УДК 577.152.311 + 595.143.2
СУБСТРАТНО-ИНГИБИТОРНЫЙ АНАЛИЗ ХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ПРЕСНОВОДНОЙ ПИЯВКИ CASPIOBDELLA FADEJEWI (Epstein) (PISCICOLLIDAE)
Л.Н. Лапкина, Г.М. Чуйко, В.А. Подгорная
Институт биологии внутренних вод им. И. Д. Папанина РАН 152742 пос. Борок, Ярославская обл., Некоузскийр-н, e-mail: lapkina@ibiw.yaroslavl.ru
Исследованы основные биохимические свойства и кинетические характеристики холинэстеразы ^Э) представителя класса пиявок, Caspiobdella fadejewi (Epstein) (отр. Rhynchobdellea, сем. Piscicolidae). Установлено, что значения кинетических характеристик фермента пиявки с разными субстратами, за исключением ^TX и МеТX, достоверно различаются. Соотношение скоростей гидролиза для ATX : ^TX : БуTX : МеTX составляет 100:74:13:59, величины V варьируют в пределах от 3.8 до 0.48 мкмоль/г/мин с ATX и БуTX соответственно. Эффект субстратного торможения отсутствует со всем субстратами. Наибольшим сродством XЭ пиявки обладает к ATX (Km = 2.64 x 10-4 M), а минимальным — к БуTX (Km = 22.2 x 10-4 M), что подтверждают значения показателя V/Km. Фосфорорганические ингибиторы ДДВФ и параоксон с одинаковой скоростью тормозят гидролиз трех субстратов (величины kII, как и значения р150 одинаковые). Проведенный субстратно-ингибиторный анализ, показывает, что у данного вида пиявок присутствует одна XЭ, отличающийся по свойствам со свойствами как типичных AXЭ и БуXЭ позвоночных, так и других изученных ранее аннелид.
Ключевые слова: холинэстеразы, пиявки, активность, субстратная специфичность, ингибиторы.
ВВЕДЕНИЕ
Xолинэстеразы ^Э) — ферменты, широко распространенные в живой природе от микроорганизмов и простейших одноклеточных организмов до позвоночных, включая человека. Выделяют два основных типа XЭ: ацетилхолинэстераза (AXЭ; ацетилхолин ацетилгидролаза, К.Ф. 3.i.i.7) и холинэстераза (ацилхолин ацилгидролаза; К.Ф. 3.i.i.S), представленная рядом ферментов. К последнему типу относится наиболее известная и часто встречаемая среди животных бутирилхолинэстераза (БуXЭ). Оба типа эволюционно связаны, но кодируются разными генами и имеют свои специфические черты, на основании которых их различают. AXЭ специализированный фермент и его основная физиологическая функция — гидролиз ацетилхолина (AX), медиатора передачи нервного импульса. БXЭ менее специфична в отношении субстратов и ее роль окончательно не ясна, хотя заметная активность фермента в крови и печени высших позвоночных указывает на его высокую функциональную значимость. Типичными считаются AXЭ мозга и эритроцитов человека, лошади, быка и обезьяны и БXЭ сыворотки лошади. При изучении XЭ других животных их сравнивают по свойствам и классифицируют относительно одного из типов XЭ (Бресткин и др., i997; Moralev, Rozengart, 2006).
В последнее время накапливается все больше данных, свидетельствующих о наличии у филогенетически разных групп животных XЭ, отличающихся по свойствам от типичных. "Нетипичные" XЭ обнаружены как у позвоночных (голубь Columbia livia, курица Gallus gallus), так и у беспозвоночных (бабочек (Lepidoptera), клопов (Hemiptera), тлей (Aphidinea, Homoptera), комнатной мухи (Musca domestica), медоносной пчелы (Apis melifera), тихоокеанского кальмара (Todarodespacificus), прудовика (Limnea stagnalis), мурекса (Murex trunculus)) (Бресткин и др., i997), пресноводной олигохеты (Lumbriculus variegatus) (Chuiko et al., 2011).
Пиявки относятся к кольчатым червям (аннелиды) и являются высшим беспозвоночным. От них ведется генеалогия членистоногих и моллюсков. Пределы вариабельности свойств XЭ аннелид, судя по литературным данным, весьма широки. Это очевидно, несмотря на то, что исследованы единичные объекты из каждого класса: полихет (Брик, i973), олигохет (Augustinsson, 1949; Andersen et al., 1978; Principato et al., 1989; Talesa et al., 1995; Caselli et al., 2006; Chuiko et al., 20ii) и пиявок (Лапкина, Стойкова, i9S6; Лапкина и др., 2005; 2007; Лапкина, Чуйко, 2007).
