CC BY
32
влияние агонистов нмда рецепторов на амплитуду миниатюрных потенциалов концевой пластинки у мышей,
нокаутированных по отдельным молекулярным формам
ацетилхолинэстеразы
С.Е. Проскурина 12, К.А. Петров 123, А.Д. Харламова 23, Э. Креши 4, Е.Е. Никольский 123 5
1 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань, Россия
2 Казанский институт биохимии и биофизики КазНЦ РАН, Казань, Россия
3 Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН, Казань, Россия
4 Университет Paris Descartes, Париж, Франция
5 Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия
Action of NMDA receptors agonists on amplitude of miniature endplate potentials in PRiMA and ColQ genes knockout mice
S.E. Proskurina 1 2, KA. Petrov123, A.D. Kharlamova 23, E.Krejci4, E.E.Nikolsky1 2 3 5
1 Kazan (Volga region) Federal University, Kazan, Russia
2 Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics of Kazan scientific center of Russian Academy of Sciences, Kazan, Russia
3 A.E. Arbuzov Institute of Organic and Physical Chemistry, Kazan Scientific Centre of Russian Academy of Sciences, Kazan, Russia
4 Université Paris Descartes, Paris, France
5 Kazan State Medical University, Kazan, Russia
Ранее было показано, что в области нервно-мышечного контакта существует популяция N-метил-О-аспартатных (НМДА) рецепторов, активация которых приводит к усилению продукции оксида азота (NO), который, в свою очередь, способен ингибировать активность синаптической ацетил-холинэстеразы и увеличивать, тем самым, амплитуду си-наптических ответов Мы проверяли гипотезу о том, что молекулярная форма ацетилхолинэстеразы, заякоренная на плазматической мембране посредством PRiMA может быть более чувствительна к NO, чем молекулярная форма ацетилхолинэстеразы, локализованная на базальной мембране с помощью ColQ . Использовали изолированный нервно-мышечный препарат m . extensor digitorum longus мышей «дикого типа» и мутантных мышей, нокаутированных по гену (-/-) PRiMA или (-/-) ColQ . Регистрацию миниатюрных потенциалов концевой пластинки осуществляли при помощи стандартной микроэлектродной техники . Установлено, что под воздействием агонистов НМДА рецепторов — глутамата и глицина, амплитуда и постоянная времени спада миниатюрных потенциалов концевой пластинки у мутантных мышей, нокаутированных как по PRiMA, так и по ColQ субъединице, достоверно не изменялись . Таким образом, оксид азота, продуцируемый в результате активации фермента NO-синтазы, которая запускается глута-мат-опосредованным возбуждением синаптических НМДА рецепторов, не воздействует избирательно на одну из молекулярных форм ацетилхолинэстеразы .
Ключевые слова: НМДА рецептор, глутамат, оксид азота, ацетилхолинэстераза, нервно-мышечный синапс
Введение
Одним из ключевых ферментов, обеспечивающих синаптическую передачу возбуждения в холинэр-гических синапсах является ацетилхолинэстераза (АХЭ), ограничивающая время воздействия медиатора ацетилхолина (АХ) на рецепторы постсинаптиче-ской мембраны, гидролизуя его до холина и ацетата . Поскольку активность АХЭ определяет продолжительность действия АХ, и, соответственно, амплитуду и длительность постсинаптических ответов, поиск способов модуляции активности этого фермента стал целью многих исследований . Недавно были получены данные о том, оксида азота (N0) спосо-
е-таП: kpetгov2005@mail . ги
Previously it was shown that activation of NMDA receptors at neuromuscular junction can enhance nitric oxide (NO) production . NO, in turn, able to inhibit synaptic acetylcholinesterase activity and increases amplitude of synaptic responses . In this study we tested a hypothesis that molecular form of acetylcholinesterase anchored in plasma membrane could be more sensitive to endogenous NO inhibition than molecular form of acetylcholinesterase located on basal lamina . Experiments were performed on extensor digitorum longus of (-/-) PRiMA, (-/-) ColQ and wild type mice Miniature endplate potentials were recorded using standard microelectrode technique . After application of NMDA receptors agonists (glutamate and glycine) amplitude and decay time of miniature endplate potentials did not change in synapses of PRiMA or ColQ knock-out mice Obtained results show that nitric oxide production owing to the activation of enzyme NO-synthase, which is initiated by glutamate mediated excitation of synaptic NMDA receptors, does not affect selectively one of molecular forms of acetylcholinesterase
Keywords: NMDA receptor, glutamate, nitric oxide, acetylcholinesterase, neuromuscular synapse
бен угнетать активность АХЭ in vitro [3]. Этот факт позволил выдвинуть гипотезу о возможности регуляции активности синаптической АХЭ этим газообразным мессенджером . Учитывая полученные ранее данные о том, что активация НМДА-рецепторов приводит к увеличению синтеза NO в нервно-мышечном синапсе [4—6], логично было предположить наличие NO-опосредованного механизма ингибирования АХЭ, запускаемого глутаматом — агонистом этих рецепторов . Действительно, как нами было показано ранее, в области нервно-мышечного контакта существует популяция НМДА рецепторов, активация которых приводит к усилению продукции NO, который, в свою
очередь, способен угнетать активность синаптиче-ской АХЭ и увеличивать, тем самым, амплитуду си-наптических ответов [1].
