CC BY
136
Экспериментальная биология и медицина УДК 616.833-006.38.03
ПОЛУЧЕНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ ДЛЯ МОДЕЛИРОВАНИЯ НЕЙРОФИБРОМАТОЗА II ТИПА
© Степанова Д.С., Миронов А.Ю.
Кафедра молекулярной биологии Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова,
Москва;
кафедра микробиологии, вирусологии, иммунологии Первого Московского государственного медицинского университета им. И.М. Сеченова, Москва
E-mail: profmironov@,mmascience.ru
Получены и охарактеризованы стабильные изогенные клеточные линии MEF NF2- - и MEF NF2 flox/flox, из которых MEF NF2- - моделирует НФ II in vitro, а MEF NF2++ является контрольной линией. Проведённая сравнительная характеристика данных линий показала, что MEF NF2"" более жизнеспособны: быстрее растут, легче распластываются, более устойчивы к повреждающим воздействиям, но не обладают туморогенностью. Для моделирования НФ II in vivo получена линия NIH 3T3 NF2ABB puro, вызывающая быстрый рост опухолей при введении под кожу. Получение данных клеточных линий сделало возможным целенаправленный поиск эффективной и необременительной для пациента терапии НФ II.
Ключевые слова: микробная экология, ЛПУ, гнойная хирургия.
GENERATION OF CELL LINES FOR MODELING NEUROFIBROMATOSIS TYPE TWO
Stepanova D.S., MironovA.Yu.
Department of Molecular Biology of N.I. Pirogov Russian National Research Medical University, Moscow;
Microbiology, Virology, Immunology Department of I.M. Sechenov First Moscow State Medical University, Moscow
We created and characterized two isogenic cell lines MEF NF2-/- и MEF NF2 flox/flox, of which MEF NF2-/- is an in vitro model for neurofibromatosis II, and MEF NF2flox/flox is a control cell line. Comparison of these lines has shown that MEF NF2" /- grow faster, are more easily attached to culture plates, are more resistant to damaging impacts such as starvation, but are not tumorigenic. To make an in vivo model of neurofibromatosis II we generated another cell line, NIH 3T3 NF2ABB puro, which promotes the rapid tumor progression when injected subcutaneously. Generation of these cell lines makes possible a targeted search for an effective pharmaceutical therapy for neurofibromatosis II.
Keywords: cell lines, neurofibromatosis II.
Нейрофиброматоз II типа (НФ II) — аутосом-но-доминантное наследственное заболевание, характеризующееся образованием множественных доброкачественных опухолей, преимущественно шванном и менингиом, локализующихся в ЦНС и по ходу периферических нервов [5]. Несмотря на доброкачественную природу новообразований, заболевание часто приводит к летальному исходу вследствие формирования внутричерепных неоперабельных опухолей, нарушающих функции мозга. Медикаментозного лечения этой болезни не существует. Пациенты вынуждены подвергаться многократным хирургическим вмешательствам по удалению опухолей, что рано или поздно приводит к глухоте и слепоте.
Заболевание связано с повреждением гена п£2. С мутациями в п£2 связано как образование спорадических шванном и менингиом по всему организму, так и развитие опухолей, на первый взгляд не связанных с НФ II, например, злокачественных мезотелиом [2, 3, 9, 12, 13, 14]. N£2 проявляет себя как онкосупрессор, для его инактивации необходимо выключение обоих аллелей [1]. Это пред-
положение сделано после исследований, показавших, что пациенты с НФ II гетерозиготны по п£2, а в клетках опухолей, развивающихся у этих пациентов, обнаруживается биаллельное выключение п£2.
Продукт гена п£2 - мерлин - гомологичен белкам эзрин-радиксин-моэзинового семейства, отвечающим за взаимодействие компонентов цитоскелета и клеточной мембраны [4, 7].В норме мерлин регулирует пролиферацию и обусловленное актином движение клетки. Клетки, утратившие ген п£2, неспособны образовывать стабильные клеточные контакты. Клетки, нокаутные по гену п£2, не испытывают контактного торможения клеточного роста [6, 10]. Оверэкспрессия мерлина приводит к угнетению пролиферации [8, 15].
