CC BY
131
СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ НАНО- И
МИКРОКАПСУЛ, СОДЕРЖАЩИХ ТРАНСПОРТНЫЕ БЕЛКИ КРОВИ
Дубровский А.В, Казакова Л.И., Гужвина Д.В., Шабарчина Л.И., Сухоруков Б.И.
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино, Моск. обл.
e-mail:vattghem@rambler.ru
Получены и проанализированы электронномикроскопические снимки ультратонких срезов полиэлектролитных микрочастиц (ПЭ-микрочастиц), содержащих и не содержащих белок, коровой основой для формирования которых послужили микросферолиты СаСО3. Из полученных данных следует, что ПЭ-микрочастицы, не содержащие белок, являются образованиями со сложной внутренней организацией, состоящей из набора нитевидных и замкнутых наноразмерных элементов полиэлектролитной природы. Обнаружено, что в содержащих белок ПЭ-микрокапсулах в отличие от не содержащих, полиэлектролиты располагаются только в приповерхностном слое и внешняя, пространственно организованная оболочка ограничивает внутренний объем, заполненный раствором белка. С применением флуоресцентного зонда мероцианина-540 (М540) исследовано строение нанослоевых оболочек полиэлектролитных микрокапсул и предложена модель их строения. Методами светорассеяния и оптической микроскопии получены данные по термочувствительности трех типов полиэлектролитных микрокапсул - полых, заполненных интерполиэлектролитными комплексами и транспортными белками крови.
Введение. Полимерная нанотехнология является в настоящее время молодым, но быстро развивающимся направлением материаловедения, позволяющим решать многие вопросы физики, химии, биотехнологии и медицины. В число ее значимых объектов входят полиэлектролитные нано- и микрокапсулы (ПНМК). Полученные к настоящему времени данные демонстрируют широкие возможности применения ПНМК в ряде областей, имеющих техническую направленность. Имеются также работы, иллюстрирующие возможность использования ПНМК в фармакологии для получения пролонгированных форм лекарственных средств и свидетельствующие о преимуществе такого подхода по сравнению, например, с липосомным капсулированием. В отличие от последнего, методом послойного полиэлектролитного капсулирования (ППК) формируется пространственно организованная надмолекулярная структура, устойчивая к действию кислорода и других окислителей. Привлекательность метода ППК заключается прежде всего в его простоте. ПНМК изготавливаются путем поочередного наслаивания противоположно заряженных полиэлектролитов на дисперсные частицы нано- и микроразмеров, так называемые коры, с последующим разрушением этих частиц. В самое последнее время с использованием метода ППК нами начата работа по созданию полиэлектролитных микродиагностикумов и разработке новых методов ферментативного определения концентраций анализируемого низкомолекулярного вещества в сложной биологической жидкости. Для успешного конструирования подобного вида устройств необходимо детально знать структурную организацию и свойства их основных элементов - полиэлектролитных нано- и микрокапсул. Цель и результаты работы. Работа посвящена изучению структуры и свойств полиэлектролитных нано- и микрокапсул (ПНМК) полых и содержащих транспортные белки крови (гемоглобин и альбумин) с помощью оптической и электронной микроскопии, светорассеяния и методом флуоресцентного зонда.
Изучение структуры ПНМК проводили методами трансмиссионной электронной микроскопии и с помощью флуоресцентных зондов.
На рисунках 1 и 2 представлены электронномикроскопические фотографии ультратонких срезов полиэлектролитных микрочастиц (ПЭ микрочастиц), содержащих и не содержащих белки и имеющих разное число полимерных слоев (от 6 до 11). Меньше 6-ти слоев микрочастицы неустойчивы.
1. не содержащие белок (А - 6 2. содержащие белок (А - 6
полиэлектролитных слоев, Б - 7 слов, В - 9 полиэлектролитных слоев, Б - 7 слов, слоев, Г - 10 слоев) В - 9 слоев, Г - 10 слоев)
Рис. 1, 2. Электронная микроскопия ультратонких срезов полиэлектролитных микрокапсул (метка - 2 мкм)
Из рис. 1 видно, что формирование внешней полиэлектролитной оболочки происходит при числе слоев 9 и ее толщина составляет ~ 46 нм. С увеличением числа слоев до 11 толщина оболочки возрастает до 66 нм. Микрочастицы с числом полиэлектролитных слоев менее 9 внешней оболочкой не обладают и состоят из набора нитевидных линейчатых и замкнутых наноразмерных элементов и имеют ложную внутреннюю организацию.
Микрокапсулы, содержащие белок заметно отличаются от не содержащих. В них отсутствует сложная внутриобъемная молекулярная организация, а полиэлектролит распределяется только в приповерхностном слое, образуя пространственно организованную прочную оболочку микрокапсулы. Из рис 2 видны два возможных варианта распределения белка во внутреннем объеме такой капсулы: равномерное распределение белка по всему объему и концентрирование его агрегатов в пристеночном пространстве.
В содержащей белок капсуле, начиная уже с шестислойной, сформирована, хотя и фрагментарно, внешняя оболочка. Начиная с 8-ми полиэлектролитных слоев, толщина оболочки приобретает постоянное значение по всей ее протяженности, что свидетельствует о ее большей организованности и регулярности расположения полиэлектролитных цепей.
