацетилхолинэстеразы. Ацетил-холинэстераза присутствует в центральной нервной системе (преимущественно в области постсинаптиче-ских мембран), а также в эритроцитах, электрических органах рыб и в змеином яде. В случае полной инактивации AChE на постсинаптической мембране происходит чрезмерное накопление в нервной клетке аце-тилхолина, что приводит к блокированию передачи нервных импульсов. Исходя из этого ясно, что вещества, способные угнетать активность AChE, обладают высокой токсичностью и крайне вредны. Однако, известны и нетоксичные или малотоксичные ингибиторы AChE, применяющиеся в медицине при болезни Паркинсона и ряде других заболеваний, сопровождающихся нарушениями нервно-мышечной проводимости. Ферментативная активность AChE традиционно определяется методом Эллмана [1], согласно которому измеряется восстановление ацетилтиохолина до холина с отщеплением ацетата, произошедшее за время 30 минут, по специфическому окрашиванию реагентом
DTNB (5,5'-дитиобис-(2-нитробензойной кислоты) на ацетат. Активность AChE по Эллману определяется в клинических лабораториях при диагностировании ряда заболеваний и как маркерная реакция на присутствие фосфоорганических ингибиторов фермента - AChE в промышленные отходах, сточных водах [2,3]). Исходя из ключевой роли AChE в механизме нервной проводимости, становится понятной актуальность исследований не только ее функциональной активности, но и кинетических параметров реакции, в частности, кинетики ингибирования AChE. Задачей данной статьи было определить границы выполнимости условий квази-стционарности реакции Эллмана для мышцы m.extensor digitorum longus (EDL) и головного мозга крыс линии Вистар с целью проверки применимости данной реакции для определения равновесных кинетических параметров, таких как начальная скорость реакции и константа ингибирования AChE.
Материалы и методы
Использовали ингибиторы бутирилхолинэ-стеразы (BuChE) iso-OMPA (Te-
tra(monoisopropyl)pyrophosphortetramide) [4] и аце-тилхолинэстеразы (AChE) прозерин (neostigmin) фирмы Sigma. Эстеразы из головного мозга и мышцы EDL крыс получали экстрагируя в гомогенаторе Поттера предварительно замороженный в жидком азоте целевой объект, добавляя 3-х кратный объем буфера А: 10 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, 0,5% Tween 20, 10 mM MgCl2, 2 mM EDTA. После добавления 0,02% Полимина P гомогенаты инкубировали в течение 15 минут на льду, затем центрифугировали 10 000 об/мин 20 минут для удаления клеточных обломков и ДНК. Реакционная смесь для определения эстеразной активности содержала 1 mM ацетилтиохолина, 1,2 mM DTNB, 5-30 мкл клеточного экстракта (1 мг/мл белка в кювете), 0,1 М K-фосфатный буфер рН 8,0; t = 36°C. Реакцию, катализируемую бутирилхолинэ-стеразой (BuChE), ингибировали добавлением специфического ингибитора 2*10-5M iso-OMPA. Все исходные растворы готовили непосредственно перед опытом, все используемые реагенты изготовлены
фирмой Sigma. Реакцию запускали добавлением субстрата - ацетилтиохолина после 5 минутного инкубирования экстракта с ингибиторами в реакционной смеси в термостатируемой кювете при 36°С. Кинетику ферментативной реакции восстановления ацетил-тиохолина AChE исследовали дифференциальным методом по измерению оптической плотности при 412 nm, пропорциональному концентрации одного из продуктов (ацетат), в условиях ингибирования бути-рилхолинэстеразы. Измерения скорости реакции, катализируемой AChE, проводили на спектрофотометре Perkin-Elmer (USA) в 1 см термостатируемой кювете при 36° С. В опытах по определению границ стационарности реакции записывали полные кинетические кривые A(t) от начала реакции до выхода на плато. Текущие скорости реакции (v=AA/At) рассчитывали как касательные к кинетической кривой в определенной точке. В опытах по определению констант ингибирования определяли начальные скорости реакции по наклону линейного участка кинетической кривой A(t), в интервал времени от 5 до 30 с от начала реакции. Концентрацию белка в экстрактах определяли по методу Брэдфорда [5]. pH растворов определяли на рН -метре OP-204/1 с точностью 0,02 ед. в термостатируемой ячейке при 36°С.
