Получение модифицированного поли-трет-бутилметакрилата для использования в качестве носителя противоопухолевых лекарственных веществ Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

Khelevina O.G. // Zhurn. Prikl. Khimii. 2011. V. 84. N 11. P. 1903-1907 (in Russian).

6. Долгов O.H., Воронков М.Г., Гринблат М.П. Крем-нийорганические жидкие каучуки и материалы на их основе. JL: Химия. 1975. 112 е.;

Dolgov O.N., Voronkov M.G., Grinblat М.Р. Silicaorganic liquid rubbers and materials on its base. L.: Khimiya. 1975. 112 p. (in Russian).

7. Advances in inorganic chemistry and radiochemistry. Ed. H.J. Emeleus, A.G. Sharpe. New York, London: Acad. Press. 1965. V. 7. P. 28-105.

8. Дехант И., Данц P., Киммер В., Шмольке Р. Инфракрасная спектроскопия полимеров. М.: Химия. 1976. 471 с. (in Russian).

Dekhant I, Dantz P., Kimmer V., Shmolke P. Infrared spectroscopy of polymers. M.: Khimiya. 1976. 471 p. (in Russian).

9. English W.D., Sommer L.H. //J. Am. Chem. Soc. 1955. V. 77. N1. P. 170-176.

10. Филд P., Коув П. Органическая химия титана. М.: Мир. 1969. С. 51;

Feeld R., Cowe P. The organic chemistry of titanium. M.: Mir. 1969. P. 51 (in Russian).

11. Хелевина О.Г., Пухова Е.И. // Изв. вузов. Химия и хим. технология. 2011. Т. 54. Вып. 1. С. 66-71;

Khelevina O.G., Pukhova E.I. // Izv. Vyssh. Uchebn. Zaved. Khim. Khim. Tekhnol. 2011. V. 54. N 1. P. 66-71 (in Russian).

12. Березин Б.Д. Координационные соединения порфири-нов и фталоцианина. М.: Наука. 1978. 280 е.;

Berezin B.D. Coordinated compounds of porphyrins and phthalocyanines. M.: Nauka. 1978. 280 p. (in Russian).

УДК 615.012.1

C.A. Булгакова*, O.B. Жукова*'**

ПОЛУЧЕНИЕ МОДИФИЦИРОВАННОГО ПОЛН-ТРЕТ-БУТИЛМЕТАКРИЛАТА

ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В КАЧЕСТВЕ НОСИТЕЛЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ

(*Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, * *Нижегородская государственная медицинская академия) e-mail: sbulg@mail.ru, ov-zhukova@mail.ru

Изучена кинетика полимеризации трет-бутилметакрилата в присутствии ти-огликолевой кислоты как передатчика цепи. Определены условия получения полимерного носителя с наиболее оптимальными для биосовместимых полимеров характеристиками: Мп = 12400 и Му/Мп = 1,35. Изучена кинетика реакции кислотного гидролиза поли (трет-бутилметакрилата). Энергия активации этой реакции составила 9,34 кДж/моль. Проведена модификация поли(трет-бутилметакрилата) фолиевой кислотой, и получен его конъюгат с доксорубицином.

Ключевые слова: радикальная полимеризация, тиогликолевая кислота, модификация по-ли(я?/;б'й?-бутилмстакрилата). карбодиимидный метод, полимерный носитель доксорубицина

В настоящее время отмечается тенденция неуклонного роста числа онкологических заболеваний. В частности, в России по данным на 2010 г. показатель заболеваемости на 100 000 населения увеличился на 17.8% по сравнению с 2000 г.[1]. Современная фармакотерапия располагает большим арсеналом высокоэффективных лекарственных препаратов (ЛП), однако результаты терапии часто остаются неудовлетворительными. Для решения этой проблемы разрабатываются новые способы противоопухолевой терапии. Одной из перспективных разработок в этой области являются транспортные системы селективной доставки

ЛП. В качестве носителя широко используются полимерные соединения, которые способны изменять фармакокинетику ЛП, увеличивая время циркулирования в крови, благодаря высоким значениям молекулярной массы (ММ) и, за счет этого, увеличивая процесс захвата (эндоцитоз) полимерных производных опухолевыми клетками [2,3]. Одним из способов создания подобных систем доставки ЛП является конструирование полимеров, содержащих «узнающие» компоненты (векторы). В качестве таких векторов может быть использована фолиевая кислота, которая представляет собой водорастворимый витамин и явля-

ется лигандом к фолатным рецепторам, повышенная экспрессия которых характерна для опухолевых клеток [4].

