CC BY
31
УДК 541.64:542.952:547.46
Вестник С116ГУ. Сер. 4, 2006, вып. 3
В. П. Алябьева, Н. В. Гирбасова, А. Ю. Билибин
СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИ-7-ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ С АМИНОКИСЛОТНЫМИ ДЕНДРОНАМИ В БОКОВОЙ ЦЕПИ*)
Введение. Синтез и исследование веществ, полученных с использованием фрагментов природного происхождения, представляют собой стабильно развивающуюся область науки. Интерес к ней обусловлен потребностью в биосовместимых веществах с заданными свойствами (как правило, для нужд медицины и биологии). В этих целях функциональные группы синтетических полимеров и дендримеров часто используют как якорные группы для различных биологических и небиологических фрагментов, таких как аминокислоты, сахариды, липиды, комплексы металлов и т. д. [1-3].
Первые полимеры и сополимеры с дендронами на основе Ь-аспарагиновой кислоты методом радикальной полимеризации были получены в 1996 г. [4]. Совсем недавно опубликована статья по синтезу полистирола с дендронами на основе Ь-лизина [5]. В работах [4, 5] природные трифункциональные аминокислоты применялись только в качестве строительных блоков дендритных боковых заместителей полимеров с поливиниловой основной цепью. Также были синтезированы обладающие спиральной структурой полиацетилены, в которых производные Ь-аспарагиновой и Ь-глутаминовой кислот присоединялись к основной цепи через карбоксильную группу аминокислот [6].
В лаборатории синтеза полимеров химического факультета СПбГУ в течение ряда лет ведутся исследования, посвященные получению и изучению свойств линейных дендримеров - полимеров с плотно и регулярно расположенными вдоль цепи боковыми разветвленными заместителями, построенными из остатков Ь-аспарагиновой или Ь-глутаминовой кислоты с различными сложноэфирными концевыми группами. Такие полимеры синтезировали либо радикальной полимеризацией дендронизованных акриловых мономеров [7], либо полимераналогичными превращениями активированной полиакриловой кислоты [8] или полистиролсульфокислоты (в этом случае были получены дендритные ионные комплексы) [9, 10]. Эти полимеры были исследованы методами молекулярной гидродинамики, оптики и электрооптики [11-14]. Методом светорассеяния изучены акриловые полимеры с гидролизованными концевыми группами дендронов, являющиеся полиэлектролитами с 2 и 4 карбоксильными группами, приходящимися на одно мономерное звено полимера [15].
Результаты и их обсуждение. В данной работе впервые описаны дендронизо-ванные полимеры с основной полиамидной цепью. Они представляют собой поли-7-глутаминовую кислоту (П-7-ГК), в боковой цепи которой находятся дендроны первой и второй генераций, построенные из остатков Ь-аспарагиновой кислоты. Следует отметить, что единственным методом синтеза полиаминокислот, несущих в боковой цепи присоединенный амидной связью заместитель, до сих пор являлись полимераналогич-ные превращения эфиров полиаминокислот [16]. Проведенный нами синтез - первый пример прямого получения таких объектов из сложных мономеров, уже имеющих в качестве заместителя другую аминокислоту (или дендрон на ее основе).
Известно, что для синтеза производных П-7-ГК можно применить либо модификацию П-7-ГК бактериального происхождения [17] смешанного энантиомерного состава,
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 03-03-32333) и гранта проф. А. де Майере (Университет г. Геттинген, Германия).
© В. П. Алябьева, Н. В. Гирбасова, А. Ю. Билибин, 2006
б
о
о
Ао
/к Я
О НМ чО II I о
МеО
ОМе
0 О N4
О N4
МеО' ~
ОМе0<Т ^ ^ОМе ОМе
Рис. 1. П-7-ГК с дендроном первой (а) и второй (б) генераций.
либо (в частности, для получения эфиров) поликонденсацию коротких, предварительно синтезированных олигоаминокислотных последовательностей. Так, в работе [18] с помощью стратегии пошагового синтеза были получены п-меры а-этилового эфира П-7-ГК (п = 2, 4, 8, 16). Кроме того, в работе [19] поликонденсацией предварительно синтезированных димеров был получен а-метиловый эфир П-7-ГК. Для синтеза дендронизованных полимеров на основе П-7-ГК (рис. 1) был использован такой же принцип: поликонденсация предварительно синтезированных димеров, несущих в боковой цепи необходимые заместители. Приведенная ниже схема иллюстрирует образование дендронизованных димеров в виде активированных пентафторфениловых эфиров с дендронами первой (Б^ или второй (Бг) генерации:
ВгЮН, НиЭОд Поп о к гп
НС1и(ОН)2 -НС1и(а-ОН)(у-ОВг1) 21 2
ВосС1и(а-ОН)(у-ОВг1) дцгк' Вос61и(а-В)(уЮВг1) -
Н2, Рс)/С
ВосС1и(а-0)(у-ОН)
дцгк
НС11 диоксан Тэа
-НС1-НС1и(а-0)(у-ОВ21)--
Н2, Рё/С
■^В0сС1и(а-0)С1и(а-0)(у-0В21) -^ВосС1и(а-0)01и(а-0)(у-ОН)
РГр-ОН, ДЦГК НС1 / диоксан
-В0сС1и(а-0)С1и(а-0)(у-0РГр) -
НС1-НС1и(а-0)С1и(а-0)(у-ОРГр),
где Б - дендрон первой или второй генерации; Вое - третбутилоксикарбонил; Вг1 -бензил.
Выбор растворителей для полимеризации димеров был обусловлен наличием большого количества амидных связей в молекулах мономеров и особенно полимеров, приводящих к низкой растворимости продуктов. Потому применяли растворители с высокой сольватирующей способностью, т. е. амидные растворители [19], ДМСО [7] и гексаме-тапол (ГМП) [20]. 96
Поликонденсация. Для освобождения аминогруппы в ходе поликонденсации использовали триэтиламин (ТЭА). Реакцию проводили при 60 °С. Осуществление реакции при более высоких температурах могло способствовать побочной реакции рацемизации. Для димеров, несущих Бь было изучено влияние природы растворителя, концентрации и времени реакции на молекулярные массы образующихся полимеров.