Результаты и их обсуждение
С целью определения квазистационарных условий реакции, регистрируемой по методу Эллмана, нами были записаны полные кинетические кривые A(t) от начала реакции (t~0) до выхода на плато, при этом скорость реакции AA/At определяли вдоль всей кинетической кривой.
На рис.1 и 2 представлены полные кинетические кривые A(t) реакции, катализируемой AChE из экстрактов головного мозга и мышцы EDL крысы, полученные усреднением по данным 11 независимых биологических экспериментов при трех повторных регистрациях. Как видно из рис. 1 и 2, реакция в случае экстрактов из EDL и головного мозга стационарна как минимум в течение 5 минут. Относительное содержание AChE к общему белку, очевидно, выше в экстрактах головного мозга, однако, как видно из рисунка, наиболее выражена стабильность реакции катализируемой AChE из мышцы EDL. Данную особенность кинетического поведения реакции из EDL можно объяснить структурными различиями якорных белков, in vivo присоединяющих AChE к постсинап-тической мембране в мышцах и мозге [6,7]. Несмотря на консервативность активного центра и практически отсутствие различий в первичной последовательности и пространственной структуре AChE из различных органов, время выхода на плато кинетических кривых, описывающих ферментативную реакции AChE , различается для мышц, мозга (рис.1 и 2) и, как показано ранее [7] сердца. Возможно, что различие в длительности квазистационарного участка ферментативной реакции AChE для разных органов связано с тем, что AChE работает в клетках в виде ассо-циатов из мономеров, димеров и тетрамеров AChE с различными коллагеноподобными белками, для нервно-мышечного синапса - это ColQ, для головного мозга - Prima (пролинбогатый белок). Причем в
мышцах 1, 2 или 3 тетрамера AChE могут связываться с тремя переплетенными коллагеноподобными «хвостами» (Col Q), образуя ассиметричные формы AChE, обозначаемые G2, G4 и А12, в зависимости от числа мономеров AChE [5].
Рис. 1 - Экспериментальные кривые реакции гидролиза ацетилтиохолина эстеразой AChE, содержащейся в экстрактах головного мозга и т. extensor digitorum longus (EDL): K-фосфатный буфер, 2 * 10'5 M iso-OMPA, общий белок 1 мг/мл, рН 8.0; 36°C
Рис. 2 - Зависимость скорости реакции, катализируемой ДОИБ из экстрактов, от времени регистрации реакции
Поскольку AChE из головного мозга и мышцы является сложной молекулой - гетероолигомером, в которой присутствуют различающиеся по составу и форме пролин - богатые коллагеновые структуры (ColQ в локомоторных мышцах и PRIMA в головном мозге), мы решили проверить влияние С-547 на активность AChE после разрушения коллагеноподобных структур в результате разрезания их коллагена-зой. Фермент коллагеназу (КФ 3.4.24.7) брали в концентрации 0,2 мг/мл и инкубировали с экстрактами EDL и мозга крыс различное время до запуска ре-
акции ацетилтиохолином. Использовали реакционную среду: 5 мМ АТОИ, 10 мМ РТЫБ, 2*10-5 М ІБО-ОМрА, 0,1 М К-фосфатный буфер, рН 8,0, 1 = 36 °С. Как следует из приведенных нами данных (табл. 1), активность АОИЕ под действием коллагеназы в экстрактах из мышцы ЕРЬ уменьшается в 2 раза за время прединкубации 30 минут. Этот результат косвенно подтверждает наше предположение [7] о существенной роли коллагенового хвоста в олигомере АОИЕ в экстрактах из ЕРЬ.