Цель работы — исследовать основные биохимические свойства и кинетические характеристики XЭ одного из представителей класса пиявок, Caspiobdella fadejewi (Epstein), и сравнить их со свойствами типичных AXЭ и БуXЭ позвоночных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проводили на пресноводной эктопаразитической пиявке Caspiobdella fadejewi (Epstein) (сем. Piscicolidae, отр. Rhynchobdellida). Червей собирали на карповых рыбах — плотве (Rutilus rutilus L.), язе (Leuciscus idus L.) и карасе (Carassius carassius L. ), выловленных в мае-сентябре 2004-2005 гг. в Волжском плесе (58о03'52"с.ш., 38o18'02"в.д.) Рыбинского водохранилища
(Ярославская обл.). Из-за малых размеров (длина 5-8 мм, толщина 1-2 мм) для биохимического анализа использовали целых червей. Предварительно было установлено, что в течение 7 дней кровь рыбы-хозяина полностью утилизируется пиявками и в их организме присутствует лишь собственная ХЭ. Чтобы исключить влияние на активность ХЭ пиявок соответствующих ферментов крови рыб, на которых они питались, червей до анализа выдерживали в течение не менее 10 дней в лабораторных условиях без кормления.
Для биохимического анализа навеску из 5-7 целых червей гомогенизировали, используя фарфоровые ступку и пестик для растирания с кварцевым песком в 0.1 М фосфатном буфере с рН 7.5. Гомогенаты центрифугировали при 5000 об/мин (2000 g) и t=4°C в течение 5 мин на рефрижераторной центрифуге Hettich Micro 22 R (Germany). Для биохимического анализа брали супернатант.
Активность ХЭ определяли по методу (Ellman et al., 1961) с дитионитробензойной кислотой (ДТНБ) при температуре 30оС и времени инкубации 10-30 мин. В качестве субстратов использовали иодиды ацетил-, пропионил-, бутирил- и ацетил^-метилтиохолина (АТХ, ПрТХ, БуТХ и МеТХ соответственно) в конечной концентрации 4.3х10-4 М (все реактивы фирмы Sigma, USA). Активность фермента выражали в мкмоль/мин на 1 г ткани.
Кинетические характеристики — максимальную скорость гидролиза (V) и константу Михаэлиса (Km), определяли в диапазоне концентраций субстратов 4.3 х 10-4-5.56 х 10-3 M по графикам Лайнувера-Берк (Диксон, Уэбб, 1982), а бимолекулярные константы скорости ингибирования (fe) и значения отрицательного десятичного логарифма молярной концентрации ингибитора, снижающей активность фермента на 50% (pI50) — как описано ранее (Chuiko, 2000). Использовали фосфорорганические ингибиторы (ФОИ): ДДВФ (0,0-диметил-0-(2,2-дихлорвинил) фосфат, 99%; CAS № 62-73-7 и параоксон (О, О-диэтил-О-(4-нитрофенил) фосфат, 98%, CAS № 31145-5 (оба производства Chem Service, USA). Более подробно процедуры подготовки проб и проведения анализов описаны ранее (Chuiko, 2000; Чуйко и др., 2002; Chuiko et al., 2011).
Результаты представлены в виде средних и стандартных ошибок ^±SE), каждый эксперимент проведен в 6 повторностях. Для оценки достоверности использован однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA, LSD-тест) при p=0.05 (Sokal, Rohlf, 1995). Расчет кинетических характеристик и статистическая обработка данных проведена с помощью пакета прикладных программ Statgraphics Plus 2.1 и Excel 2000.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В предварительных экспериментах выявлено, что в день снятия пиявок с рыб и в последующие несколько суток способность гомогенатов червей гидролизовать различные холиновые субстраты зависит от вида рыбы-хозяина, с которой пиявки были сняты (Табл. 1).
Таблица 1. Абсолютные (Аь мкмоль/г/мин) и относительные (А2, %) скорости гидролиза разных тиохолиновых субстратов гомогенатами пиявок С. /аёв]вм>1 сразу после питания на разных видах рыб
Субстрат Вид рыбы
плотва язь ка рась
А1 А2 А1 А2 А1 А2
АТХ 16.0 100 0.67 100 0.41 100
ПрТХ 2.2 14 0.41 62 0.22 52
БуТХ 31.6 198 1.3 194 0.02 5
МеТХ 1.9 12 0.28 41 0.24 58
Особи, снятые с плотвы и язя, обладали высокой активностью ХЭ и были способны гидролизовать БуТХ с большей скоростью, чем АТХ. Активность ХЭ червей, питавшихся на карасе, заметно ниже и их гомогенаты практически не гидролизовали БуТХ. После снятия червей с рыб и по мере переваривания ими крови, гидролизующая способность их гомогенатов снижалась, достигая через некоторое время постоянного уровня и теряя при этом возможность гидролизовать БуТХ. Продолжительность этого периода зависела от размера червей, степени их насыщения, скорости утилизации пищи, интенсивности коконообразования и составляла 10-15 дней. Поэтому основные исследования свойств ХЭ пиявок проводились на голодных особях не раньше чем через 20 дней после их снятия с рыб.