Условия и результаты поликонденсации пентафторфениловых эфиров димеров
№ опыта Растворитель с, МОль/л ч ВМ-фракция НМ-фракция
Выход, % п (М„)** т)пр(с = 0,5 г/дл), в ДХУК, 25 °С Выход, % п (М„)**
1 ДМСО 0,2 48 3 - - - -
2 ДМСО 0,6 24 49 37 (~10 300) - 16 10 (~2900)
3 ДМСО 1,0-0,5* 48 79 46 (~12 600) 0,15 3 -
4 ДМСО 1,0-0,3* 24 71 42 (~И 600) 0,15 15 -
5 Ы-МП с 3% 1ЛС1 0,5 24 47 26 (~7200) 0,13 30 7 (~2200)
6 Ы-МП с 3% ЫС1 1,0-0,5* 48 51 31 (~8600) - 46 15 (~4200)
7 ГМП : Ы-МП = 3 • 2 1,0-0,5* 48 58 33 (~9300) 0,13 40 15 (~4200)
8 ДМФА 1,0-0,5* 48 30 24 (~6700) 0,12 42 -
9 ДМСО 1,0-0,5* 120 67 13 (~7000) - 9 4 (~2300)
(полимер с Бг)
* Исходная концентрация С = 1 моль/л; когда полимер начинал выпадать из реакционной смеси, ее разбавляли до 0,5 моль/л (опыт № 4 - 0,3 моль/л).
** Рассчитанные по электронным спектрам.
Условия и результаты поликонденсации приведены в таблице. Разделение олигомеров на фракции по молекулярным массам осуществляли в зависимости от их растворимости при добавлении к реакционной смеси метанола и диэтилового эфира. Поскольку полученные полимеры растворяются в крайне ограниченном количестве агрессивных растворителей (ди-хлоруксусная кислота (ДХУК), трифторуксусная (ТФУК) кислота или ее смеси с хлороформом), то степень полимеризации была оценена только методами электронной спектроскопии (по полосе поглощения пентафторфенольного фрагмента: Л = 250 нм, е = 470 л/моль-см) и вискозиметрии (см. экспериментальную часть). Приведенные результаты, как показали дальнейшие исследования гидролизованных образцов, оказались завышенными, но тем не менее дали возможность сравнить между собой степени полимеризации продуктов, полученных в различных условиях. Практически во всех опытах основная часть образовавшихся олигомеров выпадала из растворов в первые часы синтеза, что, по-видимому, препятствовало дальнейшему протеканию поликонденсации. Следует отметить, что проведение реакции при начальной концентрации С< 1 моль/л приводило к резкому уменьшению степени полимеризации (ср. опыты № 1-3). Подобные зависимости степени полимеризации от концентрации наблюдаются при использовании различных методов синтеза дендронизованных полимеров [21, 22]. Чтобы увеличить время реакции, протекающей в гомогенной среде, реакционная смесь последовательно разбавлялась растворителем от концентрации 1 до 0,5 моль/л, однако через некоторое время полимер снова выпадал из раствора.
Наибольшая степень поликонденсации П-7-ГК с дендроном первой генерации была достигнута в ДМСО (опыты № 3 и 4). Поликонденсация П-7-ГК с дендроном второй генерации при проведении реакции в ДМСО в тех же условиях даже при увеличении времени реакции до 120 ч привела к образованию более короткого олигомера. Поэтому в дальнейшем исследовали только П-7-ГК с дендроном первой генерации. Были измерены вязкости полученных образцов полимеров в ДХУК. Определить характеристическую вязкость изучаемых полимеров не
удалось, так как в ходе измерения наблюдался рост приведенной вязкости с уменьшением концентрации раствора при высоком разбавлении - полиэлектролитный эффект. Он может быть связан с протонированием боковых амидных связей ДХУК (аналогичное явление было отмечено для акриловых полимеров, несущих те же дендроны в боковой цепи [7]). Сравнение полимеров по вязкости раствора провели при концентрации с = 0,5 г/дл, которая для всех образцов находилась на линейном участке зависимости г)п9 - с (см. таблицу).
Гидролиз концевых сложноэфирных групп. Тот факт, что внутренняя сфера ден-дронизованной П-7-ГК содержит устойчивые к гидролизу амидные связи, а внешняя - более лабильные сложноэфирные, позволил осуществить щелочной гидролиз концевых сложноэфирных групп полимера (образец № 4). Метод гидролиза полимеров с невысокой молекулярной массой в растворе гидроксида бария с последующей обработкой соли рассчитанным количеством серной кислоты описан в работе [7]. Полученный дендронизованный полимер растворяется в воде, обладает полиэлектролитными свойствами и имеет более высокую плотность карбоксильных групп на периферии, чем сама П-7-ГК. ПМР спектр гидролизованного полимера показал наличие только 4 % остаточных метильных групп. Характеристическая вязкость, измеренная в 0,4 М КаС1 при 25 °С, составила 0,06 дл/г.
Степень полимеризации рассчитывали по среднечисленной молекулярной массе, которую определяли по данным гель-проникающей хроматографии (ГПХ): в 0,8 % КаКОз она составила 18-20, в 0,1 М КаС1 - 16-18. Очень узкое для поликонденсационных процессов молекулярно-массовое распределение (ММР = 1,16 и 1,09 соответственно) может быть обусловлено выпадением олигомеров из раствора по достижении критической молекулярной массы (ММ) и прекращением роста их цепей. Очень близкое значение степени полимеризации (18-20) получено методом МАЬБ1-ТОР спектроскопии (рис. 2). Значительно меньшие величины степени полимеризации по сравнению с приведенными в таблице можно было бы объяснить частичным разрывом амидных связей основной цепи в достаточно жестких условиях гидролиза, однако узкое ММР является аргументом против такого предположения. Количество пентафторфе-нильных концевых фрагментов олигомеров могло уменьшиться за счет побочных реакций гидролиза и циклизации в процессе поликонденсации. Максимальная степень поликонденса-•ции метилового эфира П-7-ГК в работе [19] составила 120-130. Значительно меньшая степень поликонденсации изученных нами полимеров, по-видимому, связана не только с увеличением объема бокового заместителя, но и главным образом с изменением его природы и значительным понижением растворимости полимера.
