CC BY
583
160
Обзоры
ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ: ВЗГЛЯД НЕЙРОФИЗИОЛОГА
К.А. Петров, А.Д. Харламова, Е.Е. Никольский
Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН, Казань, Россия Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, Казань, Россия
Cholinesterases: the opinion of neurophysiologist
KA. Petrov, A.D. Kharlamova, EE. Nikolsky
A.E. Arbuzov Institute of Organic and Physical Chemistry, Kazan, Russia Kazan (Volga Region) Federal University, Kazan, Russia Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, Kazan, Russia
Обзор посвящен вопросам строения и функции ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы. Авторы рассматривают эти два фермента не только с позиции их роли как «ограничителя» времени нахождения в синаптический щели нейромедиатора ацетилхолина, но и с учетом их несинаптических функций. Особое внимание в обзоре уделено возможности коррекции патологии нервной системы путем изменения активности этих ферментов.
Ключевые слова: ацетилхолинэстераза, бутирил-
холинэстераза, синаптическая передача.
Холинэстеразы (ХЭ) — ферменты, основная физиологическая роль которых заключается в быстром расщеплении нейромедиатора ацетилхолина (АХ), выделяющегося из нервных окончаний холинергических нейронов. ХЭ относятся к классу гидролаз, то есть являются ферментами, осуществляющими гидролиз ковалентной связи между холином и ацетатом молекулы нейромедиатора.
Семейство ХЭ млекопитающих включает два близкородственных фермента, способных гидролизовать нейротрансмиттер АХ и контролировать, таким образом, временные границы его действия в процессе синаптической передачи возбуждения: ацетилхолинэстеразу (АХЭ) и бутирилхолинэстеразу (БуХЭ).
В настоящее время с молекулярной и биохимической точек зрения оба фермента достаточно хорошо изучены. Так, описано многообразие их молекулярных форм, в основе которого лежат альтернативный сплайсинг и присоединение различных некаталитических якорных субъединиц [1], выполнен рентгеноструктурный анализ кристаллов обоих ферментов, позволивший конкретизировать процесс гидролиза субстрата и места связывания некоторых ингибиторов [2]. Однако на фоне обилия молекулярно-генетической информации становится очевидным недостаток знаний о физиологических функциях этих ферментов. Особенно это касается БуХЭ. Так если в случае АХЭ остается невыясненным, например, физиологический смысл существования ее разных молекулярных форм, то с БуХЭ ситуация остается значительно более неопределенной, вплоть до того, что ряд исследователей ее физиологическую роль вообще считают недостаточно понятной.
В данном обзоре предпринята попытка оценить физиологическую роль ХЭ не только с позиции их участия в процессах синаптической передачи возбуждения в холинергических синапсах, но и с учетом их «некаталитических» функций.
The review addresses issues of structure and functions of acetyl- and butyrylcholinesterases. Authors consider these enzymes not only as limiters of the neurotransmitter acetylcholine life span in synaptic cleft but also accounting for their putative non-synaptic functions. Particular emphasis has been placed on the possibility of correction of nerve system pathologies by way of modification of the activity of these enzymes.
Key words: acetylcholinesterase, butyrylcholinesterase, synaptic transmission.
структура активного центра холинэстераз
и гидролиз ацетилхолина
Природным субстратом АХЭ и БуХЭ является АХ — сложный эфир уксусной кислоты и холина. ХЭ катализирует гидролиз АХ с образованием холина и уксусной кислоты. Одной из важных функциональных особенностей устройства ХЭ является расположение ее активного центра — на дне «ущелья», примерно в 20 А от «поверхности» ХЭ. В активном центре ХЭ принято выделять следующие функционально значимые участки (рис. 1):
— «оксианионный центр», служащий для связывания карбонильного кислорода молекулы субстрата;
— «каталитическую триаду», включающую остатки серина, гистидина, глутаминовой кислоты;
— «анионный центр», связывающий часть АХ, содержащую четвертичный атом азота.
На входе в «ущелье» ХЭ располагается группа аминокислотных остатков, обозначаемая как «периферический анионный центр». Периферический анионный центр ответственен за ориентацию субстрата в направлении активного центра и, вероятно, за ингибирование ХЭ высокими концентрациями субстрата. Достигнув дна «ущелья», молекула АХ «растягивается» между оксианионным и анионным центрами, в результате чего эфирная связь оказывается точно напротив каталитической триады. Происходит гидролиз сложноэфирной связи субстрата [3]. Скорость гидролиза ХЭ одной молекулы АХ составляет порядка 100 мкс [4]. Столь высокая скорость гидролиза АХ определяется нуклеофиль-ностью атома кислорода остатка серина каталитической триады, которая обеспечивается переходом протона гидроксильной группы серина на атом азота имидазольного кольца гистидина. Одновременно протон у второго атома азота имидазольного кольца переходит к карбоксильной группе остатка глутаминовой кислоты.
е-mail: kpetrov2005@mail.ru
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
Обзоры
161
Рис. 1. Схема строения активного центра ацетилхолинэстеразы
Примерно 65% аминокислотных последовательностей АХЭ и БуХЭ гомологичны, а если сравнивать участки фермента, участвующие в гидролизе субстрата, то различаются всего шесть аминокислотных остатков. Так, у БуХЭ, по сравнению с АХЭ, отсутствуют три ароматических остатка в области активного центра (Phe295, Phe297, Tyr337) и три ароматических остатка в периферическом анионном центре (Tyr72, Tyr124, Trp286) (нумерация аминокислот ХЭ человека) [5]. С функциональной точки зрения данные различия выражаются в том, что БуХЭ гидролизует АХ менее эффективно, чем АХЭ, однако и в меньшей степени подвержена субстратному ингибированию [6].
Роль холинэстераз в синаптической передаче
возбуждения
Исторически исследования фармакологии и физиологии ХЭ сыграли важную роль в формировании представлений об устройстве холинергического синапса и функции АХ как медиатора. О. Леви, открывший медиаторную функцию АХ, использовал ингибитор ХЭ физостигмин, чтобы пролонгировать эффект вещества, которое он называл «вагусштоф», на частоту сокращения сердца лягушки и установил таким способом, что отрицательный хронотропный эффект обусловлен действием именно АХ [7].