Целью данной работы явилось получение модифицированного фолиевой кислотой полимерного носителя на основе поли(я?/;б'й?-бутил-метакрилата) (ПТБМА) для доставки противоопухолевых ЛП.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Для синтеза полимерного носителя использовали следующие реагенты: туРет-бутилме-такрилат (ТБМА) в качестве мономера (98%, Aldrich); фолиевую кислоту (ФК) (97%, Fluka), N-гидроксисукцинимид (NHS) (98%, Fluka), дицик-логексилкарбодиимид (ДЦГК) (98%, Alfa Aeser), доксорубицина гидрохлорид (DOX), тиогликоле-вую кислоту (ТГК), гексаметилендиамин (ГМДА), гидразингидрат и динитрил азо-изомасляной кислоты (ДАК) в качестве инициатора радикальной полимеризации. Последний очищали перекристаллизацией из изопропилового спирта и сушили в вакуумном шкафу до постоянной массы. Вещества, полученные по каталогам, дополнительной очистке не подвергались. ГМДА очищали сублимацией, а ТГК - перегонкой в вакууме. Метанол, ацетон, диоксан, тетрагидрофуран (ТГФ), диме-тилсульфоксид (ДМСО) очищали по стандартным методикам [5].

Полимеризацию ТБМА проводили в массе при 70°С в присутствии 5-10"2 М ДАК и ТГК в качестве передатчика цепи. Исходные реакционные смеси загружали в ампулы-дилатометры и предварительно дегазировали трехкратным перемора-живанием в вакууме, после чего ампулы запаивали. Полимер очищали трехкратным переосаждением из ацетона в воду, а затем сушили в вакууме до постоянной массы. Кинетику полимеризации ТБМА изучали дилатометрическим методом, основанном на эффекте уменьшения объема системы в ходе процесса.

Молекулярно-массовые характеристики полимеров определяли методом гель-проникающей хроматографии (ГПХ) в ТГФ при 40°С по по-лиметилметакрилатным стандартам на жидкостном хроматографе Prominence LC-20VP "Shima-dzu", оборудованном двумя колонками, наполненными стирагелем с размером пор 10би 105Á, и дифференциальным рефрактометром.

Гидролиз ПТБМА проводили в среде ди-оксана в присутствии разбавленной HCl (1 : 2) из расчета 0,5 мл на 0,25 г полимера при температурах 60°С, 80°С и 100°С в колбе с обратным холодильником. Содержание звеньев метакриловой кислоты (МАК) определяли потенциометриче-

ским кислотно-основным титрованием на приборе ТВ-6Л в смеси метанола с ТГФ 0,1 н раствором КОН в метаноле.

Синтез фолатного вектора (ФВ) проводили карбодиимидным методом. К раствору 0,44 г ФК (1 ммоль) в ДМСО (30 мл) добавляли 0,206 г ДЦГК (1 ммоль) и 0,17 г NHS (1,5 ммоль). Реакцию проводили в темноте при перемешивании на электромагнитной мешалке в течение 6 часов при комнатной температуре. Выпавший осадок ди-циклогексилмочевины (ДЦГМ) отделяли фильтрованием и в реакционную смесь добавляли 0,12 г ГМДА (1 ммоль). Смесь оставляли на ночь при комнатной температуре, затем добавляли избыток ацетонитрила. Выпавший осадок центрифугировали, три раза промывали диэтиловым эфиром (10 мл) и затем сушили в вакуумном шкафу до постоянной массы. Выход конечного продукта составил 84%.

Полимер А получали путем добавления к раствору ПТБМА (Мп = 12800, MJMn = 1,35) в ТГФ с концентрацией 0,02 г/мл, ДЦГК и NHS в мольном соотношении ПТБМА ДТ1ГК NHS = 1: 1,5 : 1,5 и выдерживания смеси в холодильнике не менее 12 ч.