Изучение конформационного поведения дендронизованного полимера. Хорошо известно, что конформация П-а-Ь-ГК претерпевает переход от а-спирали к конформации статистического клубка при возрастании рН раствора. Этот переход сопровождается изменением вязкости раствора, величины оптического вращения, спектров дисперсии оптического вращения и кругового дихроизма (КД) [23-26]. Так, вязкость растворов П-а-ГК в 0,4 М КаС1 при переходе от рН 2,7 к рН 7,5 повышается от 0,8 до 1,25 дл/г [27]. Природная П-7-ГК имеет смешанный энантиомерный состав и потому не обладает свойствами, похожими на описанные выше. Однако существуют данные расчетов методами математического моделирования, которые показывают, что оптически чистая П-7-ГК способна образовывать а-спиральную кон-формацию [28].
Для того чтобы показать, как влияет изменение рН раствора на конформацию изучаемых дендронизованных полимеров, была измерена вязкость гидролизованного полимера (образец № 4) при рН 2,7 и 7,5. Характеристическая вязкость при повышении рН уменьшилась от 0,06 до 0,04 дл/г, т. е. в пределах погрешности измерения практически не изменилась. Для определения оптической активности полимеров были сняты спектры КД в 0,4 М при тех же значениях рН раствора в интервале длин волн 190-250 нм (рис. 3, кривая 3). Для сравнения на рис. 3 (кривые 1, 2) приведены спектры КД П-а-Ь-ГК в конформациях а-спирали и статистического клубка [27]. Видно, что спектр дендронизованной кислоты независимо от рН практически совпадает со спектром П-а-Ь-ГК в конформации статистического клубка. Таким образом, полученные олигомеры не образуют а-спиральную конформацию.
I, отн. ед.
Рис. 2. МАЬЭ1-ТОГ масс-спектр П-7-ГК с дендроном первой генерации с концевыми карбоксильными группами.
[0]-1О~3
Рис. 3. Спектры КД.
1, 2 - П-а-ГК в конформациях статистического клубка (1) и а-спирали (2) [27]; 3 - дендронизованная П-7-ГК при рН 2,7 и 7,5.
Такое поведение может быть обусловлено несколькими факторами. Во-первых, низкой степенью полимеризации, недостаточной для формирования спиральной вторичной структуры (макромолекула может принимать спиральную конформацию только начиная с определенных значений степени полимеризации [29], например, поли-7-метил-Ь-глутамат - с 9 аминокислотных остатков [30]). Во-вторых, наличием несимметричного объемного заместителя в боковой
цепи, препятствующего образованию регулярных водородных связей и закручиванию цепи. И, в-третьих, возможной оптической неоднородностью полимера. В дальнейшем этот вопрос требует более детального изучения.
Заключение. Методом поликонденсации предварительно синтезированных дендронизованных димеров впервые получена П-7-ГК, несущая в боковой цепи аспарагиновые дендроны первой и второй генераций с концевыми сложноэфирными группами. Максимальная степень полимеризации достигнута с использованием ДМСО в качестве растворителя и в случае дендрона первой генерации составила 18-20. Синтезу высокомолекулярных полимеров препятствует низкая растворимость продуктов. Олигомеры имели узкое ММР, по-видимому, обусловленное выпадением полимера из растворов по достижении определенной молекулярной массы. Был проведен гидролиз концевых сложноэфирных групп дендронов и получена водорастворимая поликислота. Показано, что ее образцы в водно-солевых растворах существуют в конформации статистического клубка независимо от рН среды. С дендроном второй генерации были выделены значительно более короткие олигомеры.
Экспериментальная часть. Для синтеза исходных соединений использовали L-ac-парагиновую и L-глутаминовую кислоты квалификации «ч.». Растворители очищали по стандартным методикам [31]. УФ-спектры снимали на приборе СС-56 «Ломо» ; для снятия спектров КД использовали JASCO J-702 спектрометр. ЯМР-спектры снимали на приборе BRUKER DPX-300 (300,13 МГц) в растворах CDCI3, D20 или DMSO-d6. Вязкость полимеров измеряли при 25 °С в вискозиметре Убеллоде в ДХУК и 0,4 M NaCl. Требуемые значения рН при измерении вязкости и спектров КД создавали цитратно-фосфатным буфером. ГПХ с применением ПЭО-стандартов осуществляли на колонке Zorbax PSM, растворитель - 0,4 M NaCI, скорость элюирования - 0,5 мл/мин, детектирование - рефрактометрическое. MALDI-TOF масс-спектры снимали на приборе «Voyager» DE, матрица - а-циано-4-гидроксикоричная кислота.
По известным методикам были синтезированы Вос-аспарагиновая кислота (Вое-Asp) [32], гидрохлорид диметил-Ь-аспарагината (НС1 • Di) [33], тетраметил-М^-Вос-аспартоил-М^М2-диаспарагинат (дендрон второй генерации - B0C-D2) и его гидрохлорид (HCI • D2) [7], 7-бензил-Ь-глутамат (HGlu(a-OH) (7-OBzl)) [33] и 1Ч-Вос-7-бензил-Ь-глутаминовая кислота (N-Boc-Glu(a-OH)(7-OBzl)) [32]. Бензильную защиту снимали гидрогенолизом, используя 5-10 % Pd/C по типичной методике [33] в метаноле (кроме димера с дендроном второй генерации); Вос-защиту с аминогруппы - раствором НС1 в диоксане [33]. Для снятия УФ-спектров и измерения вязкости использовали только свежеприготовленные растворы полимеров в ДХУК или смеси ДФУК с хлороформом, поскольку при стоянии более 24 ч происходит их заметная деградация [34].