Гомогенаты из голодных пиявок, независимо от того, с какого вида рыбы они были сняты, гидролизуют АТХ, ПрТХ, БуТХ и МеТХ в среднем со скоростью 2.23±0.15, 1.13±0.07, 0 и 1.28±0,07 мкмоль/г/мин или в соотношении 100 : 50 : 0 : 58 при концентрации субстрата 4.3 х 10-4 М (см. рисунок). При повышении концентрации субстрата активность ХЭ возрастает. При этом ни один из холиновых субстратов в исследованном диапазоне концентраций не оказывает тормозящего действия на ферментативную активность.
Значения кинетических характеристик ХЭ червей с разными субстратами, за исключением ПрТХ и МеТХ, достоверно различаются (Табл.2).
Таблица 2. Кинетические характеристики гидролиза тиохолиновых субстратов для ХЭ гомогенатов пиявок С.
fadejewi.
Субстрат V Km, V / Km,
мкмоль/г/мин % 10-4 M 103 мин-1 г-1
АТХ 3.81±0.231 100 2.64±0.181 14
ПрТХ 2.83±0.182 74 5.68±0.312 5
БуТХ 0.48±0.033 13 22.21±1.053 0.022
МеТХ 2.26±0.122 59 6.80±0.402 3.3
Примечание: представлены средние значения и стандартные ошибки (x±SE), N=6; величины в каждом столбце с одинаковыми надстрочными индексами между собой достоверно не различаются (ANOVA, LSD-тест, p>0.05).
При этом величины V варьируют в пределах от 3.8 до 0.48 мкмоль/г/мин с АТХ и БуТХ, соответственно, а их соотношение для АТХ : ПрТХ : БуТХ : МеТХ составляет 100 : 74 : 13 : 59. Наибольшим сродством ХЭ червей обладает к АТХ (Km=2.64x10-4 M), а минимальным — к БуТХ (Km=22.2 х 10-4 M). Это подтверждают и различия между субстратами по значениям показателя V/Km. Чувствительность ХЭ пиявки к исследованным ФОИ различается (Табл. 3).
Таблица 3. Значения величин kn (М-1 мин-1) и р150 для ХЭ пиявки C. fadejewi при взаимодействии с ДДВФ и параоксоном
Субстрат ДДВФ Параоксон
kn x 106 р150 kn x 106 р150
АТХ 2.3±0.2* 7.6 0.53±0.03 6.9
ПрТХ 2.3±0.2 7.6 0.53±0.03 6.9
МеТХ 4.0±0.7 7.9 1.0±0.06 7.2
* различия между значениями константы для разных ингибиторов с каждым субстратом достоверны.
ДДВФ со всеми субстратами оказывает достоверно в 4 раза более сильное ингибирующее действие, чем параоксон. Значения кц с этими ингибиторами соответственно варьируют в диапазоне 2.3-4.0 х 106 и 0.53-1.0 х 106 М-1 мин-1. В тоже время каждый из ингибиторов тормозит гидролиз разных субстратов с близкой скоростью, т.е. значения кц со всеми субстратами достоверно не различаются.
ОБСУЖДЕНИЕ
Как показывают результаты исследований субстратной специфичности ХЭ пиявок сразу после снятия червей с рыбы, она в значительной мере обусловлена видовыми особенностями спектра ХЭ крови хозяина. Кровь плотвы и язя обладает высокой активностью ХЭ и в ней присутствуют АХЭ и БуХЭ, причем последняя составляет от 83 до 95% общей активности ХЭ. Активность ХЭ крови карася заметно ниже, она не содержит БуХЭ и в ней обнаружена только АХЭ (Желнин и др., 1998; Чуйко, Подгорная, 2007). Поэтому гомогенаты червей, питавшихся на первых двух видах рыб, имели высокую общую активность ХЭ и хорошо гидролизовали БуТХ. В то же время, гомогенаты пиявок, снятых с карася обладали более низкой скоростью гидролиза субстратов и были не активны в отношении БуТХ. Все это свидетельствует о том, что способность гомогенатов некоторых особей пиявок гидролизовать БуТХ обусловлена не их собственным ферментом, а связана с присутствием БуХЭ в крови рыбы-хозяина, на которой они питались.