Последующие классические исследования процесса синаптической передачи возбуждения в холинергическом синапсе показали, что электрический сигнал, распространяющийся по аксону, достигая нервного окончания, инициирует вход в него ионов Са2 + через потенциалзависимые кальциевые каналы и освобождает из нервной терминали медиатор АХ. Диффундируя через синаптическую щель, молекулы АХ достигают постсинаптической мембраны и взаимодействуют с никотиновыми ацетилхолино-выми рецепторами (АХР), активация которых приводит к открытию сопряженных ионных каналов. Ток катионов по электрохимическому градиенту (преимущественно № + ), приводит к кратковременному снижению мембранного потенциала в области постсинаптической мембраны — генерации возбуждающего постсинаптического потенциала (ВПСП), который в нервно-мышечном синапсе получил название потенциала концевой пластинки (ПКП). В свою оче-
редь ПКП приводит к открытию потенциалзависимых №+ каналов электрогенной мембраны и к генерации потенциала действия (ПД). Превышение амплитуды реального ВПСП величины, достаточной для генерации ПД, получило название «фактора надежности» синаптической передачи (см. обзор [8]). Например, если амплитуда ВПСП на 30% превышает уровень деполяризации, необходимый для генерации ПД, то «фактор надежности» данного синапса принимают равным «1,3». При патологических состояниях (миастении, болезнь Альцгеймера) амплитуда ВПСП снижена и не все ВПСП достигают порога генерации ПД — «фактор надежности» меньше единицы. В этих случаях частичное ингибирование активности синаптической ХЭ увеличивает амплитуду ВПСП и, следовательно, восстанавливает «фактор надежности» синаптической передачи. После генерации ПД электрогенной мышечной мембраной следует восстановление исходной проницаемости постсинаптической мембраны для ионов и ее потенциала покоя до исходного уровня (реполяризация). Скорость возвращения всей системы в исходное состояние определяет лабильность синапса, т.е. способность воспроизводить задаваемый ритм раздражения, и в значительной мере зависит от скорости ферментативного гидролиза АХ. Таким образом, основная функция ХЭ в синаптической щели — разрушение выброшенного в синаптическую щель медиатора до начала секреции его следующей порции.
Наиболее глубоко и последовательно процессы, происходящие с участием ХЭ, исследованы на нервно-мышечном синапсе позвоночных. Строение нервно-мышечного соединения позвоночных с высокой плотностью АХР мышечного типа (примерно 10 000/мкм2), в 5—8 раз меньшей плотностью ХЭ (примерно 2000/мкм2) и размером одного кванта медиатора (около 10 000 молекул) обеспечивает условия, при которых в течение интервала времени, сопоставимого по длительности с фазой роста ПКП (100 мкс), около 20% освобожденных молекул АХ взаимодействуют с АХЭ, в то время как остальные 80% — оккупируют АХР.
В течение фазы спада ПКП (с постоянной времени около 1,2 мс), высокая скорость гидролиза холинэстеразой одной молекулы АХ — 100 мкс [4] гарантирует низкую вероятность повторной активации АХР одной и той же молекулой медиатора.
Показано, что основная роль в быстром гидролизе АХ, выделяющегося из нервного окончания, принадлежит АХЭ, тогда как основная функция БуХЭ — дублирование роли АХЭ в условиях функциональной недостаточности последней. Данное заключение базируется на результатах ряда наблюдений. Так ингибирование АХЭ приводит к смерти лабораторных животных, в основном из-за отказа дыхательной мускулатуры [9], в то время как ингибирование БуХЭ не оказывает видимого эффекта на функцию внешнего дыхания. В настоящее время получены линии мутантных мышей, лишенных АХЭ или БуХЭ. Оказалось, что мыши без АХЭ имеют яркий фенотип (мышечная слабость, фасцику-ляции, поведенческие аномалии и т.д.) [10], тогда как животные без БуХЭ практически не отличаются от мышей «дикого типа». На основе анализа этих и других подобных экспериментов и делается вывод, что именно АХЭ играет ведущую роль в гидролизе АХ. Однако ситуация принципиально меняется, когда активность АХЭ снижена: в этих условиях БуХЭ начинает
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
162
Обзоры
вносить заметный вклад в функцию синапса. Так, токсичность ингибиторов АХЭ существенно возрастает, если БуХЭ была предварительно ингибирована или удалена нокаутом гена [11]. У мутантных мышей, лишенных АХЭ, ингибиторы АХЭ не оказывают эффекта, при этом ингибирование БуХЭ приводит к серьезным нарушениям дыхания [12]. Двойные мутанты (без АХЭ и БуХЭ) оказались не жизнеспособными и погибали сразу после рождения. На основе вышеперечисленных данных сложилось представление о том, что эволюционно БуХЭ — фермент, который дублирует функции АХЭ, в том числе в процессе синаптической передачи.
Модуляция активности ацетилхолинэстеразы,
как способ изменения фактора надежности
синаптической передачи возбуждения
Понимание роли АХЭ, как фермента, контролирующего время действия медиатора в синаптической щели, позволило использовать АХЭ как мишень для модуляции «фактора надежности» синаптического проведения. На сегодняшний день с этой целью наиболее широко применяются ингибиторы АХЭ. Блокирование АХЭ вызывает широкий спектр физиологических эффектов, предопределивших сферы их практического применения — от химического оружия, до высокоэффективных лекарственных препаратов. Собственно эта возможность, в зависимости от задачи, либо увеличить эффективность работы холи-нэргического синапса, либо блокировать синаптическое проведение и является той причиной, благодаря которой на протяжении уже более ста лет интерес к изучению АХЭ не ослабевает.
Данные электрофизиологических экспериментов показывают, что ингибирование синаптической АХЭ приводит к увеличению амплитуды и длительности ВПСП. Важно отметить, что эффекты ингибирования синаптической АХЭ на параметры ВПСП зависят от степени ее ингибирования. Так при блокировании до 90% активности АХЭ происходит только увеличение амплитуды ВПСП. При дальнейшем угнетении активности АХЭ, наряду с дальнейшим ростом амплитуды, отмечается возрастание времени спада ВПСП. Причем, степень возрастания спада ВПСП более выражена, чем увеличение их амплитуды. Так, при практически полном ингибировании АХЭ, амплитуда ВПСП увеличивается в 1,5 раза, а постоянная времени спада — в 5—10 раз по сравнению с контрольной [13].