Общая методика синтеза мономеров. К раствору 8 ммоль HCl-Di или HCID2 в 10 мл абсолютного этилацетата добавили 8 ммоль ТЭА и перемешивали при комнатной температуре 1 ч. Затем образовавшуюся соль ТЭА отфильтровали, фильтрат объединили с раствором 7,28 ммоль N-Boc-Glu(a-OH)(7-OBzl) в 10 мл этилацетата. К полученной смеси при перемешивании и охлаждении до -15 °С добавили по каплям раствор 8 ммоль ДЦГК в 10 мл этилацетата. Смесь выдержали 2 суток при -18 °С, затем сутки при 4 °С. При комнатной температуре перемешивали реакционную смесь 4 ч, после чего обрабатывали в зависимости-от растворимости мономера в этилацетате. Если мономер остался в растворе, то дициклогек-силмочевину (ДЦГМ) отфильтровали, этилацетатный раствор разбавили в 2 раза, промыли 5 мл 0,5 N H2SO4, 1 N NaHC03, насыщенным раствором NaCl. Растворитель отогнали. Если мономер выпал из раствора, то весь осадок отфильтровали и растворили в минимальном количестве хлороформа. Нерастворимую ДЦГМ отфильтровали, фильтрат упарили.
Н-Вос-а-(диметил-]>Т-аспарагинат)-7-бензил-1/-глутамат, [N-Boc-Glu(a-Di )(7-OBzl)]. Продукт очищали перекристаллизацией в смеси этилацетат / петролейный эфир. Выход 83%. Тпл= 73-75 °С. Спектр ЯМР (CDCU): S, м. д.: 1,45 (s, 9Н, (СН3)зС); 2,00 и 2,18 (оба m, 2Н, СН-СН2-СН2); 2,55 (m, 2Н, СН-СН2-СН2); 2,78-3,12 (dd, 2Н, СН-СН2-СООСНз); 3,71 и 3,75 (оба s, 6Н, 2СН3); 4,25 (m, 1Н, СН-СН2-СН2); 4,87 (m, 1Н, СН-СН2-
СООСНз); 5,15 (в, 2Н, СН2-С6Н5); 5,28 (с1, 1Н, 73 = 7,66 Гц, ГШ-СН-(СН2)2); 7,10 (а, 1Н, 73 = 6,9 Гц, ГШ-СН-СН2-СООСН3); 7,37 (5Н, СН2-С6Н5). Найдено, %: С 57,65; Н 6,92; N 5,84. СгзНзгКгОэ- Вычислено, %: С 57,49; Н 6,71; N 5,83.
ГЧ-Вос-а^тетраметил-Г^-аспартоил-К1, 1Ч2-диаспарагинат)-7-бензил-Ь-глутамат, ^-Вос-С1и(а-В2)(7-ОВг1)]. Перекристаллизовывали из изопропанола. Выход 66%. Тпл = 140- 141 °С. Спектр ЯМР :Н (СБС13): м. д.: 1,45 (в, 9Н, (СН3)3С); 1,98 и 2,20 (оба ш, 2Н, СН-СН2-СН2); 2,48-3,07 (группа сигналов; 8Н, СН2); 3,69, 3,70, 3,72 и 3,77 (все б, 12Н, СН3); 4,18 (ш, 1Н, КН-СН-СН2-СН2); 4,75-4,91 (ЗН, СН); 5,14 (в, 2Н, СН2-С6Н5); 5,42 (с1, 1Н, 73 = 7,26 Гц, Вос-ГШ); 6,87 (а, 1Н, 73 = 7,99 Гц, ГШ); 7,37 (5Н, СН2-С6Н5); 7,65 (с1, 1Н, 73 = 7,99 Гц, ГШ); 7,76 (а, 1Н, 73 = 7,26 Гц, ГШ). Найдено, %: С 53,60; Н 6,33; N 7,67. СззШв^Охб. Вычислено, %: С 53,66; Н 6,28; N 7,58.
1Ч-Вос-а-(диметил-К-аспарагинат)-1(-глутаминовая кислота, [1Ч-Вос-С1и(а-В1) (7-СООН)]. Выход 98%. Тпл = 28-30 °С. Спектр ЯМР *Н (СБС13): 6, м. д.: 1,45 (э, 9Н, (СН3)3С); 1,95 и 2,14 (оба т, 2Н, СН-СН2-СН2); 2,42-2,62 (т, 2Н, СН-СН2-СН2); 2,81-3,10 (аа, 2Н, СН-СН2-СООСН3); 3,71 и 3,77 (оба б, 6Н, 2СН3); 4,16 (0,ЗН, ГШ-СН-СН2-СН2); 4,36 (т, 0,7Н, ГШ-СН-СН2-СН2); 4,90 (т, 1Н, МН-СН-СН2-СООСН3); 5,48 (а, 0,7Н, 73 - 8,48 Гц, ГШ-СН-СН2-СН2); 6,36 (0,ЗН, ГШ-СН-СН2-СН2); 7,47 (а, 1Н, 73 = 7,71 Гц, ГШ-СН-СН2-СООСНз). Найдено, %: С 49,26; Н 6,79; N 6,78. С16Н26К209. Вычислено, %: С 49,23; Н 6,71; N 7,18.
1Ч-Вос-а- (тетраметил-Г^-аспартоил-Г^1 ,1Ч2-диаспарагинат)-Ь-глутаминовая кислота, [К-Вос-С1и(а-Б2)(7-СООН)]. Выход 98%. Тпл = 148-150 °С. Спектр ЯМР :Н (СБС13): 6, м. д.: 1,44 (б, 9Н, (СН3)3С); 1,97 и 2,12 (оба т, 2Н, СН-СН2-СН2); 2,48 (т, 2Н, СН-СН2-СН2); 2,72-3,05 (6Н, ЗСН2); 3,69, 3,70, 3,73 и 3,75 (все б,12Н, 40СН3); 4,32 (т, 1Н, Г1Н-СН-СН2-СН2); 4,87 (т, ЗН, ЗСН); 5,67 (а, 1Н, 73 = 6.54 Гц, Вос-ГШ); 7,31 (а, 1Н, 73 = 8,72 Гц, ГШ); 7,74 (а, 1Н, 73 = 7,26 Гц, ГШ); 7,92 (а, 1Н, 73 = 7,26 Гц, ГШ). Найдено, %: С 48,87; Н 6,28; N 8,66. С^Н^О^. Вычислено, %: С 48,14; Н 6,22; N 8,64.