Кинетические свойства ХЭ-аз определяются конформационной структурой их активного центра (АЦ) и составляющих его аминокислотных остатков. Поэтому, проведение специфического субстратно-ингибиторного анализа наряду с исследованиями по направленному мутагенезу ферментного белка позволяет изучать структурно-молекулярные и функциональные особенности ХЭ-аз. По современным представлениям каталитическая единица ХЭ-аз представляет собой мономерный глобулярный белок, в середине которого расположен каталитический активный центр (АЦ). Он состоит из двух функционально важных и пространственно разделенных участков: эстеразного, осуществляющего гидролиз эфирной связи субстрата, и холин-связывающего, который ориентирует молекулы субстрата относительно АЦ. Эстеразный участок включает каталитическую триаду — остатки аминокислот серина, гистидина и глютамата, которые взаимодействуют с ацильной частью молекулы субстрата и фосфорорганических (ФОИ) и карбаматных ингибиторов, и оксианионную полость, включающую остатки двух цистеинов и одного аланина, атомы азота которых образуют водородные связи с карбонильным кислородом субстрата и фосфонильным кислородом ФОИ. Холин-связывающий пункт обязательно включает в себя остаток триптофана, с индольным кольцом которого взаимодействует аммониевая группировка холиновой части субстрата. Большая роль в формировании и функционировании АЦ принадлежит гидрофобным областям, расположенным вокруг него и часто являющимся главным фактором, который определяет различия в свойствах ХЭ разного происхождения и типа. Гидрофобная область, окружающая эстеразный участок и стерически определяющая допустимый размер ацильной группы субстрата и ацилирующих ингибиторов, называется «ацильным карманом». Конфигурация «ацильного кармана» у БуХЭ отличается от АХЭ тем, что позволяет связывать субстраты и ингибиторы с большей ацильной частью. У АХЭ присутствует еще и периферический «анионный» пункт (ПАП), наличие которого обуславливает эффект субстратного торможения при высоких концентрациях субстрата и взаимодействие со специфическими ингибиторами и активаторами АХЭ. У БуХЭ ПАП отсутствует. Таким образом, каталитическая триада — наиболее консервативный элемент АЦ и его аминокислотный состав одинаковый у всех типов холинэстераз, независимо от вида животного. Остальные участки АЦ в той или иной степени подвержены изменчивости в аминокислотных остатках в зависимости от вида организма (Моралев, Розенгарт, 1999; Мога1еу, ЯоЕе^аГ;, 2006).
Собственная ХЭ пиявок с наибольшей скоростью гидролизует АТХ, примерно в два раза с более низкой скоростью — ПрТХ и МеТХ и не способна гидролизовать БуТХ. Субстратная специфичность собственной ХЭ пиявок предполагает, что черви содержат один тип фермента, близкий по свойствам к типичной АХЭ млекопитающих эритроцитов быка. Известно, что у типичной АХЭ высокие концентрации субстратов снижают её активность и избирательным субстратом для неё является МеТХ (Мога1еу, ЯоЕе^аГ;, 2006). Однако от неё ХЭ червей отличается отсутствием эффекта субстратного торможения. Выявленные особенности субстратной специфичности фермента пиявок предполагают, что по конфигурации ацильного кармана ХЭ пиявки близка к типичной АХЭ. Это объясняет снижение скорости гидролиза субстрата при увеличении длины его ацильной части в ряду АТХ, ПрТХ, БуТХ вплоть до полной потери активности в отношении последнего. Наряду с этим, неспособность ХЭ пиявки тормозиться избытком субстратов указывает на отсутствие в её молекуле ПАП.
Чувствительность ХЭ пиявки к параоксону примерно на два порядка меньше, чем у типичной АХЭ эритроцитов быка, значения ^ для которой составляют 1.4 х 107 М-1 х мин-1 (Чуйко и др., 2002). К действию ДДВФ она на 2-3 порядка более чувствительна по сравнению с типичными АХЭ эритроцитов быка (кп = 3.5 х 103-9.9 х 104 М-1 мин-1) (Сазонова и др., 1972; Чуйко и др., 2002; 2005) и на порядок — относительно БуХЭ сыворотки крови лошади (ku = 1.5 х 105 М-1 мин-1), но имеет сходную чувствительность с БуХЭ пресноводных костистых ^ц =3.7 х 106 М-1мин-1) (Чуйко и др., 2002). У параоксона ацильная часть представлена более длинным этиловым остатком, а у ДДВФ — более коротким метиловым (Шамшурин, Кример, 1976). Поэтому меньшая чувствительность ХЭ пиявки к параоксону и большая к ДДВФ по сравнению с типичной АХЭ указывает на то, что "ацильный карман" фермента этой пиявки отличается по аминокислотному составу и больше приспособлен для взаимодействия с более короткой ацильной цепочкой.