Частичное угнетение активности АХЭ, сопровождающееся увеличением амплитуды ВПСП, без затягивания заднего фронта широко используется в медицинской практике, чтобы компенсировать снижение амплитуды ВПСП, вызванное либо нарушением механизмов секреции квантов медиатора, либо снижением плотности функциональных АХР (миастении, деменции альцгеймерного типа) [14, 15].
Практически полное ингибирование АХЭ приводит к блокированию синаптического проведения. Это связано с тем, что, несмотря на рост амплитуды, происходит и существенное удлинение спада отдельных ВПСП. «Удлиненные» ВПСП, «сливаясь» в ходе ритмической активности синапса, формируют деполяризационное плато — стойкую деполяризацию в области постсинаптической мембраны, которая вызывает инактивацию натриевых каналов электрогенной мембраны, нарушая процесс генерации ПД [16, 17].
Поскольку при отравлениях ингибиторами АХЭ описанный процесс затрагивает и синапсы дыхательных мышц, то понятно, что нарушение генерации ПД в этих мышцах может приводить к летальным исходам из-за остановки дыхания.
возможность эндогенной модуляции
активности ацетилхолинэстеразы
Значительный вклад АХЭ в формирование амплитуды и длительности ВПСП позволяет рассматривать ее как перспективную мишень для реализации пластических перестроек в процессе передачи информации между возбудимыми клетками. Действительно имеются данные, свидетельствующие о том, что количество АХЭ в синаптической щели меняется в зависимости от условий функционирования синапса (см. обзоры [18; 19]). Поскольку в основе регуляции количества АХЭ лежат изменения скорости синтеза белка, его секреции и «заякоривания», то реализация данного пути требует десятков часов. Однако можно предполагать существование вариантов и более оперативного управления синаптической АХЭ, реализуемых за счет изменения активности фермента. Основанием для выдвижения данной гипотезы служат две группы фактов. Во-первых, показано, что фосфорилирование АХЭ способно существенно (до 10 раз) ускорять скорость гидролиза субстрата
[20]. С другой стороны, противоположный (ингибирующий) эффект наблюдается при действии на АХЭ молекул оксида азота [21]. Поскольку ранее в нашей лаборатории были получены данные о том, что активация НМДА-рецепторов приводит к увеличению синтеза NO в нервно-мышечном синапсе [22], можно было предполагать наличие NO-опосредованного механизма ингибирования АХЭ, который запускается агонистом этих рецепторов — глутаматом. И действительно, эксперименты показали, что, активация НМДА-рецепторов увеличивает амплитуду ВПСП за счет ингибирования активности синаптической АХЭ [23].
Идея о наличии эндогенных путей регуляции активности АХЭ представляется важной, поскольку обычно в качестве механизмов оперативного обеспечения синаптической пластичности рассматривают только те варианты, которые связанны с изменением количества квантов выделяемого медиатора и повышением, либо снижением чувствительности к нему постсинаптических рецепторов. Обнаруженный факт NO-опосредованного угнетения активности синаптической АХЭ является свидетельством наличия ранее неизвестного пути модуляции амплитуды синаптических ответов.
Молекулярные формы холинэстераз
В настоящее время описано разнообразие молекулярных форм семейства ХЭ, которое обеспечивается двумя процессами:
1) альтернативным сплайсингом (описан только для АХЭ);
2) присоединением некаталитической якорной субъединицы;
Получающиеся в результате сочетания этих трех процессов молекулярные формы ХЭ обладают разными путями регуляции и, вероятно, могут выполнять разные физиологические функции. Однако, несмотря на факт существования нескольких молекулярных
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
Обзоры
163
форм ХЭ, физиологическую необходимость их сосуществования еще предстоит выяснить. Поскольку кинетика гидролиза субстрата у них одинакова [24], то необходимость наличия нескольких молекулярных форм ХЭ может быть связана с различиями в выполняемых ими «некаталитических» функциях (см. ниже).
Теперь подробнее о процессах, обеспечивающих различия между отдельными молекулярными формами ХЭ.
Альтернативный сплайсинг
В 1986 г. был секвенирован ген АХЭ Torpedo califomica и показано, что вся АХЭ в организме позвоночных кодируются одним геном [25—34]. При этом у млекопитающих известно несколько альтернативных вариантов сплайсинга этого гена и один «read through» транскрипт (рис. 2). Варианты альтернативного сплайсинга обычно обозначаются как «Е» и «S» варианты — соответственно «erythrocytic» и «synaptic». Е вариант кодирует 32 аминокислоты на 3' конце, которые отвечают за присоединение гликолипида, необходимого для формирования гидрофобного якоря на поверхности эритроцитов [31]. «S» вариант кодирует 40 аминокислот на 3'конце, формирующих специфический домен, с которым связывается Col Q или PRiMA якорные субъединицы [35]. Остальные 95% кодирующих последовательностей инвариантны. Кроме того, у некоторых видов животных, включая мышей и крыс, описан «read through» транскрипт последнего (4-го) инвариантного экзона (R-АХЭ). Этот вариант был найден в гематопоэтических клетках, но оказалось, что он не экспрессируется в норме в электровозбудимых клетках. Казалось бы, он не представляет интереса с позиций нейрофизиологии. Однако скорее всего это не так, поскольку он экспрессируется при ингибировании АХЭ, миастении Гравис и болезни Альцгеймера, хотя и в этом случае остается минорным (около одного процента от общей экспрессии АХЭ) [36, 37].