Полимер Б получали при взаимодействии раствора полимера А в ТГФ с растворенным в ДМСО ФВ в эквимольном соотношении при комнатной температуре. Через 12 ч из раствора осаждением в воду выделяли полимер Б.

Синтез полимерного производного DOX проводили следующим образом: к раствору 0,075 г сополимера ТБМА-МАК (2 :80 мас.%), полученному гидролизом ПТБМА, в ДМСО добавляли 0,0043 г ДЦГК (0,02 ммоль) и 0,0036 г NHS (0,03 ммоль). После выдерживания смеси в холодильнике в течение 12 ч, отделяли выпавший осадок ДЦГМ, а к раствору добавляли 0,01 мл гидразин-гидрата (0,2 ммоль) и перемешивали смесь в темноте на электромагнитной мешалке в течение 6 часов при комнатной температуре. Затем к реакционной смеси добавляли 0,01 г DOX (0,02 ммоль), предварительно растворенного в метаноле, и уксусную кислоту в качестве катализатора. Смесь выдерживали в течение 48 ч в защищенном от света месте, после чего модифицированный полимер высаживали смесью ацетонитрила и ацетона (3:1), осадок центрифугировали и сушили в вакуумном шкафу.

ПК спектры записывали на ПК-Фурье спектрометре "Инфралюм ФТ-801" с разрешением 4 см"1, оборудованном профессиональным компьютером с программным обеспечением Expert Pro 801.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор ПТБМА в качестве полимерного носителя связан с возможностью его гидролиза в «мягких» условиях с образованием водорастворимых биосовместимых сополимеров ТБМА-МАК, либо ПМАК. Поскольку ММ биополимеров не должна превышать значений почечного порога (Мп < 30000), для регулирования этого параметра нами была использована реакция передачи цепи на ТГК, которая позволяет не только регулировать ММ, но и функционализировать макромолекулы полимера карбоксильными группами, необходимыми для его дальнейшей модификации ФК (схема 1).

СООС(СН3)3

-сн,-с. " I

сн,

HSCH2COOH

СООС(СНз)зсоОС(СНз)з

Чсн2-с-)п-сн2-ш + -sCHzCOOH

СН3 СН3

СООС(СН3)з

HOOCCH2S. + ПСН2=С -

СНз

СООС(СН3)3

-HOOCCH2S- (СН2-С )п

¿н3

Схема 1. Реакция передачи цепи на ТГК при радикальной полимеризации ТЕМА Scheme 1. Chain transfer reaction on TGA at TBMA radical polymerization

Рис. 1. Зависимость начальной скорости полимеризации ТЕМА в массе от концентрации ТГК, [ДАК] = 0.05 М, 70 °С Fig. 1. The dependence of the initial rate of polymerization of TBMA in the mass on the concentration of TGAj [AIBN] = 0.05 M, 70 °C

Для направленного синтеза полимера с заданными характеристиками было изучено влияние

концентрации ТГК как на начальную скорость полимеризации ТБМА, так и на ММ полимера. Как видно из рис. 1, скорость полимеризации ТБМА снижается в 1,5 раза уже при введении 0,5% ТГК и далее практически не зависит от концентрации передатчика цепи. Уменьшение скорости полимеризации связано с тем, что радикал НООССН28-, образующийся по реакции передачи цепи, более стабилизирован, а, следовательно, менее активен, чем радикал ТБМА.

Изменение степени полимеризации полимера (ММ) при увеличении концентрации ТГК в отсутствие реакций передачи цепи на полимер, мономер и инициатор описывается уравнением Майо:

м

[М]'_

где (- константа передачи цепи, Р и />,, - сред-

J= = J- + C,

РР

1 „ 1 о

(1)

няя степень полимеризации в отсутствие и присутствии ТГК соответственно; [8], [М] - мольные концентрации ТГК и ТБМА соответственно. Из зависимости Майо, представленной на рис. 2, была рассчитана константа передачи цепи на ТГК С '.,= 1.92. Зная эту величину, можно с большой вероятностью предсказывать ММ полимера в зависимости от концентрации передатчика цепи при проведении полимеризации до глубоких конвер-сий и оценить эффективность функционализации концевых групп полимера.