Известно, если скорости торможения ферментативного гидролиза разных субстратов каким-либо ингибитором одинаковы, то гидролиз осуществляется одним ферментом (Розенгарт, 2001). У C. fadejewi каждый из исследованных ингибиторов с одинаковой скоростью тормозит гидролиз трех субстратов (величины как и значения р150 одинаковые), что указывает на наличие одного типа ХЭ у этого вида пиявок.
По субстратно-ингибиторным особенностям ХЭ C. fadejewi отличается не только от типичных АХЭ и БуХЭ млекопитающих, но и от изученных ранее ферментов других пресноводных аннелид. Так у плоской пиявки Glossiphonia complanata из того же отряда (отр. Rhynchobdellea, сем. Glossiphoniidae) ХЭ имеет низкое сродство к БТХ (Лапкина и др., 2005), но угнетается его избытком наряду с другими субстратами (не опубликованные данные авторов). У 5 представителей бесхоботных пиявок (отр. Arhynchobdellea, сем. Hirudniidae и Erpobdeliidae) ХЭ гидролизует БТХ и сродство к нему выше, чем к АТХ (Лапкина, Стойкова, 1986). "Атипичная" ХЭ олигохеты Lumbriculus variegatus наиболее хорошо гидролизует АТХ, остальные три субстрата чуть медленнее, но с близкими скоростями (Chuiko et al., 2011). При этом избыток АТХ и БТХ тормозит её активность, а других двух субстратов нет. Чувствительность ХЭ C. fadejewi к ДДВФ ближе всего к ферменту олигохеты L. variegatus (kn = 4.6 х 106 М-1 мин-1 с АТХ). В то же время она почти на 2 порядка выше, чем у челюстных пиявок Haemopis sanguisuga и Hirudo medicinalis (4.7 х 104 и 6.5 х 104 М-1 мин-1 соответственно), и на порядок выше, чем у представителей плоских пиявок G. complanata и Helobdella stagnalis L. (2.3 и 2.2 х 105 М-1 мин-1) (Лапкина, Чуйко, 2007).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, проведенное исследование показало, что в организме пресноводной пиявки C. fadejewi присутствует один тип ХЭ наиболее близкий по субстратной специфичности к типичной АХЭ млекопитающих, но отличающийся от нее отсутствием эффекта субстратного торможения.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Бресткин А.П., Кузнецова Л.П., Моралев С.Н., Розенгарт Е.В., Эпштейн Л.М. Холинэстеразы наземных животных и гидробионтов. Владивосток: ТИНРО-Центр, 1997. 466 с. Brestkin A.P., Kuznetsova L.P., Moralev S.N., Rozengart E.V., Epshtein L.M. Kholinesterazy nazemnykh zhivotnykh i gidrobiontov. Vladivostok: TINRO-Tsentr, 1997. 466 s. [Brestkin A.P., Kuznetsova L.P., Moralev S.N., Rozengart E.V., Epshtein L.M. Cholinesterases of terrestrial and aquatic animals. Vladivostok: TINRO-Center, 1997. 466 p.] In Russian. Брик И.Л. Холинэстераза мышц морских червей Physcosoma japonicum и Lumbriconereis impatiens / В кн.: Биохимическая эволюция. Л.: Наука. 1973. С. 56-66. Brik I.L. Kholinesteraza myshts chervei Physcosoma japonicum i Lumbriconereis impatiens / V kn.: Biokhimicheskaya evolyutsiya. L.: Nauka, 1973. S. 56-66. [Brik I.L. Cholinesterase of muscles of sea worms Physcosoma japonicum and Lumbriconereis impatiens / In: Biochemical evolution. L.: Science, 1973. P. 56-66.] In Russian. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. В 3-х томах. Т. 1. М: Мир. 1982. 392с. [Dikson M., Webb E. Enzymes. 3rd. ed.,
London: Longman Group Limited, 1979.] In Russian. Желнин Ю.Ю., Чуйко Г.М., Подгорная В.А. Активность холинэстераз плазмы крови различных видов пресноводных костистых рыб // Биол. внутр. вод. 1998. № 1. С. 74-79. Zhelnin Yu.Yu., Chuiko G.M., Podgornaya V.A. Aktivnost' kholiesteraz plazmy krovi razlichnykh vidov presnovodnykh kostistykh ryb // Biol. vnutr. vod. 1988. № 1. S. 74-79. [Zhelnin Yu.Yu., Chuiko G.M., Podgornaya V.A. Cholinesterase activity in blood plasma of different freshwater teleosts // Inland Water Biology. 1988. No. 1. P. 74-79.] In Russian. Лапкина Л.Н., Стойкова О.А. Холинэстеразы пиявок // Биол. внутр. вод. Информ. бюлл. 1986. № 69. С. 29-32. Lapkina L.N., Stoikova O.A. Kholinesterazy piyavok // Biol. vnutr. vod. Inform. byull. 1986. № 69. S. 29-32. [Lapkina L.N., Stoikova O.A. Cholinesterases of leeches // Inland Water Biology. Inform. Bull. No. 69. P. 29-32.] In Russian.