Для 5'конца описаны четыре альтернативных варианта первого экзона [38, 39]. Все они могут экспрессироваться независимо от выбора варианта сплайсинга на 3'конце. Таким образом, теоретически возможно получение до 15 вариантов транскриптов
мРНК АХЭ. Однако все варианты сплайсинга первого экзона находятся до старт кодона и не представлены в структуре белка АХЭ. Возможно, эти варианты важны для регуляции количества фермента, однако физиологический смысл этой регуляции на сегодняшний день не понятен. То же можно сказать и об описанной достаточно недавно энхансеосоме в составе интрона между первым и вторым экзонами. Известно лишь, что делеция этого участка приводит к исчезновению АХЭ в нервно-мышечных синапсах и мегакароцитах, при сохранении фермента в головном мозге [40].
В 1990 г. был секвенирован ген БуХЭ [41]. Оказалось, что он содержит четыре экзона. Вариантов альтернативного сплайсинга для БуХЭ обнаружено не было. Четвертый экзон БуХЭ кодирует последовательность для присоединения Col Q или PRiMA якорной субъединицы. Поэтому БуХЭ существует в виде глобулярной водорастворимой формы, либо «заякоренной» Col Q или PRiMA. Другим отличием БуХЭ от АХЭ является выраженный генный полиморфизм. В настоящее время описано около 40 точечных мутаций гена БуХЭ. Самым распространенным в человеческой популяции является так называемый «К-вариант», возникающий в результате замены Ala(539) на Thr [6].
Присоединение некаталитических субъединиц
Следующий уровень особенностей организации ХЭ связан с олигомеризацией каталитических субъединиц АХЭ и БуХЭ в димеры и тетрамеры, которые присоединяются к некаталитической якорной субъединице. Субъединицы Е-АХЭ обнаружены у млекопитающих на поверхности гематопоэтических клеток, где прикрепляются к мембране с помощью глико-фосфатидилинозитольного (GPI) якоря, и поэтому их подробное описание выходит за рамки нейрофизиологического обзора.
S-АХЭ и БуХЭ могут связываться либо с Col Q — коллагеноподобным хвостом («Q» от «queue» — «хвост»), состоящим из трех переплетенных коллагеновых нитей, или же с гидрофобным белком PRiMA («PRiMA» от «proline-rich membrane anchor») (рис. 2). Ген Col Q (50 kb) содержит 17 экзонов, два из них альтернативных — 1 и 1а [42]. У крыс Col Q 1
Варианты
альтернативного
сплайсинга:
якорные
субъединицы
холинэстераз
ATG
I
ATG
I
ТАА
| ДГПЛ ТАА read-through transcript (R-АХЭ) 1 1
DIM 1 ‘erythrocytic’ вариант (Е-АХЭ) Col Q
TGA 1 ‘synaptic’ вариант (S-АХЭ) 1
шз PRiMA
Рис. 2.
Основы многообразия молекулярных форм холинэстераз:
1-6 — экзоны гена ацетилхолинэстеразы. R-АХЭ, S-АХЭ и E-АХЭ — варианты аминокислотной последовательности ацетилхолинэстеразы, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга. ATG — старт-кодон; TAA, TGA — стоп-кодоны
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
164
Обзоры
и Col Q 1a транскрипты экспрессируются в медленных и быстрых мышечных волокнах, соответственно. Экспрессия управляется двумя независимыми промоторами: «fast intronic regulatory element» (FIRE) и «slow upsteam regulatory element» (SURE), активных, соответственно, в быстрых и медленных мышечных волокнах крысы [43].
Ген РRiMA субъединицы клонирован [44], хотя о строении самой PRiMA субъединицы, к сожалению, известно относительно мало. В настоящее время выделяют три домена этого белка: экстраклеточный, трансмембранный и цитоплазматический. Для гена, кодирующего PRiMA, также описан альтернативный сплайсинг. Продукты сплайсинга, обозначаемые как PRiMA I и PRiMA II различаются только по цитоплазматическому домену. Цитоплазматический домен PRiMA I (40 аминокислотных остатков) содержит несколько серинов, возможно формирующих сайт фосфорилирования. Цитоплазматический домен PRiMA II (11 аминокислотных остатков) не содержит аналогичного сайта. Оба варианта PRiMA способны формировать комплекс с тетрамером АХЭ. Однако, как было показано, во взрослом организме преимущественно экспрессируется PRiMA I, тогда как PRiMA II представляет минорную фракцию [45, 46].
S-АХЭ, связанная с PRiMA или Col Q, имеет различную локализацию в организме. Col Q синтезируется преимущественно в мышце, а формы АХЭ, связанные с Col Q, обнаруживаются, в основном, в области нервно-мышечного синапса. В головном мозге преимущественно обнаруживается тетрамер, заякоренный на поверхности мембраны с помощью PRiMA субъединицы, где он составляет около 70— 90% от общей АХЭ [47, 48]. Недавно появилась информация, что АХЭ, заякоренная посредством PRiMA, входит в состав так называемых липидных плотиков [49, 50], которые представляют собой богатые холестерином участки плазматической мембраны. Внутри плотиков ко-локализуются различные белки, образуя, таким образом, функциональные мембранные комплексы [51—54]. В настоящее время описано множество путей регуляции процесса секреции медиатора с участием пресинаптических мускариновых и никотиновых холинорецепторов [55—59]. Для этих типов рецепторов также показана локализация внутри липидных плотиков [60—64]. Таким образом, АХЭ, локализованная внутри липидных плотиков, может и не принимать участия в разрушении АХ, достигающего постсинаптический мембраны, но контролировать его концентрацию в области пресинаптической мембраны, где локализован сенсор, регулирующий процесс секреции медиатора. Логично также предположить наличие независимых путей регуляции АХЭ, входящей в состав таких функциональных мембранных субдоменов или кавеол. Возможно, изучение АХЭ, связанной с липидными плотикам, и поможет понять физиологический смысл существования множества молекулярных форм АХЭ.