Гидрохлорид а-(диметил-К-аспарагинат)-7-бензил-1|-глутамата, [НС1 • НС1и(а-Б1)(7-ОВг1)]. Выход 98%. Тпл = 65-68 °С. Спектр ЯМР :Н (СБС13): 6, м. д.: 2,21-2,58 (2Н, СН-СН2-СН2); 2,76 (т, 2Н, СН-СН2-СН2); 2,99 (т, 2Н, СН2-СООСН3); 3,67 (в, 6Н, 2СН3); 4,52 (т, 1Н, КН-СН-(СН2)2); 4,94 (т, 1Н, СН-СН2-СООСН3); 5,12 (т, 2Н, СН2-С6Н5); 7,33 (5Н, СН2-С6Н5); 8,25-8,60 (4Н, КН3С1 и КН-СН-СН2).
Гидрохлорид а-(тeтpaмeтил-N3-acпapтoил-N1,1Ч2-диаспарагинат)-7-бензил -Ь-глутамата [НС1 • НС1и(а-Б2)(7-ОВ21)]. Выход 87%. Тпл = 93-95 °С. Спектр ЯМР :Н (СБС13): 6, м. д.: 2,36 (уш., 2Н, СН-СН2-СН2); 2,72 (уш., 2Н, СН-СН2-СН2); 2,80-3,11 (уш., 6Н, СН2); 3,64, 3,66, 3,70 и 3,72 (все б, 12Н, СН3); 4,52 (т, 1Н, КН-СН-(СН2)2); 4,84 и 4,94 (оба т, ЗН, СН); 5,10 (э, 2Н, СН2-С6Н5); 7,33 (5Н, СН2-С6Н5); 7,90, 8,05 и 8,56 (ЗН, ГШ); 8,33 (уш., ЗН, ГШ3С1).
Общая методика синтеза димеров. К раствору 3,5 ммоль НС1 • НС1и(а-В)(7-ОВ21) в 10 мл абсолютного этилацетата добавили 3,5 ммоль ТЭА и оставили при перемешивании на 1 ч. Затем образовавшуюся соль ТЭА отфильтровали, к фильтрату добавили раствор 3,33 ммоль К-Вос-С1и(а-Б)(7-СООН) в 10 мл этилацетата. К полученной смеси при перемешивании и охлаждении до -15 °С добавили по каплям раствор 3,66 ммоль ДЦГК в 6 мл этилацетата. Реакционную смесь выдержали 2 суток при -18 °С, затем 2 суток при 4 °С. При комнатной температуре ее перемешивали в течение 1 дня, затем обрабатывали по-разному в зависимости от растворимости продукта аналогично обработке мономеров.
^Вос-а,а'-бис(даметил-К-аспарагинат)-7'-бензил-глутамил-глутамат, [1Ч-Вос-С1и(а-Ох)-С1и(а-01)(7-ОВг1)]. Перекристаллизовали в смеси этилацетат/петролейный эфир. Выход 84 %. Тпл = 131-133 °С. Спектр ЯМР :Н (СБС13): 6, м. д.: 1,42 (э, 9Н, (СН3)3С); 1,99-2,68 (несколько т, 8Н, СН2-СН2); 2,76-3,15 (т, 4Н, СН2); 3,66, 3,73 и 3,74 (все б, 12Н, 2СН3); 4,03 (т, 1Н, ВОС-ГШ-СН); 4,51 (т, 1Н, СН-(СН2)2); 4,89 и 5,07 (оба т, 2Н, СН-СН2-СООСН3); 5,09-5,23 (сложный сигнал, ЗН, СН2-С6Н5 и ВОС-ГШ); 7,20 (а, 1Н, Р = 8,48 Гц, ГШ); 7,28-7,47 (сложный сигнал, 6Н, ГШ и СН2-С6Н5); 8,27 (а, 1Н, 73 = 6,94
Гц, N11). Найдено, %: С 53,95; Н 6,34; N 7,39. С34Н47^015. Вычислено, %: С 54,32; Н 6,30; N 7,45.
М-Вос-о^а'-би^тетраметил-Т^-аспартоил-М1, ]М2-диаспарагинат)-7'-бензил- глу-тамил-глутамат,^-Вос-С1и(а-02)-С1и(а-П2)(7-ОВг1)]. Поскольку вещество растворялось только в амидных растворителях, для удаления ДЦГМ выпавший продукт кипятили с избытком изопропанола. Выход 68 %. Т„„ = 194-196 °С. Спектр ЯМР *Н (БМ80-а6): 6, м. д.: 1,35 (б, 9Н, (СН3)3С); 1,73-2,88 (группа сигналов; 20Н, СН2); 3,59 и 3,61 (оба з, 24Н, СН3); 3,83 (т, 1Н, ВОС-№Н-СН); 4,28 (т, 1Н, СН-(СН2)2); 4,52-4,75 (6Н, СН); 5,03 (в, 2Н, СН2-СбН5); 6,64 (т, 1Н, ВОС^Н); 7,29 (5Н, СН2-С6Н5); 7,94-8,35 (несколько сигналов, 7Н, NH). Найдено, %: С 51,19; Н 6,15; N 8,48. C54H76N8026. Вычислено, %: С 51,16; Н 6,24; N 8,52.