Лапкина Л.Н., Чуйко Г.М., Подгорная В.А., Фрайнд В.В., Куфирина Т.А. Биохимические свойства холинэстеразы пиявки Glossiphonia complanata (сем. Glossiphonidae) из Рыбинского водохранилища // Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов Европейского Севера. Матер. IV (XXVII) междунар. конф. Ч. 1 (Вологда, Россия, 5-10 декабря 2005 г.). Вологда, 2005. С. 250-252. Lapkina L.N., Chuiko G.M., Podgornaya V.A., Fraind V.V., Kufirina T.A. Biokhimicheskie svoistva kholinesterazy piyavki Glossiphonia complanata (sem. Glossiphonidae) iz Rybinskogo vodokhranilisha // Biologicheskie resursy Belogo moray i vnutrennikh vodoyemov Evropeiskogo Severa // Mater. IV (XXVII) mezhdunar. konf. Chast' 1 (Vologda, Rossiya, 5-10 dekabrya 2005). Vologda, 2005. S. 250-252. Lapkina L.N., Chuiko G.M., Podgornaya V.A., Fraind V.V., Kufirina T.A. Biochemical properties of cholinesterase in leech Glossiphonia complanata (Glossiphonidae) from the Rybinsk reservoir / Biological resources of White Sea and inland waters of European North // Proceed. IV (XXVII) Inter. Conf. Part 1. (Vologda, Russia, December 5-10, 2005). Vologda, 2005. P. 250-252. In Russian. Лапкина Л.Н., Чуйко Г.М., Подгорная В.А. Активность холинэстеразы пяти видов кровососущих пиявок, отличающихся биолого-экологическими особенностями // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. Матер. II междунар. конф. с элементами школы молод. уч, аспир. и студ. 11-14 сентября 2007 г. Петрозаводск: КарНЦ РАН, 2007. С. 83-84. Lapkina L.N., Chuiko G.M., Podgornaya V.A. Aktivnost' kholiesterazy pyati vidov krovososushchikh piyavok, otlichayushchikhsya biologo-ekologicheskimi osobennostyami // Sovremennye problem fiziologii i biokhimii vodnykh organizmov. Mater. II inter. Conf. s elementami shkoly molod. uchen., aspir. i studentov. 11-14 sentyabrya 2007. Petrozavodsk: KarNTs, 2007. S. 83130
84. [ Lapkina L.N., Chuiko G.M., Podgornaya V.A. Cholinesterase activity of five species of blood-sucking leeches differing on biological and ecological features // Modern problems of physiology and biochemistry of aquatic organisms. Proceed. II Intern. Conf. with elements of school for young scientists, PhD students and college students. September 11-14, 2007. Petrozavodsk: KarSC, 2007. P. 83-84.] In Russian.
Лапкина Л.Н., Чуйко Г.М Физиолого-биохимические реакции пиявок на действие фосфорорганических пестицидов // Физиология и токсикология пресноводных животных (Г.М. Чуйко, ред.). Рыбинск: ОАО "Рыбинский дом печати", 2007. С. 140-177. Lapkina L.N., Chuiko G.M. Fisziologo-biokhimicheskie reaktsii piyavok na deistvie fosfororganicheskikh pestitsidov // Fiziologiya i toxikologiya presnovodnykh zhivotnykh (Chuiko G.M., red.). Rybinsk: OAO "Rybinskiy dom pechati", 2007. S. 140-177. [Lapkina L.N., Chuiko G.M. Physiological and biochemical responses of leeches on action of organophosphorus pesticides // Physiology and toxicology of freshwater animals. Rybinsk: OJSC "Rybinsk Print House", 2007. P. 140-177.] In Russian.
Моралев С.Н., Розенгарт Е.В. Современные представления о структуре и каталитических свойствах холинэстераз позвоночных и беспозвоночных // Ж. эвол. биохим. физиол. 1999. Т. 35. № 1. С. 3-14. Moralev S.N., Rozengart E.V. Sovremennye predstavleniya o strukture i kataliticheskikh svoistvakh kholinesteraz pozvonochnykh i bespozvonochnykh // Zh. Evol. Biokhim. Fiziol. 1999. T. 35. № 1. S. 3-14. [Moralev S.N., Rozengart E.V. Modern views on structure and catalytic properties of cholinesterases of vertebrates and invertebrates // J. Evol. Biochem. Physiol. 1999. Vol. 35. No. 1. P. 3-14.] In Russian.