Таблица 1 - Начальная скорость реакции ДСИБ в локомоторной мышце БйЬ и мозге в зависимости от времени инкубации с коллагеназой (0,2 мг/мл)
орган или ткань крысы реакция без коллагеназы коллагеназа 20 минут коллагеназа 30 минут
головной мозг 0.0761±0,002 0.0759±0,002 0.0558±0,003
EDL 0.0678±0,003 0.0601±0,002 0.0349±0,003
Как показано ранее [8], белок ColQ (коллагеновый хвост AChE) заякоривается в постсинаптиче-ской мембраной нервно-мышечного синапса, и имеет 8 вариантов альтернативного сплайсинга а, кроме того, множество мутаций, каждая из которых приводит к серьезным заболеваниям - миопатиям и миостени-ям. Очевидно, что AChE, поскольку она находится на внешней стороне мембраны синапса, функционирует в условиях высоких локальных концентраций ионов, причем AChE не относится к мембрансвязанным ферментам - она не интегрирована с мембраной, а прикрепляется за счет ColQ. AChE является внеклеточным белком, поскольку функционирует в синаптической щели. Попробуем оценить, что может значительно влиять на скорость реакции, катализируемого AChE in vivo. Одним из самых сильных вариантов регуляции активности AChE в EDL может служить регуляция трехмерного пространственного расположения глобулы AChE в гетероолигомере, образованным с молекулой ColQ. В этом случае 1 молекула ингибитора, занимающая положение вблизи контакта AChE с пролин-богатой областью ColQ, способна повлиять на активность 4х3=12 глобул AChE, что может привести к чрезвычайно высокой чувствительности AChE в форме А12 преимущественно присутствующей в EDL. В пользу высказанного предположения косвенно свидетельствует, результат сравнительного анализа участка структуры ColQ и PRIMA, непосредственно контактирующего с WAP (W-W-W-триптофан богатой) областью AChE в гетероолигомерах А12 для EDL и G4 для головного мозга. Последовательности ColQ и PRIMA выравниваются вне участка контакта с AChE (вне W-W-W триптофан богатой области AChE) [8]. В области WAP контакта AChE с Prima имеется повторность из 10 циклизую-щихся не заряженных пролинов, тогда как контакт WAP AChE с ColQ со стороны ColQ содержит три пролина (p), три гидрофобных фенилаланина (f), зараженный положительно аргинин (r) и заряженный отрицательно (s) серин. Аминокислотная последовательность ColQ и Prima соответствующая контакту с WAP областью AChE:
60 pppppppppp Prima
61 lfpppff r g s ColQ
Сравнение аминокислотной последовательности показывает, что ColQ в области контакта с AChE имеет дополнительную (по сравнению с Prima) возможность присоединения какого-либо соединения к зарядам «гуанидиновой вилки» аргинина (r) и отрицательного серина (s), находящихся в гидрофобной области, образованной 3 фенилаланинами (f) [9]. Соседняя область, граничащая с контактом с WAP AChE, также несколько отличается:
50 icqcrppppl Prima
51 ccllmppppp ColQ
Выделенный 59 остаток циклического (p)
пролина крайне важен для образования AChE комплексов с Prima и ColQ: показано, что аминокислотная замена этого остатка приводит к разрушению гетероолигомеров А12 и G4 [10].
С целью обнаружения возможных кинетических различий связанных со структурным различием в коллагеновой части AChE из двигательной мышцы EDL и AChE из мозга крысы, было исследовано влияние на реакцию в экстрактах неспецифического ингибитора прозерина (неостигмин). На рис. 3 показан график зависимости начальной скорости реакции, определенной на квазистационарном линейном участке кривой A(t) в зависимости от концентрации субстрата ацетилтиохолина в условиях ингибирования прозерином. Определенная нами в координатах Лай-нуивера-Берка константа ингибирования ацетилхоли-нэстеразы из EDL по порядку величины совпадает с полученным ранее в электрофизиологии значением [6] и составляет К|(прозерин)=0,4*10"5 М.
[ATCh], mM
Рис. 3 - Зависимость начальной скорости реакции, катализируемой эстеразой из экстракта БйЬ крысы от концентрации субстрата ацетилтиохолина: 1) кинетическая кривая реакции в К-фосфатном буфере, рН 8.0; 36° С, без ингибиторов; 2) реакция в тех же условиях в присутствии 2 * 10" М ІБО-ОМРД; 3) 2 * 10-5 М ІБО-ОМРД и 10-5 М прозерина; 4) 2 * 10-5 М ІБО-ОМРД и 5*10-5 М прозерина
На следующем графике (рис. 4) показана зависимость начальной скорости реакции, катализи-
руемой АОИБ мозга крысы в клеточном экстракте от концентрации субстрата ацетилтиохолина при различных концентрациях ингибитора прозерина.