]>1-Вос-а,а'-бис(диметил-]Ч-аспарагинат)-глутамил-глутаминовая кислота, []М-Вос-С1и(а-В1)-С1и(а-Б1)(7-СООН)]. Выход 93 %. Тпл = 66-70 °С. Спектр ЯМР *Н (СБСЦ): 5, м. д.: 1,43 (э, 9Н, (СН3)3С); 1,89-2,65 (8Н, СН2-СН2); 2,76-3,12 (4Н, СН2); 3,70, 3,75 и 3,77 (все э, 12Н, 4СН3); 4,14 (т, 1Н, ВОС^Н-СН); 4,68 (т, 1Н, СН-(СН2)2); 4,90 и 5,04 (оба т, 2Н, СН-СН2-СООСН3); 5,42 (а, 1Н, = 7,99 Гц, ВОСЧШ); 7,57-7,63 (2Н, 2КН); 8,45 (а, 1Н, = 7,99 Гц, N11). Найдено, %: С 49,16; Н 6,46; N 8,88. СгтШ^О^. Вычислено, %: С 49,01; Н 6,25; N 8,47.
М-Вос-с^а'-би^тетраметил-Г^-аспартоил-Г^1 ,Г^2-диаспарагинат)-глутамил-глу-таминовая кислота, []Ч-Вос-С1и(а-02)-С1и(а-02)(7-С00н)]. Гидрирование осуществляли в диметилсульфоксиде. Продукт выделяли, выливая смесь в диэтиловый эфир. Выход 91 %. Гпл = 217-218 °С. Спектр ЯМР (ОМБО-бв): 5, м. д.: 1,37 (з, 9Н, (СН3)3С); 1,67 и 1,79 (оба ш, 4Н, СН-СН2-СН2); 2,10-2,20 (т, 4Н, СН-СН2-СН2); 2,57-3,07 (12Н, СН2); 3,60 и 3,62 (оба э, 24Н, ОСН3); 3,85 (т, 1Н, ВОС^Н-СН); 4,23 (т, 1Н, СН-(СН2)2); 4,49-4,60 (6Н, СН); 6,90 (а, 1Н, 73 = 7,26 Гц, ВОС-ХН); 7,88-8,51 (7Н, №Н); 12,07 (1Н, СООН).
№Вос-а,а'-бис(диметил-ГЧ-аспарагинат)-7'-пентафторфенил-глутамил-глутамат, ^-Вос-С1и(а-Б1)-С1и(а-Б1)(7-ОР£р)]. К раствору 1,43 ммоль ^-Вос-С1и(а-Б0-О1и(а-01)(7-С00Н)] и 1,58 ммоль пентафторфенола в смеси 5 мл абсолютного этилацетата и 1 мл ДМФА при охлаждении до 0 °С добавили по каплям раствор 1,58 ммоль ДЦГК в 2 мл этилацетата. Перемешивали при охлаждении еще 2 ч, затем 1 ч при комнатной температуре. Смесь сконцентрировали, к выделенному осадку добавили 3 мл абс. хлороформа. Нерастворенную ДЦГМ отфильтровали, раствор сконцентрировали и несколько раз перекристаллизовали в смеси изопропанол : петролейный эфир. Выход 53%. Тпл = 126-128 °С. Спектр ЯМР :Н (СЯЭС1з): 5, М. Д.: 1,43 (в, 9Н, (СН3)3С); 1,86-2,48 (8Н, СН2-СН2); 2,76-3,15 (ш, 4Н, СН2); 3,67, 3,72 и 3,77 (все в, 12Н, 4СН3); 4,03 (т, 1Н, BOC-NH-CH); 4,55 (т, 1Н, СН-(СН2)2); 4,91 и 5,10 (оба т, 2Н, СН-СН2-СООСН3); 5,16 (т, 1Н, ВОСЧЧН); 7,11 (а, 1Н, = 8,35 Гц, 1МН); 7,52 (а, 1Н, 73 = 6,17 Гц, ГШ); 8,23 (а, 1Н, NH, 73 = 8,35 Гц). Найдено, %: С 47,79; Н 4,99; N 6,67. С33Н41^015Г5. Вычислено, %: С 47,83; Н 4,99; N 6,76.
К-Вос-а,а'-бис(тетраметил-К3^аспартоил-Н1, ]М2-диаспарагинат)-7'-пентафтор-фенил-глутамил-глутамат, []М-Вос-С1и(а-02)-С1и(а-П2)(7-ОРГр)]. К раствору 0,65 ммоль ^-Вос-С1и(а-В2)-С1и(а-В2)(7-СООН)] и 0,78 ммоль пентафторфенола в 4 мл ди-метилацетамида (ДМАА) при охлаждении до 0 °С и перемешивании добавили по каплям раствор 0,75 ммоль ДЦГК в 2 мл ДМАА. Перемешивали при охлаждении еще 4 ч, а затем при комнатной температуре 3 суток. Выпавшую ДЦГМ отфильтровали, фильтрат вылили по каплям в диэтиловый эфир. Осадок отфильтровали и перекристаллизовали несколько раз в смеси метанол : вода = 5:4. Выход 62 %. Т„л = 185-187 "С. Спектр ЯМР :Н (БМ80-а6): 5, м. д.: 1,35 (б, 9Н, (СН3)3С); 1,60-2,86 (группа сигналов; 20Н, СН2); 3,59 и 3,61 (оба э, 24Н, СН3); 3,86 (т, 1Н, ВОСЧЧН-СН); 4,35 (т, 1Н, СН-(СН2)2); 4,50-4,68 (6Н, СН); 6,91 (т, 1Н, ВОС^Н); 7,97-8,48 (несколько сигналов, 7Н, ГШ). Найдено, %: С 46,92; Н 5,21; N 8,26. С53Нб9^024Г5. Вычислено, %: С 47,32; Н 5,17; N 8,33.
Гидрохлорид а,а/-бис(диметил-]М~аспарагинат)-7'-пентафторфенил-глутамил-глутамата, [НС1 ■ НС1и(а-Б1)-С1и(а-В1 )(7-ОР£р)]. Выход 92 %. Тпл =80-83 "С. Спектр
ЯМР *Н (СБСЬ): М. д.: 2,03-3,25 (12Н, СН2); 3,69 и 3,75 (оба з, 12Н, 2СН3); 4,27 (т, 1Н, ВОС-Ш-СН); 4,71 (т, 1Н, СН-(СН2)2); 4,88 и 4,99 (оба т, 2Н, СН-СН2-СООСН3); 8,02 (уш., 2Н, ГШ); 8,35 (уш., ЗН, ГШ3С1); 8,85 (уш., 1Н, N4).