Розенгарт Е.В. Субстратно-ингибиторный анализ холинэстеразы гемолимфы тихоокеанского брюхоногого моллюска Neptunea eulimata // Ж. эвол. биохим. физиол. 2001. Т. 37. №3. С.165-169. Rozengart E.V. Substratno-ingibitornyi analiz kholinesterazy gemolimfy tikhookeanskogo bryukhonogo mollyuska Neptunea eulimata // Zh. Evol. Biokhim. Fiziol. 2001. Т. 37. №3. P.165-169. [Rozengart E.V. Substrate-inhibitory analysis of cholinesterase of gastropod Neptunea eulimata // J. Evol. Biochem. Physiol. 2001. Vol. 37. No. 3. P. 165-169.] In Russian.
Сазонова И.Н., Новожилов К.В., Брик И.Л., Андреева Н.А. Холинэстераза гороховой тли Acyrthosiphonpisi Kalt. // Биохимия. 1972. Т. 37. № 3. С. 579-584. Sazonova I.N., Novozhilov K.V., Brik I.L., Andreeva N.A. Kholinesteraza gorokhovoi tli Acyrthosiphon pisi Kalt. // Biokhimiya. 1972. Т. 37. № 3. С. 579-584. [Sazonova I.N., Novozhilov K.V., Brik I.L., Andreeva N.A. Cholinesterase of pea aphid Acyrthosiphon pisi Kalt. // Biochemistry (Moscow). 1972. Vol.. 37. No. 4. P. 579-584.] In Russian.
Чуйко Г.М., Подгорная В.А. Холинэстеразы пресноводных костистых рыб // Физиология и токсикология пресноводных животных (Г.М. Чуйко, ред.). Рыбинск: ОАО «Рыбинский дом печати», 2007. С. 100-139. Chuiko G.M., Podgornaya V.A. Kholinesterazy presnovodnykh kostistykh ryb // Fiziologiya i toxikologiya presnovodnykh zhivotnykh (Chuiko G.M., red.). Rybinsk: OAO "Rybinskiy dom pechati", 2007. S. 100-139. [Chuiko G.M., Podgornaya V.A. Cholinesterases of freshwater teleosts // Physiology and toxicology of freshwater animals. Rybinsk: OJSC "Rybinsk Print House", 2007. P. 100-139.] In Russian.
Чуйко Г.М., Подгорная В.А., Лаврикова И.В. Фосфорорганическое соединение 0,0-диметил-0-(2,2-дихлорвинил) фосфат как селективный ингибитор для раздельного определения активности ацетилхолинэстеразы и бутирилхолинэстеразы у плотвы Rutilus rutilus// Ж. эвол. биохим. физиол. 2002. Т. 38, С. 203-207. Chuiko G.M., Podgornaya V.A., Lavrikova I.V. Organophosphorus Compound O,O-Dimethyl-O-(2,2-Dichlorovynyl) Phosphate as Selective Inhibitor for Separate Determination of Acetylcholinesterase and Butyrylcholinesterase Activities in the Roach Rutilus rutilus // J. Evolution. Biochemistry and Physiology, Vol. 38. No. 3, 2002, pp. 264-269. DOI: 10.1023/A:1020724308112] In Russian.
Чуйко Г.М., Портли Н.М., Подгорная В.А., Бороздинская О.А. Ацетилхолинэстераза мозга окуня (Perca fluviatilis L.) из Рыбинского водохранилища // Н.Н. Немова (ред). Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. Мат. междунар. конф 6-9 сентября 2004 г., Петрозаводск, Республика Карелия, Россия. Петрозаводск: ИБ КарНЦ РАН, 2005. С. 202-207. Chuiko G.M., Portley N.M., Podgornaya V.A., Borozdinskaya O.A. Atsetilkholinesteraza mozga okunya (Perca fluviatilis L.) iz Rybinskogo vodokhranilishcha // N.N. Nemova (red.). Sovremennye problem fiziologii i biokhimii wodnykh organizmov. Mater. mezhd. konf. 6-9 sentyabrya 2004, Petrozavodsk, Respublika Kareliya, Rossiya. Petrozavodsk: Inst. Biol. KarNTs RAN, 2005. S. 202-207. [Chuiko G.M., Portley N.M., Podgornaya V.A., Borozdinskaya O.A. Brain acetylcholinesterase of perch (Perca fluviatilis L.) from the Rybinsk reservoir // N.N. Nemova (ed.). Modern problems of physiology and biochemistry of aquatic organisms. Proceed. Intern. Conf. September 6-9, 2004, Petrozavodsk, Republic of Karelia, Russia. Petrozavodsk: KarSC, 2004. P. 202-207.] In Russian.