В последнее время в исследованиях часто используются методы химического и генетического скрининга, позволяющие относительно быстро выявить ряд потенциальных эффекторов исследуемого белка, а также возможные мишени для терапии изучаемого генетического заболевания.
Имея клеточную модель НФ II, можно осуществить подобный скрининг.
Цель работы — получение стабильной клеточной линии дефектной по гену nf2 для моделирования НФ II и последующего изучения генетических взаимодействий nf2 и поиска терапии заболевания. Существующая модель НФ II in vivo (гетерозиготная по гену nf2 мышь) требует длительной подготовки эксперимента, поскольку развитие опухолей у мышей начинается только в шестимесячном возрасте. Целесообразной представляется и разработка ксенографтной модели НФ II.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Мышиные эмбриональные фибробласты (MEF и NIH ЗТЗ) и пакующие клетки PhoenixEco (Ф-есо) высевали на 10 см плашки, культуральная среда — DMEM (Dulbecco’s ModifiedEagle’s Ме-dium) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) до 10%, глутамина, пирувата натрия и смеси заменимых аминокислот. Клетки пассировали через каждые 48 час (1:10), так, чтобы плотность посадки составляла 100 тыс. кл. в мл (1 млн. кл. на плашку). После 15 пассажей клетки заменяли, размораживая новую аликвоту.
Для определения устойчивости к истощению среды и тестированию биоактивных веществ MEF высевали в 96-луночные плашки в концентрации 100 тыс. кл. на мл, т.е. 10 тыс. кл. на лунку. Для построения кривых роста клетки высевали в 96-луночные плашки в концентрации 10 тыс.кл. на мл, т.е. 1 тыс. кл. на лунку. Для генотипирования и вестерн-блоттинга клетки высевали в
12-луночные плашки в концентрации 100 тыс.кл. на мл, т.е. 200 тыс. кл. на лунку.
Трансфекции проводились с помощью
LipoFectAminePlus (Invitrogene, США) в стерильных условиях согласно протоколу, рекомендованному фирмой-производителем. Клетки высевали на 10 см чашки с таким расчётом, чтобы через 20 час после посадки плотность слоя составляла 60% (1 млн. клеток на чашку). По достижении нужной плотности осуществляли трансфекцию, использую 4 мкг ДНК на чашку.
Первичные мышиные эмбриональные фиб-робласты (MEF), несущие флокс-аллель в гене nf2 (MEF NF2flox/flox), любезно предоставлены д-ром Марко Джованнини (CEPH et Institut Universitaired’Hematologie, Paris, France). Флокс-аллель — небольшая (19 п. осн.) последовательность, встраиваемая в ген при помощи клонирования или направленного мутагенеза и обеспечивающая сайт посадки для Cre-рекомбиназы, фер-
мента, рекомбинантно удаляющего участок гена, ограниченный двумя флокс-аллелями.
Клетки иммортализовали, трансфецировав их большим Т-антигеном вируса SV40 в лентиви-русном векторе. Иммортализованные MEF
NF2flox/flox трансфецировали pMSCV-Cre-GFP.
pMSCV-Cre-GFP —плазмида на базе ретровирусного вектора MSCV, несущая Cre-рекомбиназу и зелёный флуоресцентный белок (greenfluores-centprotein, GFP). Через 48 часов после трансфекции на проточном цитофлуориметре (Becton Dickinson FACS-VantageSE flow cytometer) отобрали флуоресцентные клетки. Через 2 недели трансфекцию и цитофлуориметрию повторяли. Клетки генотипировали методом ПЦР.
Вторая пара линий получена из клеток NIH 3T3 из коллекции ATCC (CRL-1658™)пyтём вирусной индукции в этих клетках доминантнонегативной формы мерлина.Мутантная форма мерлина, возникшая в результате делеции в гене п£2 и утраты белком региона BlueBox (NF2ABB), обладает сильными аутоингибиторными свойствами и приводит к функциональной утрате мерлина, т. е., к появлению фенотипа nf2-null. NIH ЗТЗ заражались ретровирусом Babe, несущим NF2ABB и ген устойчивости к пуромицину. В качестве контроля использовался вирус Babe-puro. Селекцию пуромицином (8 мкг/мл) начинали через семь дней после заражения и проводили в течение двух недель. Выжившие клетки считали NF2BB-положительными.