Гидрохлорид с^а'-бис^етраметил-К^аспартоил-Г^1 ,№-диаспаргинат)-7'-пента-фторфенил-глутамил-глутамата, [НС1 • НС1и(а-02)-С1и(а-В2)(7-ОРф)]. Выход 50 %. Тпл = 225-228 °С с разложением. Спектр ЯМР ХН (БМ80-а6): 6, м. д.: 1,42-2,38 (8Н, СН2-СН2); 2,53-2,88 (12Н, СН2); 3,57, 3,59 и 6,03 (все в, 24Н, ОСН3); 3,74 (ш, 1Н, В О С-ГШ-С Н); 4,39 (т, 1Н, СН-(СН2)2); 4,50-4,72 (6Н, СН); 8,10-8,70 (ЮН, ГШ).
Поликонденсация — общая методика синтеза 7-полимеров. Тщательно очищенные от примесей димеры сушили от следов влаги в эксикаторе над Р2Ог. Все растворители перегнали, чистоту контролировали по показателю преломления. Для предотвращения попадания влаги и возможного гидролиза пентафторфениловых эфиров реакцию проводили в атмосфере Аг. К раствору димера при 60 °С добавили, интенсивно перемешивая, раствор ТЭА (20 % изб.) в том же растворителе и оставили, не прекращая перемешивание и нагрев, на 24 (48) ч. При проведении реакции с постепенным разбавлением раствора в течение первых часов добавляли с интервалом 20-30 мин небольшие порции растворителя, поддерживая гомогенность раствора. Через 12 ч во всех случаях большая часть полимера выпадала из раствора. После завершения реакции смесь охладили и добавили 10-кратный избыток метанола. Через 1 ч тщательно'растертый осадок (высокомолекулярная фракция - ВМ) отфильтровали. Фильтрат вылили по каплям в большое количество диэтилового эфира, и еще через 3 ч отфильтровали выпавший осадок (низкомолекулярная фракция - НМ). Обе фракции тщательно промыли эфиром и высушили.
Н-[С1и(а-01)]тг-(7-ОРГр). Выход ВМ-фракции составил, в зависимости от конкретных условий, от 50 до 80 %. Тпл = 260 °С (с разложением). Выход НМ-фракции - от 3 до 46 %. Тпл = 170-190 °С. Спектр ЯМР гН (ВМ-фракция) (СБС13 + ТФУК): 5, м. д.: 2,00-3,24 (6Н, СН2); 3,76 и 3,81 (оба з, 6Н, 20СН3); 4,54 (т, 1Н, СН-(СН2)2); 5,02 (т, 1Н, СН); 7,83 (га, 1Н, ГШ); 8,17 (т, 1Н, ГШ). Примечание: все сигналы, кроме протонов СН3 групп, уширены. Найдено (образец № 3), %: С 48,27; Н 5,70; N 10,00. СпН^гОб (мономерное звено). Вычислено, %: С 48,53; Н 5,92; N 10,29.
Н-[С1и(а-02)]п-(7-ОРГр). Выход ВМ-фракции 67 %. Тпл = 250 °С (с разл.). Выход НМ-фракции 9 %. Тпл = 140-160 °С. Спектр ЯМР :Н (ВМ-фракция) (СБС13 + ТФУК): 5, м. д.: 1,90-3,25 (ЮН, СН2); 3,77 и 3,83 (оба 8> 12Н, 40СН3); 4,40-5,15 (4Н, СН); 7,55-8,30 (4Н, ГШ). Примечание: все сигналы уширены. Найдено (ВМ-фракция), %: С 45,36; Н 5,52; N 9,97. С21Н30К4О12 (мономерное звено). Вычислено, %: С 47,55; Н 5,57; N 10,56.
Методика оценки степени поликонденсации по УФ-спектрам. Предварительно в смеси хлороформ : ТФУК = 3:1 был снят спектр модельного соединения - димера, содержащего пентафторфенильный фрагмент. Значение молярной экстинкции на длине волны 250 нм, соответствующей полосе поглощения пентафторфенильного фрагмента, составило 470 л/моль-см. Калибровочные спектры показали, что для данного соединения закон Бугера-Ламберта-Бера выполняется в широком интервале концентраций. Исследуемые полимеры были тщательно отмыты абсолютным диэтиловым эфиром от следов пентафторфенола. Сред-нечисленную молекулярную массу (М„) рассчитывали по формуле
Мп = ш ■ е ■ I / С- К- Д
где т - масса навески (мг); С- концентрация раствора (ммоль/мл); е - молярная экстинкция; V - объем раствора (мл); I - длина кюветы (см); О - оптическая плотность. Соответствующее значение среднечисленной степени полимеризации рассчитывали по формулам п = (Мп -184) / 272 для полимеров с Б1 и п = (Мп - 184) / 531 для полимеров с Б2, где п - число элементарных повторяющихся звеньев, молекулярная масса элементарного повторяющегося звена равна 272 (Бг) или 531 (Б2) г/моль, суммарная масса концевых групп - 184 г/моль.
Гидролиз сложноэфирных групп дендронов 7-полимера. К 0,5 г (1,84 ммоль) полимера (образец № 4) добавили 50 мл концентрированного раствора гидроксида бария. Смесь
нагревали до 50 °С и перемешивали в течение 30 мин. Образовавшиеся соли бария отфильтровали, тщательно промыли горячей водой, высушили, взвесили: тп0садка = 0,64 г (1,81 ммоль). К осадку прибавили 38 мл 0,048 М H2SO4. Перемешивали в течение дня и оставили на ночь. Образовавшийся осадок сульфата бария отцентрифугировали. Из раствора гидролизованно-го полимера испарили воду, полимер сушили до постоянного веса. Выход: 0,430 г (96 %). fo]o?4°M Naci = 0,06 дл/г. Спектр ЯМР *Н (D2O): 6, м. д.: 1,70-2,15 (2Н, СН2); 2,18-2,51 (2Н, СНа); 2,72-2,98 (2Н, СН2); 3,59 и 3,64 (оба s, остаточные 20СН3); 4,10-4,34 (1Н, СН); 4,45-5,20 (1Н, СН); 8,20 (1Н, NH); 8,42 (1Н, NH). Спектр показал наличие 4% остаточных метальных групп. Все сигналы, кроме остаточных ОСНз, уширены. Найдено, %: С 44,30; Н 4,95; N 11,44. C9H12N2O6 (мономерное звено). Вычислено, %: С 44,27; Н 4,95; N 11,47.