Ацетилхолинэстераза в нервно-мышечных синапсах представлена двумя молекулярными формами . Отличаются они способом и местом «заякоривания» фермента — на плазматической мембране через PRiMA-субъединицу (Praline-Rich Membrane Anchor) [7], либо на базальной мембране при помощи белка ColQ (коллагена Q) [8, 9]. Поскольку молекулярная форма АХЭ, «заякоренная» на плазматической мембране, может быть ко-локализована с комплексом НМДА рецептор^О-синтаза, то существует вероятность, что данная молекулярная форма АХЭ значительно более эффективно ингибируется оксидом азота, чем АХЭ базальной мембраны . В пользу данного предположения дополнительно свидетельствует тот факт, что АХЭ, заякоренная посредством PRiMA, входит в состав так называемых липидных плотиков [10] — богатых холестерином участков плазматической мембраны, выступающих в качестве платформ для ко-локализации различных белков, образующих вместе функциональные мембранные домены [11—14] . Локализация внутри липидных плотиков НМДА рецепторов и NO-синтазы также описаны [15—18].
Целью данного исследование являлось изучение эффективности ингибирования NO обеих молекулярных форм АХЭ . Поскольку ингибиторы АХЭ, специфичные для отдельных её молекулярных форм, не описаны, то для «удаления» отдельных молекулярных форм АХЭ из синаптической щели использовали мышей мутантных линий, у которых отсутствует АХЭ, заякоренная либо PRiMA, либо ColQ .
Материал и методы
Эксперименты проводили на изолированных нервно-мышечных препаратах m . extensor digitorum longus (m . EDL) мышей «дикого типа», а также мутантных мышей, нокаутированных по гену (-/-) PRiMA или (-/-) ColQ . Мутантные животные были нам любезно предоставлены Universite Paris Descartes (Париж, Франция) . Регистрацию миниатюрных потенциалов концевой пластинки (МПКП) осуществляли стандартными стеклянными микроэлектродами, заполненными 3М раствором KCL с сопротивлением
10—15 MO . Изолированную мышцу помещали в экспериментальную ванночку, через которую протекал аэрированный карбагеном (О2 95%, СО2 5%) раствор Рингера-Кребса следующего состава (ммоль/л): NaCl - 120,0, KCl - 5,0, CaCl2 - 2,0, MgCl2 - 1,0, NaHCO3 - 11,0, NaH2PO4 - 1,0, глюкоза - 11,0, рН раствора поддерживали на уровне 7,2-7,4 . Для усиления и оцифровки сигналов использовали усилитель Axoclamp 900A и аналогово-цифровой преобразователь Digidata 1440A (Molecular devices, США) . Регистрировали по 100 МПКП в каждом мышечном волокне
Достоверность различий параметров до и после воздействия препарата проверяли по t критерию Стьюдента Различия считали достоверными в случае р<0,05 .
Использовали реактивы компании Sigma (США).
Результаты
Как показали эксперименты, среднее значение амплитуды МПКП у мышей «дикого» типа составило 0,65±0,03 мВ, а постоянной времени спада -2,15±0,09 мс (n = 25) . Добавление глутамата в концентрации 0,1 ммоль/л и ко-агониста НМДА-рецепторов глицина (0,7 ммоль/л) [1, 21], приводило к возрастанию амплитуды МПКП до 0,92±0,06 мВ (увеличение на 40%) (n = 20) При этом значение постоянной времени спада составило 2,17±0,05 мс (n = 20), что не отличалось достоверно от контрольных значений . Эффект глутамата появлялся через 30-40 мин инкубации в растворе и становился наиболее выраженным к 60 мин . инкубации .