Шамшурин А. А., Кример М.З. Физико-химические свойства пестицидов. Справочник. М.: Химия, 1976. 328 с. Shamshurin A.A., Krimer M.Z. Fiziko-khimicheskie svoistva pestitsidov. Spravochnik. M.: Khimiya, 1976. 328 s. [Shamshurin A.A., Krimer M.Z. Physical and chemical properties of pesticides. Handbook. M.: Publishing house Chemistry. 1976. 328 p.] In Russian.
Andersen R.A., Aune, T., Barstad, J.A. Characteristics of cholinesterase of the earthworm Eisenia foetida.// Comp. Biochem. Physiol. 1978. Vol. 61С. No. 1. P. 81-87.
Augustinsson K-B. Substrate concentration and specificity of choline ester-splitting enzymes // Arch. Biochem. 1949. Vol. 23. P. 111-126.
Caselli F., Gastaldi L., Gambi N., Fabbri E. In vitro characterization of cholinesterases in the earthworm Eisenia andrei // Comp. Biochem. Physiol. 2006. Vol. 143C. No. 4. P. 416-421.
Chuiko G.M. Comparative study of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in brain and serum of several freshwater fish: specific activities and in vitro inhibition by DD VP, an organophosphorus pesticide // Comp. Biochem. Physiol. 2000. Vol. 127C, No. 3. P. 233-242.
Chuiko G.M., Lapkina L.N., Podgornaya V.A. Substrate-inhibitory analysis of the cholinesterase in the freshwater oligochaete Lumbriculus variegatus (O.F. Müller, 1773; Lumbriculidae, Oligochaeta) // Biochem. System. Ecol. 2011. Vol. 39. No. 3. P. 169-174.
Ellman, G.L., Courtney, K.D., Andres, V. et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol. 1961. Vol.7. P. 88-95.
Moralev, S.N., Rozengart, E.V., Comparative enzymology of cholinesterase. La Jola, CA: International University Line, 2006. 487 p.
Principato, G.B. Contenti, S., Talesa V., Mangiabene, C., Pascolini, R. & Rosi, G. Propionylcholinesterase from Allolobophora caliginosa // Comp. Biochem. Physiol. 1989. Vol. 94C. P. 23-27.
Sokal R.R., Rohlf F.J. Biometry. The principals and practice of statistics in biological research. NY.: W.H. Freeman&Co. 1995. 887 p.
Talesa V., Grauso M., Giovannini E., Rosi G., Toutant J-P. Solubilization, molecular forms, purification and substrate specificity of two acetylcholinesterases in the medicinal leech (Hirudo medicinalis) // Biochem. J. 1995. Vol. 306. P. 687-692.
SUBSTRATE-INHIBITORY ANALYSIS OF CHOLINESTERASE FRESHWATER LEECH CASPIOBDELLA FADEJEWI (Epstein) (PISCICOLLIDAE)
Lapkina L.N., Chuiko G.M., Podgornaya V.A.
I. D. Papanin Institute for Biology of Inland Waters Russian Academy of Sciences, 152742 Borok, Nekouz, Yaroslavl, Russia, e-mail: lapkina@ibiw.yaroslavl.ru
The basic biochemical properties and kinetics of cholinesterase (ChE) of Caspiobdella fadejewi (Epstein) (Rhynchobdellea, Piscicolidae), representative of a class of leeches, were studied. It was found that the values of the enzyme kinetics for different substrates, except PrTCh and MeTCh, differ significantly. The ratio of hydrolysis rates for ATCh : PrTCh : BuTCh : MeT is 100: 74: 13: 59, the V values vary within the range of 3.8 to 0.48 mmol/g/min with ATX and BuTCh respectively. Effect of substrate inhibition is absent for all substrates studied. Leech ChE has greatest affinity to ATCh (Km = 2.64 х 10-4 M), and the minimum to BuTCh (Km = 22.2 х 10-4 M), which is confirmed by the values of the indicator V / Km. The organophosphorus inhibitors, DDVP and paraoxon, inhibit hydrolysis of the three substrates at the same speeds (kll as well as pI50 has a same values). The substrate-inhibitory analysis shows that the leech has only one ChE, differing by properties from a typical AChE and BuChE vertebrates and other previously studied annelids.
Keywords: cholinesterase, leeches, activity, substrate specificity, inhibitors.