Некаталитические функции холинэстераз
В конце семидесятых годов прошлого века, когда была сформулирована «холинергическая гипотеза болезни Альцгеймера» [65-68], произошел всплеск интереса к АХЭ головного мозга. Это связано с установлением факта, что деменции альцгеймерного типа сопровождаются деградацией холинэргических
нейронов головного мозга, а продление действия АХ путем частичного ингибирования АХЭ устраняет симптомы заболевания [69]. Однако исследование экспрессии АХЭ в разных участках головного мозга выявило неожиданный факт, заключающийся в том, что АХЭ экспрессируется не только в холинэргиче-ских нейронах, но и в тех, где не обнаруживаются другие маркеры холинэргической нейротрансмиссии (ацетилхолинтрансфераза, система захвата холина с высоким сродством и др.) [70, 71]. Позднее в опытах in vitro было показано, что обработка нехолинергических нейронов ингибитором АХЭ BW284c51 приводит к снижению ответа на такие медиаторы, как глутамат, АМРА и NMDA [72]. Эти данные позволили предположить, что роль АХЭ не ограничивается разрушением АХ, а включает также и другие, «некаталитические» функции [73].
Хотя АХЭ преимущественно экспрессируется в центральной и периферической нервной системе, различные ее молекулярные формы обнаруживаются и в гематопоэтических клетках, остеобластах, эндотелии сосудов, лейкоцитах и в клеточных линиях, вступивших в апоптоз [74]. Не так давно было обнаружено, что АХЭ присутствует и в клеточном ядре. Эти факты дают основания обсуждать и другие функции АХЭ, включая ее участие в ангиогенезе и развитии опухолей [75].
Различные варианты локализации АХЭ (мембран-связанная, секретируемая, ядерная или цитоплазматическая) также увеличивают количество возможных партнеров для взаимодействия и, соответственно, расширяют возможный диапазон ее функций [73].
Еще одна из рассматриваемых некаталитических функций АХЭ — ее участие в процессах адгезии клеток и их взаимодействии. В качестве молекулярной основы реализации этих функций рассматривают недавно открытые холинэстеразно-подобные молекулы адгезии [76]. Оказалось, что все эти молекулы обладают сходными электростатическими характе-ристками, причем один из участков, ответственных за адгезию, гомологичен периферическому анионному центру АХЭ. В опытах in vitro было показано, что действительно степень адгезии клеток в культуре коррелирует с уровнем экспрессии АХЭ [77]. Сходным образом АХЭ участвует и в адгезии остеобластов. Блокада периферического анионного центра АХЭ (но не блокада активного центра) приводит к снижению их адгезии, что говорит о способности АХЭ регулировать взаимодействие клеток с матриксом кости [78]. Эти факты привлекают внимание к периферическому анионному центру фермента, как важному элементу процессов межклеточной коммуникации.
С позиции нейробиологии, способность АХЭ участвовать в процессах адгезии дает основания рассматривать ее в качестве важного фактора процессов роста аксонов и развития межнейрональных связей. Оказалось, что обработка различных культур нервных клеток ингибиторами периферического анионного центра BW254c51, пропидиумом и фасцику-лином (но не ингибитором каталитического центра галантамином), вызывала уменьшение количества и степени ветвления их отростков [79]. Все эти факты свидетельствуют о возможной реализации еще одной некаталитической функции АХЭ, а также привлекают внимание к периферическому анионному центру, как важному участнику процессов межклеточной коммуникации.
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
Обзоры
165
Другим примером взаимодействия АХЭ с белками может служить взаимодействие ее с р-амилоидным пептидом, образующимся в мозге при развитии болезни Альцгеймера. При взаимодействии с пептидом S-АХЭ не только меняет такие свои свойства, как оптимум рН и чувствительность к ингибиторам [80], но и значимо повышает нейротоксичность Р-амилоида [81]. Присоединение АХЭ к белку ускоряет его агрегацию, т.е играет роль «затравки» в процессах формирования амилоидных фибрилл и бляшек. Добавление ингибитора активного центра эдрофониума не влияет на этот процесс, тогда как лиганд периферического анионного центра пропиди-ум снижает скорость роста фибрилл [82].
По аналогии с АХЭ, делались попытки проанализировать возможные «некаталитические» функции периферического анионного центра БуХЭ. Однако на сегодняшний день объективных свидетельств вовлеченности этого участка фермента в физиологические процессы, не связанные напрямую с гидролизом АХ, нет. В последнее время в плане «некаталитических» функций, большее внимание привлекает участок, расположенный на С-конце одного из вариантов генетического полиморфизма БуХЭ. «К-вариант» БуХЭ — наиболее часто встречающаяся мутация, отличается от нормальной последовательности заменой Ala(539) на Thr. В ряде работ наличие данной мутации в человеческой популяции связывают с увеличением риска болезни Альцгеймера [83, 84]. Однако в условиях in vitro были получены противоположные данные, свидетельствующие о том, что С-концевой пептид «К-варианта» БуХЭ снижает скорость агрегации патологического р-амилоида в фибриллы [85]. Ранее этой же группой исследователей были получены сходные результаты и для R-АХЭ. Так, в опытах на культурах клеток было показано, что добавление R-АХЭ доза-зависимо снижало скорость агрегации амилоида в фибриллы [86]. Эффект R-АХЭ на процесс агрегации также связывают с особенностями строения С-конца данной молекулярной формы фермента, лишенной
ЛитерАТУРА:
1. Massouli J., Perrier N., Noureddine H. et al. Old and new questions about cholinesterases. Chem Biol Interact. 2008; 75(1-3): 30-44.
2. Silman I., Sussman J.L. Acetylcholinesterase: how is structure related to function? Chem. Biol. Interact. 2008; 175(1-3): 3-10.
3. Моралев С.М., Розенгарт Е.В. Современные представления о структуре и каталитических свойствах холинэстераз позвоночных и беспозвоночных (обзор). Журнал эволюционной биохимии и физиологии 1999; 35(1): 3-14.
4. Lawler H.C. Turnover time of acetylcholinesterase. J. Biol. Chem. 1961; 236: 2296-301.
5. Kaplan D., Ordentlich A., Barak D. et al. Does "butyrylization" of acetylcholinesterase through substitution of the six divergent aromatic amino acids in the active center gorge generate an enzyme mimic of butyrylcholinesterase? Biochemistry 2001; 40(25): 7433-45.
6. Chatonnet A., Lockridge O. Comparison of butyrylcholinesterase and acetylcholinesterase. Biochem. J. 1989; 260(3): 625-34.