Для выделения геномной ДНК клетки высевали в 12-луночные плашки в концентрации 100 тыс. кл. на мл, т.е. 200 тыс. кл. на лунку. Через 24 часа, по достижении суперплотного слоя, клетки лизировали, добавляя по 500 мкл лизирующего буфера и 5 мкл протеиназы К (20 мкг/мл) в каждую лунку. Клетки инкубировали в буфере при 550С в течение 16 час. К концу инкубации слой клеток полностью растворялся. Лизат из каждой лунки переносили в отдельную пробирку типа Eppendorf на 1,5 мл и добавляли по 500 мкл уравновешенного фенола. Содержимое пробирок перемешивали на «Вортексе» в течение 1 мин и оставляли на 5 мин при комнатной температуре. После разделения фаз отбирали 200 мкл из верхнего слоя (раствора ДНК в феноле).
Для ПЦР использованы следующие праймеры: P4 (5’-CTTCCCAGACAAGCAGGGTTC-3’) и P5 (5’ -GAAGGCAGCTTCCTTAAGTC-3’) — для определения аллелей NF2flox (442 bp) и NF2+ (305 п. осн.); P6 (5’ -CCTCTATTTGAG TGCGTGCCATG-3’) и Р5 — для определения аллеля NF2A (338 п. осн.).
Состав ПЦР-реакции:
100 мМ сульфат аммония — 1 мкл
10 мМ сульфат магния — 1 мкл
2 мМ смесь дНТФ— 1 мкл БСА (2 мг/мл) — 0,5 мкл Праймеры (15 мкМ) — по 0,5 мкл каждого Буфер для Taq-полимеразы (ThermoPol, Bi-olabslnc., США) — 0,9 мкл
Выделенная геномная ДНК — 2 мкл Taq-полимераза (ThermoPol, Biolabslnc., США) — 0,1 мкл
ddH2O— до 10 мкл
Реакция проводилась в стеклянных капиллярах на приборе 1605 Air ThermoCycler (Idaho Technologies) при следующих условиях:
Т 940С 10''
А денатурации -Lvy
Тотжига 620С, 1'' 50 циклов
Т 720С
элонгации
30''
ПостПЦР 720С, 2'
Для упаковки ретровируса использованы пакующие клетки РЬоешхЕсо1хорю(Л-есо). Пакующие клетки трансфецировали плазмидамир ВАВЕ-ЫР2дВВ-риго или рВАВЕ-риго с помощью Ыро£ес1атте-Р1ш. Через 24 часа после трансфекции среду меняли на свежую, затем каждые 6 часов собирали вирус. Перед заражением вирус разводили культуральной средой в два раза, фильтровали через полиэтиленфталатный фильтр с порами 0,2 мкм и добавляли 4мкг/мл Ро1уЬгеие (С1ои1есЬ, США). Полученную смесь использовали в качестве культуральной среды для клеток-мишеней.
Для сравнения кривых роста и устойчивости к истощению среды МеБ ОТ2+/+ и МЕБ ОТ2_/" клетки высевали на 96-луночные плашки, плотность посадки 1 тыс. кл. на лунку. При построении кривых роста смену среды и измерения производили каждый день, при сравнении устойчивости одномоментно проводили считывание только с одного ряда лунок (на 4-й, 5-й день и т. д.) без предварительной смены среды.
Пролиферацию и выживаемость клеток оценивали с помощью набора Premixed WST-1 CeПProHferatюnReagent (С1опТеЛ, США) по образованию солей тетразолия согласно протоколу, рекомендованному фирмой-производителем. В каждую лунку добавляли 10 мл (1/10 культурального объёма) WST-1 и инкубировали плашку в обычных условиях (370С, 5%С02, влажность) в течение 4 часов, затем перемешивали на шейкере 1 мин и измеряли оптическую плотность. Результаты вычисляли как разность OD440 (поглощение продукта расщепления WST-1) и OD600 (фоновое поглощение).