Значение амплитуды МПКП в синапсах мышей, нокаутированных по PRIMA-субъединице, составило 0,66±0,03 мВ, а постоянной времени спада - 2,08±0,12 мс, что достоверно не отличалось от контрольных величин, характерных для мышей «дикого» типа (n = 20) Однако после добавления глутамата и коагониста глицина у мутантных мышей увеличения амплитуды МПКП не наблюдалось . Так, средняя амплитуда сигналов у мышей (-/-) PRiMA составила 0,71±0,03 мВ (n = 20), что достоверно не отличалось от значений амплитуд МПКП у му-тантных мышей в отсутствии аминокислот Влияния аминокислот на постоянную времени спада также
А
Б
m.EDL
4,0
3,5
о 3,0
<® о с
Ц 2,5 re
" 2,0 К
re
í 1,5
к
о
о 1,0
о
с
0,5 0,0
m.EDL
Рис. Средние значения амплитуды (А) и постоянной времени спада (Б) МПКП, зарегистрированных в т. EDL в контроле и после аппликации аминокислот (глутамата и глицина) у мышей «дикого типа» (ШТ) и нокаутных по гену «якорных» субъединиц ацетилхолинэстеразы (РЙ1МА и Со10). N = 15—20 концевых пластинок
b2
оригинальные исследования
не наблюдалось . Постоянная времени спада в синапсах мышей (-/-) PRiMA после аппликации глутамата и глицина составила 2,15±0,08 мс .
Средняя амплитуда МПКП у мутантных мышей (-/-) ColQ составила 0,71±0,05 мВ (n = 15), а спада — 3,58±0,23 мс . После аппликации аминокислот амплитуда и постоянная времени спада МПКП, как и в случае мышей (-/-) PRiMA, достоверно не изменялись (средние значения составили соответственно 0,68±0,07 мВ и 3,61±0,21 мс) .
Обсуждение
Таким образом, проведенные эксперименты показали, что после «удаления» посредством нокаута гена «якорной» субъединицы любой из двух молекулярных форм АХЭ, аппликация глутамата и глицина уже не приводила к увеличению амплитуды МПКП . Поскольку не наблюдалось ситуации, в которой отсутствие одной из молекулярных форм АХЭ полностью устраняло эффект аминокислот на амплитуду МПКП, а отсутствие другой молекулярной формы не влияло бы на эффект аминокислот, можно было предположить, что эндогенный оксид азота не воздействует избирательно на конкретную молекулярную форму АХЭ .
Однако отсутствие эффекта глутамат-опосредо-ванного ингибирования АХЭ также может быть связано с уменьшением количества НМДА рецепторов и (или) активности фермента NO-синтазы и, как след-
ствие, снижением продукции оксида азота у мутантных животных с изначально сниженной плотностью АХЭ . Другими словами, использование мутантных животных, нокаутированных по молекулярным формам АХЭ, не позволило однозначно ответить на вопрос о возможности селективного ингибирования одной из молекулярных форм АХЭ эндогенным оксидом азота, поскольку данные линии мышей могли утратить этот путь регуляции активности АХЭ .
Необходимо подчеркнуть, что полученные данные не противоречат самой идее существования эндогенных ингибиторов АХЭ, поскольку увеличение амплитуды МПКП у мышей «дикого» типа подтверждает эту идею . Установление факта наличия модулирующего влияния N0 представляется важным с фундаментальной точки зрения, поскольку ингиби-рование синаптической АХЭ эндогенными ингибиторами можно рассматривать как обнаружение ранее неизвестного пути ауторегуляции синаптической передачи возбуждения за счет изменения кинетики действия каждого отдельного кванта ацетилхолина .
Благодарности
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ №13-04-40289-Н и субсидии, выделенной в рамках государственной поддержки Казанского (Приволжского) федерального университета в целях повышения его конкурентоспособности среди ведущих мировых научно-образовательных центров.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Petrov К . A . , Malomouzh A . I . , Kovyazina I . V . et al . Regulation of acetylcholinesterase activity by nitric oxide in rat neuromuscular junction via N-methyl-D-aspartate receptor activation . Eur. J . Neurosci . 2013; 37: 181-9 .