Summary
Alyabjeva V. P., Girbasova N. V., Bilibin A. Y. Synthesis and investigation of a poly-7-glutamic acid with amino acid dendrons in side chain.
The oligomers of a poly-7-glutamic acid with dendrons in side chain on the basis of L-aspartic acid axe obtained by polycondensation of dendronized dimers. The hydrolysis of terminal methoxy-carbonyl groups of polymers with the first generation dendrons is accomplished and water soluble anionic polyelectrolyte is obtained. It is determined that such polymers take coil conformation independently of medium's pH.
Литература
1. Zistler A., Koch S., Schluter A. D. // J. Chem Soc., Perkin Trans. 1999. Vol. 1. P. 501-508. 2. Cloninger M. J. // Current Opnion in Chemical Biology. 2002. Vol. 6. P. 742-748. 3. Deng H. Т., Xu Z.-K., Wu J. et al. // J. of Molecular Catalysis. B: Ensymatic. 2004. Vol. 28. P. 95-100. 4. Nigemann M., Ritter H. // Acta. Polymer. 1996. Vol. 47. P. 351-356. 5. Liibbert A., Nguyen T. Q., Sun F. et al. // Macromolecules. 2005. Vol. 38, N 6. P. 2064-2071. 6. Sanda F., Terada K., Masuda T. // Ibid. N 20. P. 8149-8154. 7. Гирбасова H. В., Мигунова И. И., Распопова И. Р., Билибин А. Ю. // Высокомолек. соединения. Сер. А. 2003. Т. 45, № 4. С. 550-561. 8. Егорова Г. Г., Саратовский С. В., Мухина И. В. и др. // Высокомолек. соединения. Сер. А. 2004. Т. 46, № 2. С. 197-206. 9. Bilibin А. У., Moukhina I. V., Egorova G. G., Girbasova N. V. // Macromolecular Chem. Phys. 2004. Vol. 205. P. 1660-1666. 10. Bilibin A., Zorin I., Girbasova N. et al. // Macromolecular Symposia. 2003. Vol. 199. P. 197-208. 11. Бушин С. В., Гирбасова Н. В., Беляева Е. В. и др. // Высокомолек. соединения. Сер. А. 2002. Т. 44, № 6. С. 632-638. 12. Цветков Н. В., Иванова В. О., Ксенофонтов И. В. и др. // Высокомолек. соединения. Сер. А. 2003. Т. 45, № 2. С. 253-261. 13. Бушин С. В., Цветков Н. В., Андреева Л. Н. и др. // Высокомолек. соединения. Сер. А. 2005. Т. 47, № 2. С. 315-324. 14. Андреева Л. Н., Беляева Е. В., Бушин С. В. и др. // Там же. № 8. С. 1516-1527. 15. Girbasova N., Aseyev V., Saratoysky S. et al. // Macromol. Chem. Phys. 2003. Vol. 204, N 18. P. 2258-2264. 16. Yu M., Novak A. P., Deming T. J. // J. Amer. Chem. Soc. 1999. Vol. 121. P. 12210-12211. 17. Birrer G. A., Cromwick A.-M., Gross R. A. // Intern. J. of Biol. Macromolecules. 1994. Vol. 16. P. 265-275. 18. Sanda F., Fujiyama Т., Endo T. II Macromol. Chem. Phys. 2002. Vol. 203. P. 727-734. 19. Sanda F., Fujiyama Т., Endo T. 11 J. of Polim. Science. Pt A. 2001. Vol. 39. P. 732-741. 20. Соколов H. С. Основы синтеза полимеров методом поликонденсации. М., 1987. 21. Percec V., Ahn С. Н., Ungar G. et al. // Nature. 1998. Vol. 391. P. 161-164. 22. Shu L., Schluter A. D. // Macromol. Chem. Phys. 2000. Vol. 201. P. 239-245. 23. Rao S. P., Miller W. G. // Biopolymers. 1973. Vol. 12. P. 835-843. 24. Morcellet M., Loucheux CI // Biopolymers. 1976. Vol. 15. P. 1857-1862. 25. Schiffer D. K., Holtzer A. 11 Biopolymers. 1974. Vol. 13. P. 853-856. 26. Hawkins R. В., Holtzer A. // Macromolecules. 1972. Vol. 5. P. 294-301. 27. Bychkova V. E., Ptitsyn О. В., Barskaya Т. V. 11 Biopolymers. 1971. Vol. 10. P. 2161-2179. 28. Zanuy D., Aleman C. // Biopolymers. 1999. Vol. 49. P. 497-504. 29. Block H. Poly(7-benzyl-L-glutamate) and other glutamic acid containing
polymers. Glasgow, 1983. 30. Nemethy G., Steinberg I. Z., Scheraga H. A. // Biopolymers. 1963. Vol. 1. P. 43-69. 31. Форд P., Гордон А. Спутник химика. Физико-химические свойства, методики, библиография / Пер. с англ. М., 1976. 32. Позднее В. Ф. // Биоорг. химия. 1977. № 12. С. 1605-1610. 33. Гершкович А. А., Кибирев В. К. Основы пептидного синтеза. Реагенты и методы. Киев, 1987. 34. Doty P., Bradpury J. Н., Holtzer А. М. // JACS. 1956. Vol. 78. Р. 947-956.
Статья поступила в редакцию 26 декабря 2005 г.