Рис. 2. Зависимость Майо для ПТБМА, полученного при полимеризации ТБМА в массе при 0.05 М ДАК и 70 °С в присутствии ТГК

Fig. 2. The Mayo dependence for PTBMA obtained at the polymerization of TBMA in mass at 0.05 M AIBN and 70 °C in the presence of TGA

Полученные результаты позволили выбрать концентрацию ТГК (1 мас.%), при которой за 4 ч достигается конверсия ~ 98%, и образуется ПТБМА с наиболее оптимальными для биосовместимых полимеров характеристиками: Мп = 12400 и MJMn = 1,35. Для оценки степени функ-

ционализации этого полимера концевыми карбоксильными группами был применен простой теоретический расчет при допущении, что константа передачи цепи не меняется в течение всего процесса полимеризации. Суть его состоит в следующем. Исходя из пропорции, что 1 моль ТГК расходуется на х моль ТБМА, а Ио-И молей ТГК - на [М\о-[М\ молей ТБМА, получаем:

х=[М]п-[М]/(Ио-И), в частности, для конверсии 98% х = 0.98[М]п/([5]о-[5]). Неизвестная в этом соотношении концентрация передатчика цепи [5] при данной конверсии может быть рассчитана из уравнения (2) [6]:

получен фолатный вектор - гексаметилендиамин фолат по реакциям взаимодействия ФК с NHS, ДЦГК и ГМДА. Доказательством образования последнего являются данные ИК-Фурье спектроскопии (рис. 3). Видно, что в спектре гексаметилендиамин фолата имеются полосы, отвечающие валентным колебаниям метиленовых групп от молекулы ГМДА в области 2854 и 2936 см которых нет в спектре ФК.

[S]

И,;,

(

JМ] [М]

у

(2)

о J

При заданных значениях \М\0 и |Л'|„. (полимеризация ТБМА в массе, 1% ТГК) с помощью уравнения (2), получаем, что х=70 моль ТБМА. Это означает, что на каждые 70 звеньев ТБМА приходится один остаток ТГК. В нашем случае при Мп= 12400 каждая макромолекула содержит 12400:142=87 звеньев ТБМА, т.е. можно считать, что практически все макромолекулы ПТБМА функционализированы карбоксильными звеньями.

Наличие свободной карбоксильной группы было использовано для модификации полимера ФК, которая является вектором к опухолевым клеткам [4]. Для этого карбодиимидным методом карбоксильные группы ПТБМА были превращены в гидроксисукцинимидные (полимер А), а из ФК

Рис. 3. ИК спектры ГМДА (1), ФЩ2) и гексаметилендиамин фолата (5)

Fig. 3. IR spectra of HMDA (1), FA (2) and hexamethylene-diamine folate (3)

Затем полимер А превращали в полимер Б - ПТБМА с концевыми группами ФК (схема 2).

Схема 2. Получение фолат-модифицированного полимера Б Scheme 2. Obtaining folate-modifying В polymer

Следующий этап исследований заключался в изучении кинетики кислотного гидролиза ПТБМА для получения биосовместимого полимера, содержащего звенья метакриловой кислоты. Как видно из схемы 3, гидролиз ПТБМА носит автокаталитический характер и является необратимым процессом по причине выделения газообразного изобутилена.

Для оценки энергии активации этого процесса были проведены исследования при 60°С,

80°С и 100°С. Результаты исследований представлены на рис. 4 в виде зависимости Аррениуса, из

сн,

-icHo-cj']-

с=о—-

г

СН, снз

-Н4"

сн,

-(СНо-С^)- +

с-он

СНо=С-СН,

" I " сн,

Схема 3. Реакция кислотного гидролиза ПТБМА Scheme 3. РТВМА acid hydrolysis

которой было рассчитано значение энергии активации кислотного гидролиза ПТБМА Еа = 9,34 кДж/моль. Такая низкая величина Еа указывает на высокую скорость реакции кислотного гидролиза ПТБМА.