2 . Jeffrey L ., Cummings M . D . Cholinesterase inhibitors: A new class of psychotropic compounds . Am . J . Psychiatry 2000; 157: 4-15 .
3 . Udayabanu M . , Kumaran D ., Nair R . U . et al . Nitric oxide associated with iNOS expression inhibits acetylcholinesterase activity and induces memory impairment during acute hypobaric hypoxia . Brain Res . 2008; 16: 138-49 .
4 . Mays T . A. , Sanford J . L ., Hanada T . et al . Glutamate receptors localize postsynaptically at neuromuscular junctions in mice . Muscle & Nerve 2009; 39: 343-9 .
5 . Bernard V . , Girard E . , Hrabovska A . , et al . Distinct localization of collagen Q and PRiMA forms of acetylcholinesterase at the neuromuscular junction . Mol . Cell . Neurosci . 2011; 46: 272-81
6 . Malomouzh A. I ., Nurullin L. F ., Nikolsky E . E . et al . NMDA receptors at the endplate of rat skeletal muscles: precise postsynaptic localization . Muscle & Nerve 2011; 44: 987-9 .
7 . Perrier A . L ., Massoulié J ., Krejci E . PRiMA: the membrane anchor of acetylcholinesterase in the brain . Neuron 2002; 33(2): 275-85
8 Massoulié J , Bon S , Perrier N et al The C-terminal peptides of acetylcholinesterase: cellular trafficking, oligomerization and functional anchoring . Chem . Biol . Interact . 2005; 15: 157-8 .
9 . Massoulié J ., Bon S . The C-terminal T peptide of cholinesterases: structure, interactions, and influence on protein folding and secretion J . Mol . Neurosci . 2006; 30(1-2) :233-6 .
10 . Hicks D ., John D ., Makova N . Z . , et al . Membrane targeting, shedding and protein interactions of brain acetylcholinesterase J Neurochem . 2011; 116(5): 742-6 .
11. Golub T ., Wacha S ., Caroni P . Spatial and temporal control of signaling through lipid rafts . Curr Opin Neurobiol . 2004;14(5):542-50 .
12 . Dart C . Lipid microdomains and the regulation of ion channel function . J Physiol . 2010; 588(Pt 17):3169-78 .
13 . Neumann A . К ., Itano M . S ., Jacobson К . Understanding lipid rafts and other related membrane domains . Biol . Rep . 2010; 2: 31.
14 . Ohno-Iwashita Y. , Shimada Y. , Hayashi M . , et al . Cholesterol-binding toxins and anti-cholesterol antibodies as structural probes for cholesterol localization . Subcell Biochem . 2010; 51: 597-621.
15 . Brusés J . L ., Chauvet N ., Rutishauser U . Membrane lipid rafts are necessary for the maintenance of the (alpha)7 nicotinic acetylcholine receptor in somatic spines of ciliary neurons . J . Neurosci . 2001; 21(2): 504-12 .
16 . Delint-Ramírez I ., Salcedo-Tello P ., Bermudez-Rattoni F . Spatial memory formation induces recruitment of NMDA receptor and PSD-95 to synaptic lipid rafts . J . Neurochem . 2008; 106(4): 1658-68 .
17 . Delint-Ramirez I . , Fernández E ., Bayés A., et al . In vivo composition of NMDA receptor signaling complexes differs between membrane subdomains and is modulated by PSD-95 and PSD-93 J Neurosci . 2010; 30(24): 8162-70 .
18 . Allen J .A ., Halverson-Tamboli R .A ., Rasenick M . M . Lipid raft microdomains and neurotransmitter signalling Nat Rev Neurosci . 2007; 8(2): 128-40 .
19 . Besshoh S ., Bawa D . , Teves L . et al . Increased phosphorylation and redistribution of NMDA receptors between synaptic lipid rafts and post-synaptic densities following transient global ischemia in the rat brain . J . Neurochem . 2005; 93(1): 186-94 .
20 Besshoh S , Chen S , Brown I R et al Developmental changes in the association of NMDA receptors with lipid rafts J Neurosci Res . 2007; 85(9): 1876-83 .
21 Malomouzh A I , Mukhtarov M R , Nikolsky E E et al Glutamate regulation of non-quantal release of acetylcholine in the rat neuromuscular junction . J . Neurochem . 2003; 85: 206-13 .
Поступила: 05.10.2015