7. Loewi O., Navratil E. Pflug. Arch. Ges. Physiol. 1926; 214: 678.
8. Wood S.J., Slater C.R. Safety factor at the neuromuscular junction. Prog. Neurobiol. 2000; 64(4): 393-429.
9. Hobbiger F. Pharmacology of anticholinesterase drugs. Handbook of exp. pharmacol. Berlin: Springer-Verlag, N.Y.: Heidelberg, 1976; 42(4): 486-581.
10. Adler M., Manley H.A., Purcell A.L. et al. Reduced acetylcholine receptor density, morphological remodeling, and butyrylcholinesterase activity can sustain muscle function in acetylcholinesterase knockout mice. Muscle Nerve 2004; 30(3): 317-27.
11. Girard E., Bernard V., Minic J. et al. Butyrylcholinesterase and the control of synaptic responses in acetylcholinesterase knockout mice. Life Sci. 2007; 80(24-25): 2380-5.
последовательности, служащей для присоединения якорных субъединиц.
Следовательно, к настоящему моменту накоплено достаточно свидетельств существования «некаталитических» функций ХЭ. Однако нужно отметить, что большинство приведенных результатов исследований получены в условиях либо in vitro, либо на культурах клеток. Поэтому оценка реального физиологического вклада ХЭ в процессы, не связанные напрямую с разрушением АХ, требует дальнейших усилий исследователей разных специальностей, в том числе нейрофизиологов.
Заключение
Таким образом, несмотря на большую историю исследований ХЭ, многие аспекты их физиологической роли остаются не выясненными. Сегодня совершенно очевидно, что их функция не ограничивается только подготовкой холинорецепторов постсинаптической мембраны к взаимодействию с вновь освобождаемыми молекулами АХ, а включает и ряд других аспектов, таких как контроль эффективности пресинаптических холинорецепторов, регулирующих модуляцию освобождения последующих порций медиатора и процессов, напрямую не связанных с кругооборотом медиатора АХ. Изучение этих аспектов функционирования ХЭ по нашему мнению позволит как приблизиться к более полному пониманию процесса функционирования холинэргического синапса, так и наметить инновационные способы профилактики и терапии социально значимых заболеваний нервной системы.
Благодарности
Работа выполнена в рамках государственной программы повышения конкурентоспособности Казанского (Приволжского) федерального университета среди ведущих мировых научно-образовательных центров». Работа поддержана грантами РФФИ (12-
04-33296 и 13-00-40286-K).
12. Chatonnet F., Boudinot E., Chatonnet A. et al. Breathing without acetylcholinesterase. Adv. Exp. Med. Biol. 2004; 551: 165-70.
13. Katz B., Miledi R. The binding of acetylcholine to receptors and its removal from the synaptic cleft. J. Physiol. 1973; 231: 549-74.
14. Garcia-Carrasco M., Escarcega R.O., Fuentes-Alexandro S. et al. Therapeutic options in autoimmune myasthenia gravis. Autoimmun. Rev. 2007; 6(6): 373-8.
15. Osborn G.G., Saunders A.V. Current treatments for patients with Alzheimer disease. J. Am. Osteopath. Assoc. 2010; 110 (9 Suppl 8): 16-26.
16. Кривой И.И., Кулешов В.И., Матюшин Д.Л. Нервно-мышечный синапс и антихолинэстеразные вещества. Л.: Изд-во ЛГУ им. А.А. Жданова; 1987.
17. Anglister L., Stiles J.R., Salpeter M.M. Acetylcholinesterase density and turnover number at frog neuromuscular junctions, with modeling of their role in synaptic function. Neuron1994; 12(4): 783-94.
18. Rotundo R.L., Rossi S.G., Kimbell L.M. et al. Targeting acetylcholinesterase to the neuromuscular synapse. Chem. Biol. Interact. 2005; 157-158: 15-21.
19. Rotundo R.L., Ruiz C.A., Marrero E. et al. Assembly and regulation of acetylcholinesterase at the vertebrate neuromuscular junction. Chem. Biol. Interact. 2008; 175(1-3): 26-9.
20. Grifman M., Arbel A., Ginzberg D. et al. In vitro phosphorylation of acetylcholinesterase at non-consensus protein kinase A sites enhances the rate of acetylcholine hydrolysis. Brain Res. Mol. Brain. Res. 1997; 51(1-2): 179-87.
21. Udayabanu M., Kumaran D., Nair R.U. et al. Nitric oxide associated with iNOS expression inhibits acetylcholinesterase activity and induces memory impairment during acute hypobaric hypoxia. Brain Res. 2008; 1230: 138-49.
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
166
Обзоры
22. Malomouzh A.I., Nurullin L.F., Arkhipova S.S. et al. NMDA receptors at the endplate of rat skeletal muscles: precise postsynaptic localization. Muscle Nerve 2011; 44(6): 987-9.
23. Petrov K.A., Malomouzh A.I., Kovyazina I.V. et al. Regulation of acetylcholinesterase activity by nitric oxide in rat neuromuscular junction via N-methyl-D-aspartate receptor activation. Eur. J. Neurosci. 2013; 37(2): 181-9.
24. Vigny M., Gisiger V., Massouli J. «Nonspecific» cholinesterase and acetylcholinesterase in rat tissues: molecular forms, structural and catalytic properties, and significance of the two enzyme systems. PNAS USA 1978; 75: 2588-92.
25. Sikorav J.L. Krejci E., Massoulie J. cDNA sequences of Torpedo marmorata acetylcholinesterase: primary structure of the precursor of a catalytic subunit; existence of multiple 5'-untranslated regions. EMBO J. 1987; 6: 1865-73.
26. Rotundo R.L., Gomez A.M., Fernandez-Valle C. et al. Allelic variants of acetylcholinesterase: genetic evidence that all acetylcholinesterase forms in avian nerves and muscles are encoded by a single gene. PNAS USA 1988; 85(20): 7805-9.
27. Maulet Y., Camp S., Gibney G. et al. Single gene encodes glycophospholipid-anchored and asymmetric acetylcholinesterase forms: Alternate coding exons contain inverted repeat sequences. Neuron 1990; 4: 289-301.
28. Sikorav J.-L., Duval N., Anselmet A. et al. Complex alternative splicing of acetylcholinesterase transcripts in Torpedo electric organ; Primary structure of the precursor of the glycolipid-anchored dimeric form. EMBO J. 1988; 7: 2983-93.