Результаты электронномикроскопического изучения находятся в соответствии с данными структурного исследования с использованием амфифильных флуоресцентных зондов, в частности, мероцианина-540 (М540). На кинетических кривых, отражающих взаимодействие М540 с микрокапсулами можно выделить два участка: быстрая нерегистрируемая стадия ^ < сек) и медленный этап взаимодействия, длящийся десятки и сотни секунд (рис. 3).
Эти данные свидетельствуют о тонкой организации нанослоевой оболочки микрокапсулы, состоящей в большей степени из интерполиэлектролитных дуплексов и имеющей на своей поверхности участки молекул полиэлектролитов, несвязанные комплементарно с противоположно заряженными полиэлектролитными нитями.
Одним из важнейших свойств ПНМК является их термочувствительность. Изучение этого свойства проводили как для микрокапсул, не содержащих белки, так и для капсул с включенными в них транспортными белками крови -гемоглобином и сывороточным альбумином быка.
200 400 600 800 1000 1200 1400
1 сек.
60
50
0
Методами малоуглового
светорассеяния и оптической микроскопии было установлено, что при нагревании размер ПНМК уменьшается, а сам эффект возрастает с ростом температуры. На рис. 4 представлены типичные кривые изменения светорассеяния для микрокапсул.
Рис.3. Экспериментальные кривые изменения флуоресценции мероцианина при его взаимодействии с полиэлекторолитными микрокапсулами: А - не содержащих белок; В - содержащих белок.
40 50 мин.
Рис. 4. Кинетические кривые изменения светорассеяния суспензии полиэлектролитных микрочастиц с шестью слоями при различных температурах (1 - 36°С, 2 - 44°С, 3 - 48°С, 4 - 55°С). Q представлено в относительных единицах X и 650 нм, угол рассеяния 4°. Концентрация микрокапсул 106 штук/мл.
Из данных по светорассеянию нами была определена энергия активации процесса изменения структурно -динамических параметров микрокапсул под действием температуры Еа, расчет которой производили графическим методом как tg угла наклона прямой, построенной в координатах ^ Vo от 1/Т, где Vo -логарифм начальной скорости падения светорассеяния. Было установлено, что энергия активации является более чувствительным параметром, отражающим влияние температуры на полиэлектролитные микрокапсулы, чем изменение их диаметра.
Анализируя данные по энергиям активации, можно придти к заключению, что эффективная энергия активации для микрокапсул с четным и нечетным числом полиэлектролитных слоев изменяется, чередуясь. Подобная алтернантность наблюдается как для полых микрокапсул, полученных на латексных микрочастицах, так и для капсул, заполненных полиэлектролитными комплексами. Причем, если для первого типа микрокапсул значения энергии активации в случае четного числа слоев меньше, чем в случае нечетного, то для второго типа капсул эта картина повторяется с точностью до наоборот - энергия активации капсул, имеющих четное число слоев, выше, чем у капсул с нечетным числом.
Исследование термочувствительности ПНМК с включенными в них альбумином и гемоглобином не выявило значительных ее отличий от термочувствительности полых и заполненных интерполиэлектролитными комплексами капсул ни по поведению кривой светорассеяния, ни по уменьшению
диаметра, ни по значениям Еа. Из данного факта можно сделать вывод, что наличие внутри капсул транспортных белков крови или интерполиэлектролитных комплексов мало влияет на сжимаемость их оболочки под воздействием температуры.
Таким образом, из полученных нами данных следует, что:
1. Не содержащие белок полиэлектролитные микрочастицы являются образованиями со сложной внутренней организацией и внешней оболочкой, возникающей с определенного числа слоев. У содержащих белок микрокапсул сформирована оболочка, ограничивающая объем, с заключенным в него белком;
2. Нанослоевая оболочка микрокапсулы имеет тонкую организацию состоящую из интерполиэлектролитных дуплексов расположенных внутри оболочки и однонитевых полиэлектролитов, находящихся, преимущественно, на поверхности;
3. Термочувствительность микрокапсул определяется, в основном, их оболочкой и мало зависит от их заполнения интерполиэлектролитными комплексами или белками.
STRUCTURE AND PROPERTIES OF POLYELECTROLYTE NANO- AND MICROCAPSULES CONTAINING A BLOOD TRANSPORT PROTEINS
Dubrovsky A.V., Kazakova L.I., Guzhvina D.V., Shabarchina L.I. Sukhorukov B.I., Institute of Theoretical and Experimental Biophysics RAS, Pushchino, Moscow Region.
Electron micrographs of ultrathin sections of polyelectrolyte microparticles (PE microparticles) containing and not containing proteins were obtained and analyzed. CaCO3 microspherolytes were used as a core basis for these particles. The data indicate that protein-free PE microparticles are entities with a complex internal organization, containing a set of filamentary and closed nanoelements of polyelectrolyte nature. It was found that in PE microcapsules containing protein, unlike those without protein, polyelectrolytes are present only in the near-the-surface layer, and the external, spatially arranged shell encloses the internal volume filled with a protein solution. A structure of nanolayered shells of polyelectrolyte microcapsules has been investigated with fluorescent probe merocyanine-540 (M540). А structural scheme for microcapsules' shells has been proposed. Data on thermal sensitivity of 3 types polyelectrolyte microcapsules: hollow, encapsulated with interpolyelectrolyte complexes and proteins were obtained with light scattering and optical microscopy.