1п К -9,2

-9,4

-9,6

2,5 2,6 2,7 2,8 2,9 3

!/Т. 10--

Рис. 4. Зависимость константы скорости реакции гидролиза ПТБМА от температуры в Аррениусовских координатах у=1123.6х-6.177, R2=0.9627 Fig. 4. The dependence of the reaction rate constant of hydrolysis of PTBMA on the temperature in Arrhenius coordinates y=1123.6x-6.177, R2=0.9627

Полученный таким образом сополимер ТБМА-МАК (20:80 мас.%) был использован для химической «прививки» противоопухолевого средства DOX по реакции карбоксильных групп, предварительно модифицированных гидразином, как описано на схеме 4.

о

II N Н ,— N Н 2

С хема 4. Модификация гидразином звеньев МАК сополимера ТБМА-МАК (20: 80 мас.%) и химическая «прививка» к ним DOX

Scheme 4. Modification of МАК units with hydrazine for TBMA-MAK co-polymer (20:80 mass%) and DOX chemical grafting to them

Методом ИК-спектроскопии было зафиксировано появление полос 1547 см 1 и 1650 см относящихся к колебаниям -NH- и -СО- групп амидной связи, что свидетельствует о присоединении DOX к полимеру.

ВЫВОДЫ

Изучены кинетика процесса полимеризации ТБМА в присутствии ТГК как передатчика цепи. Скорость полимеризации ТБМА снижается в 1,5 раза при введении 0,5% ТГК и далее не зависит от концентрации передатчика цепи. Константа передачи цепи на ТГК составила Cs= 1,92.

Получен ПТБМА с оптимальными моле-кулярно-массовыми характеристиками для биосовместимых полимеров (Мп = 12400 и MJMn = 1,35) и терминальной карбоксильной группой.

Проведена модификация ПТБМА карбо-диимидным методом по терминальным карбоксильным группам фолиевой кислотой.

Изучена кинетика кислотного гидролиза ПТБМА и оценена его энергия активации (£■¡,=9,34 кДж/моль).

Осуществлена химическая «прививка» противоопухолевого средства доксорубицина к сополимеру ТБМА-МАК (80 : 20 мас.%), полученному методом кислотного гидролиза ПТБМА.

ЛИТЕРАТУРА

1. Состояние онкологической помощи населению России в 2010 г. / Под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. Москва: ФГУ «МНИОН им. П.А. Герцена» Минздравсоцразвития России. 2011. 188 е.;

Status of cancer care in Russia in 2010. / Ed. V.I. Chissov, V.V. Starinskiy G.V., Petrovoiy. M.: FGU «MNION im. P.A. Gercena» Minzdravsotsrazvitiya Rossii. 2011. 188 p. (in Russian).

2. Проценко C.A. // Практическая онкология. 2007. Т. 8. С. 175-181;

Protsenko S.A. // Prakticheskaya onkologiya. 2007. V. 8. P. 175-181 (in Russian).

3. GabizonA.A. Liposomal Drug Carriers in Cancer Therapy. Ed. Torchilin V.P. London: Imperiae Colledge Press. 2006. P. 437-462.

4. Salazar M.D., Ratnam M. // Cancer Metastasis Rev. 2007. V. 26. P. 141-152.

5. Вайсбергер А., Проскауэр Э., Риддик Дж., Тупс Э.

Органические растворители. Физические свойства и методы очистки. / Под ред. Я.М. Варшавского. М.: Изд-во иностр. лит., 1958. 519 с.;

Weisberger A., Proskauer Е., Riddick J. Organic solvents. Physical properties and methods of purification. / Ed. Varshavskiy Ya.M.. M.: Izd-vo inostr. lit. 1958. 519 p. (in Russian).

6. Зильберман E.H., Наволокина P.A. Примеры и задачи по химии высокомолекулярных соединений. Учеб. пособие для хим. и хим. - технол. спец. вузов. М.: Высш. школа. 1984. 224 е.;

Zil'berman E.N., Navolokina R.A. Examples and problems on Macromolecular Chemistry. Tutorial for chem.. and chem. tecnnol. Specialities of Universities. M.: Vyssh. shko-la. 1984. 224 p. (in Russian).