29. Soreq H., Ben-Aziz R., Prody C.A. et al. Molecular cloning and construction of the coding region for human acytlcholinesterase reveals a G + C-rich attenuation structure. PNAS USA 1990; 87: 9688-92.
30. Maulet Y., Camp S., Gibney G. et al. Single gene encodes glycophospholipid-anchored and asymmetric acetylcholinesterase forms: alternative coding exons contain inverted repeat sequences. Neuron 1990; 4(2): 289-301.
31. Li Y., Camp S., Rachinsky T.L. et al. Gene structure of mammalian acetylcholinesterase. Alternative exons dictate tissue-specific expression. J. Biol. Chem. 1991; 266: 23083-90.
32. Li Y., Camp S., Rachinsky T.L. et al. Promoter elements and transcriptional control of the mouse acetylcholinesterase gene. J. Biol. Chem. 1993а; 268:3563-72.
33. Li Y., Camp S., Taylor P. Tissue-specific expression and alternate mRNA processing of the mammalian acetylcholinesterase gene. J. Bio. Chem. 1993b; 268: 5790-97.
34. Ekstrom T.J., Klump W.M., Getman D. et al. Promoter elements and transcriptional regulation of the acetylcholinesterase gene. DNA Cell Biol. 1993; 12:63-72.
35. Massoulie J. The origin of the molecular diversity and functional anchoring of cholinesterases. Neurosignals 2002; 11(3): 130-43.
36. Kaufer D., Friedman A., Seidman S. et al. Acute stress facilitates long-lasting changes in cholinergic gene expression. Nature 1998; 393: 373-7.
37. Perrier N.A., Salani M., Falasca C. et al. The readthrough variant of acetylcholinesterase remains very minor after heat shock, organophosphate inhibition and stress, in cell culture and in vivo. J. Neurochem. 2005; 94: 629-38.
38. Atanasova E., Chiappa S., Wieben E. et al. Novel messenger RNA and alternative promoter for murine acetylcholinesterase. J. Biol. Chem. 1999; 274: 21078-84.
39. Meshorer E., Toiber D., Zurel D. et al. Combinatorial complexity of 5' alternative acetylcholinesterase transcripts and protein products. J. Biol. Chem. 2004; 279: 29740-51.
40. Camp S., De Jaco A., Zhang L. et al. Acetylcholinesterase expression in muscle is specifically controlled by a promoter-selective enhancesome in the first intron. J. Neurosci. 2008; 28: 2459-70.
41. Arpagaus M., Kott M., Vatsis K.P. et al. Structure of the gene for human butyrylcholinesterase. Evidence for a single copy. Biochemistry 1990; 29: 124-131.
42. Krejci E., Thomine S., Boschetti N. et al. The mammalian gene of acetylcholinesterase-associated collagen. J. Biol. Chem. 1997; 272(36): 22840-7.
43. Ting A.L., Siow N.L., Kong L.W. et al. Transcriptional regulation of acetylcholinesterase-associated collagen ColQ in fast- and slow-twich muscle fibers. Chem. Biol. Interact. 2005; 15: 157-8.
44. Perrier A.L., Massoulie J., Krejci E. PRiMA: The membrane anchor of acetylcholinesterase in the brain. Neuron 2002; 33: 275-85.
45. Perrier N.A., Kherif S., Perrier A.L. et al. Expression of PRiMA in the mouse brain: membrane anchoring and accumulation of 'tailed' acetylcholinesterase. Eur. J. Neurosci. 2003; 18(7): 1837-47.
46. Mok M.K., Leung K.W., Xie H.Q. et al. A new variant of proline-rich membrane anchor (PRiMA) of acetylcholinesterase in chicken: expression in different muscle fiber types. Neurosci. Lett. 2009; 461(2): 202-6.
47. Grassi J. Vigny M., Massoulie J. Molecular forms of acetylcholinesterase in bovine caudate nucleus and superior
cervical ganglion: solubility properties and hydrophobic character. J. Neurochem. 1982; 38:457-69.
48. Rakonczay Z., Vincendon G., Zanetta J.P. Heterogeneity of rat brain acetylcholinesterase: a study by gel filtration and gradient centrifugation. J. Neurochem. 1981; 37:662-69.
49. Xie H.Q., Liang D., Leung K.W. et al. Targeting acetylcholinesterase to membrane rafts: a function mediated by the proline-rich membrane anchor (Prima) in neurons. J. Biol. Chem. 2010; 285: 11537-46.
50. Hicks D., John D., Makova N.Z. et al. Membrane Targeting, Shedding and Protein Interactions of Brain Acetylcholinesterase. J. Neurochem. 2011; 116: 742-6.
51. Golub T., Wacha S., Caroni P. Spatial and temporal control of signaling through lipid rafts. Curr. Opin. Neurobiol. 2004; 14(5): 542-50.
52. Dart C. Lipid microdomains and the regulation of ion channel function. J Physiol. 2010; 588(17): 3169-78.
53. Neumann A.K., Itano M.S., Jacobson K. Understanding lipid rafts and other related membrane domains. F1000 Biol. Rep. 2010; 2:31.
54. Ohno-Iwashita Y., Shimada Y., Hayashi M. et al. Cholesterolbinding toxins and anti-cholesterol antibodies as structural probes for cholesterol localization. Subcell. Biochem. 2010; 51: 597-621.
55. Slutsky I., Silman I., Parnas I. et al. Presynaptic M(2) muscarinic receptors are involved in controlling the kinetics of ACh release at the frog neuromuscular junction. J. Physiol. 2001; 536(Pt 3): 717-25.
56. Oliveira L., Timoteo M.A., Correia-de-Sa P. Modulation by adenosine of both muscarinic M1-facilitation and M2-inhibition of [3H]-acetylcholine release from the rat motor nerve terminals. Eur J Neurosci. 2002; 15(11): 1728-36.
57. Oliveira L, Timoteo MA, Correia-de-Sa P. Negative crosstalk between M1 and M2 muscarinic autoreceptors involves endogenous adenosine activating A1 receptors at the rat motor endplate. Neurosci. Lett. 2009; 459(3): 127-31.