Для мозга экспериментально найденная константа ингибирования прозерином АОИБ практически совпадает с аналогичной константой для двигательной мышцы БйЦ и составляет К|(прозерин) =
0,43*10 М. Полученные кинетические данные показывают неспецифичность действия прозерина на АОИБ из локомоторной мышцы БРЬ и головного мозга крысы.
[АЭД пМ
Рис. 4 - Зависимость начальной скорости реакции, катализируемой эстеразами мозга крысы от концентрации субстрата ацетилтиохолина при различных концентрациях ингибиторов: 1) без ингибиторов; 2) 2*10* М iso-OMPA; 3) 0,3*10-7 М прозерин, 2*10-5 М iso-OMPA; 4) 0,5*10-4 М прозе-рин, 2*10-5 М iso-OMPA; 5) 0.3*10-4 М прозерин, 2*10-5 М iso-OMPД;0,05 М K-фосфат, pH 8,0; 36°0
Автор благодарит К.А. Петрова (ИОФХ РАН им. А.Е.Арбузова, Казань) за предоставление образцов и участие в постановке задачи и Э.А. Бухараеву (КГМУ, Казань) за участие в обсуждении результатов.
Литература
1. G.L. Ellman, K.D.Courtney, V.J.Andres. Biochem. Pharmacol., 7, 88-95 (1961)
2. С.А. Понкратова, В.М. Емельянов, А.С. Сироткин,
М.В. Шулаев. Вестник Казанского технол. ун-та, 6, 7685 (2010)
3. И.А. Храмова, М.В. Шулаев. Вестник Казанского технол. ун-та, 1, 159-165 (2010)
4. R.J. Richardson. In: Comprehensive Toxicology,
(McQueen C.A. Ed.) // Oxford: Academic Press, 13, 433-444 (2010).
5. Y. Ashani, Z. Radic, I. Tsigelny, D.C. Vellom, N.A. Pickering, D.M. Quinn, B.P. Doctor, P. Taylor. JBiol Chem., 270, 11, 6370-80 (1995)
6. M.M. Bradford. Anal. Biochem, 72, 248-54 (1976)
7. И. В. Ковязина, К. А. Петров, Л. О. Ягодина, Э. А. Бу-хараева, В. В. Зобов, В. С. Резник. Химия и медицина, (Уфа, Россия, 26-29 ноября, 2007) Тезисы докладов VI Всероссийского научного семинара. Уфа, 2007. C.56
8. Д.В. Абрамочкин, К.А. Петров, В.В. Зобов, Л.О. Ягодина Л.О., Е.Е. Никольский, Л.В. Розенштраух. Кардиология, 49, 1, 47-50 (2009)
9. C. Donger., E. Krejci, A.P. Serradell, B. Eymard, S. Bon, S. Nicole, D. Chateau, F. Gary, M. Fardeau, J. Massoulie, P. Guicheney. Am. J. Hum. Genet., 63, 967-975 (1998)
10. H. Dvir, M. Harel, S. Bon, W.Q. Lio, M. Vidal, C. Garbay, J.L. Sussman, J. Massoulie, I. Silman. EMBO J., 23, 43944405 (2004)
11. J. Massoulie, A. Anselmet, S. Bon, E. Krejci, C. Legay, N.
Morel, S. Simon. Chem Biol Interact., 119-120, 29-42
(1999)
12. A. Dobbertin, A. Hrabovska, K. Dembele, S. Camp, P. Taylor, E. Krejci, V. Bernard. J Neurosci, 29, 4519-30 (2009)
© Л.О. Ягодина - канд. биол. наук, доц. каф. химической кибернетики КНИТУ, floral2010@mail.ru.
Все статьи номера поступили в редакцию журнала в период с 15.11.12. по 30.11.12.