58. Dudel J. The time course of transmitter release in mouse motor nerve terminals is differentially affected by activation of muscarinic M1 or M2 receptors. Eur. J. Neurosci. 2007; 26(8): 2160-8.
59. Vizi E.S., Lendvai B. Modulatory role of presynaptic nicotinic receptors in synaptic and non-synaptic chemical communication in the central nervous system. Brain Res. Brain Res. Rev. 1999; 30(3): 219-35.
60. Bruses J.L., Chauvet N., Rutishauser U. Membrane lipid rafts are necessary for the maintenance of the (alpha)7 nicotinic acetylcholine receptor in somatic spines of ciliary neurons. J. Neurosci. 2001; 21(2): 504-12.
61. Delint-Ramirez I., Fernandez E., Bayes A. et al. In vivo composition of NMDA receptor signaling complexes differs between membrane subdomains and is modulated by PSD-95 and PSD-93. J. Neurosci. 2010; 30(24): 8162-70.
62. Stetzkowski-Marden F., Recouvreur M., Camus G. et al. Rafts are required for acetylcholine receptor clustering. J Mol Neurosci. 2006;30(1-2):37-8.
63. Pato C., Stetzkowski-Marden F., Gaus K. et al. Role of lipid rafts in agrin-elicited acetylcholine receptor clustering. Chem. Biol. Interact. 2008; 175(1-3): 64-7.
64. Allen J.A., Halverson-Tamboli R.A., Rasenick M.M. Lipid raft microdomains and neurotransmitter signalling. Nat. Rev. Neurosci. 2007; 8(2): 128-40.
65. Bowen D.M., Smith C.B., White P. et al. Neurotransmitter-related enzymes and indices of hypoxia in senile dementia and other abiotrophies. Brain 1976; 99: 459-96
66. Davies P., Maloney A.J.F. Selective loss of central cholinergic neurons in Alzheimer's disease. Lancet 1976; 2: 1403.
67. Perry E.K., Perry R.H., Blessed G. et al. Necropsy evidence of central cholinergic deficits in senile dementia. Lancet 1977; 1: 189.
68. Weinstock M. The pharmacotherapy of Alzheimer's disease based on the cholinergic hypothesis: an update. Neurodegeneration 1995; 4(4): 349-56.
69. Eagger S.A., Levy R., Sahakian B.J. Tacrine in Alzheimer's disease, Lancet 1991; 337: 989-92.
70. Greenfield S.A. A noncholinergic action of acetylcholinesterase (AChE) in the brain: from neuronal secretion to the generation of movement. Cell. Mol. Neurobiol. 1991; 11(1): 55-77.
71. Appleyard M., Jahnsen H. Actions of acetylcholinesterase in the guinea-pig cerebellar cortex in vitro. Neuroscience 1992; 47(2): 291-301.
72. Dong H., Xiang Y.Y., Farchi N. et al. Excessive expression of acetylcholinesterase impairs glutamatergic synaptogenesis in hippocampal neurons. J. Neurosci. 2004; 24: 8950-60.
73. Paraoanu L., Layer P. Acetylcholinesterase in cell adhesion, neurite growth and network formation. FEBS J. 2008; 275: 618-24.
74. Zhang X.J., Yang L., Zhao Q. et al. Induction of acetylcholinesterase expression during apoptosis in various cell types. Cell Death Differ. 2002; 9: 790-800.
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
Обзоры
167
75. Santos S.C., Vala I., Miguel C. et al. Expression and subcellular localization of a novel nuclear acetylcholinesterase protein. J. Biol. Chem. 2007; 282: 25597-603.
76. Botti S.A., Felder C.E., Sussman J.L. et al. Electrotactins: a class of adhesion proteins with conserved electrostatic and structural motifs. Protein Eng.1998; 11: 415-20.
77. Sharma K.V., Koenigsberger C., Brimijoin S. et al. Direct evidence for an adhesive function in the noncholinergic role of acetylcholinesterase in neurite outgrowth. J. Neurosci. Res. 2001; 63: 165-75.
78. Inkson C.A., Brabbs A.C., Grewal T.S. et al. Characterization of acetylcholinesterase expression and secretion during osteoblast differentiation. Bone 2004; 35:819-27.
79. Layer P.G., Weikert T., Alber R. Cholinesterases regulate neurite growth of chick nerve cells in vitro by means of a non-enzymatic mechanism. Cell Tissue Res. 1993; 273: 219-26
80. Geula C., Mesulam M. Special properties of cholinesterases in the cerebral cortex of Alzheimer's disease. Brain Res. 1989; 498(1): 185-9.
81. Inestrosa N.C., Alvarez A., Perez C.A. et al. Acetylcholinesterase accelerates assembly of amyloid-beta-peptides into Alzheimer's fibrils:
possible role of the peripheral site of the enzyme. Neuron 1996; 16: 881-91.
82. Inestrosa N.C., Urra S., Colombres M. Acetylcholinesterase tAChE) — amyloid-p-peptide complexes in Alzheimer's disease. the Wnt signaling pathway. Current Alzheimer Research 2004; 1: 249-54
83. Wiebusch H., Poirier J., Sevigny P. et al. Further evidence for a synergistic association between APOE epsilon4 and BCHE-K in confirmed Alzheimer's disease. Hum. Genet. 1999; 104(2): 158-63.
84. Lehmann D.J., Johnston C., Smith A.D. Synergy between the genes for butyrylcholinesterase K variant and apolipoprotein E4 in late-onset confirmed Alzheimer's disease. Hum. Mol. Genet. 1997; 6(11): 1933-6.
85. Berson A., Soreq H. It all starts at the ends: multifaceted involvement of C- and N-terminally modified cholinesterases in Alzheimer's disease. Rambam. Maimonides Med. J. 2010; 1(2): e0014.
86. Berson A., Knobloch M., Hanan M. et al. Changes in readthrough acetylcholinesterase expression modulate amyloid-beta pathology. Brain. 2008; 131: 109-19.
Поступила: 17.07.2014
Гены & Клетки Том IX, № 3, 2014