Для вестерн-блоттинга клеточные культуры лизировали в буфере Роберта (1% Р-40, 10% глицерин, 20 мMTris, pH 8,0, 137 мМ №С1, 50 мМ №Б, 10 мМ глицерол-фосфат,10 мМ фенилметил-сульфонил-фторид, апротинин 10 цг/мл, 10 м мортованадат натрия). Равные количества (20 мкг) белка загружали в градиентный 4-20%
Tris-HCl разрешающий гель (BioRad Ready Gel), разделяли электрофорезом и переносили на поли-винилидин-фторидную мембрану (Immobilon Millipore). Блот блокировали в забивке (10% БСА, TBS-T) в течение как минимум одного часа при комнатной температуре и наносили антитела на ночь при +40C, затем промывали 4 раза в TBS-T и наносили антиглобулиновую сыворотку на 30 мин при комнатной температуре. После трёх отмывок в TBS-T блоты проявляли хемилюминес-центными реагентами (диоксиэтан, «CDP-Star», Perkin-ElmerLifeScience). Использованы мо-ноклональныеа-МегНп (Abeam) и a-(3Actin
(SantaCruz) антитела. Антиглобулиновая сыворотка— меченые щелочной фосфатазой козьи антитела против кроличьих и мышиных иммуноглобулинов.
Эксперименты на животных производились в соответствии с правилами IACUC, исходя из принципа «минимум стресса и болезненных процедур». Для исследования брали 10 взрослых атимических мышей. В первый день исследования всем мышам подкожно вводили по 1 млн. клеток NIH ЗТЗ NF2ABB в бескальциевом изотоническом PBS. Измерения опухолей начинали на 7-й день эксперимента и проводили каждые 3 дня. При достижении опухолью объёма 20% тела животного, мышь усыпляли диэтиловым эфиром, опухоль извлекали и отправляли на гистологическое исследование.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
MEF иммортализировали и обрабатывали Cre-рекомбиназой; клетки генотипировали с целью убедиться, что в искомой клеточной линии действительно достигнут нокаут гена nf2.
Поставлены реакции: с праймерами Р4 и Р5 — для определения аллелей nf2flox (442 bp) и nf2wt (305 п. осн.); с праймерами Р5 и Р6 — для определения аллеля п£2Д (338 п. осн.). При анализе электрофореза продуктов ПЦР в 1% агарозном геле должны быть видны следующие полоски (табл. 1).
Полученная картина почти полностью соответствует ожидаемой, но в реакции с праймерами Р4 и Р5 детектируется остаточная полоска nf2^lox-аллеля в геномной ДНК клеток, обработанных Cre-рекомбиназой (рис. 1).
В популяции nf2-/- клеток могло остаться некоторое количество неотсортированных клеток, в которые не попала Cre-рекомбиназа, или же ре-комбиназа могла сработать не во всех клетках. Однако сигнал достаточно слаб, к тому же ожидается, что nf2-/- клетки растут быстрее, чем нормальные, и рано или поздно вытеснят nf2f/f клет-
Таблица 1
Распределение продуктов генотипирования при электрофорезе в агарозном геле
Р4+Р5 Р5+Р6
ДНК дикого типа 305 п. осн. —
^2£1ох, не обработанная Сге 442 п. осн. —
ОТ2Л (ОТ2йох, обработанная Сге) — 338 п. осн.
Рис. 1. Распределение продуктов ПЦР при электрофорезе в агарозном геле.
Рис. 2. Экспрессия мерлина в линиях МБРКР2"" и МЕБОТ^.
ки, поэтому решено считать полученную линию гомогенной п£2-отрицательной. Нокаут гена п£2 удалось подтвердить и с помощью вестерн-блоттинга (рис. 2).
Наиболее существенным и очевидным изменением, наступающим в результате утраты гена п£2, является прекращение контактного торможения роста [7, 8]. Гипотетические кривые роста имеют следующий вид (рис. 3).
Однако построенные кривые роста для MEFNF2"/" и MEFNF2£1ox/£1ox в 6-луночных плашках отличались от гипотетических (рис. 4).
Оба типа клеток растут экспоненциально и не проявляют контактного торможения роста. Воз-
можно, это связано с тем, что при иммортализа-ции MEF в этих клетках был поврежден ген р53, поскольку существует кооперация между р53 и п£2 [6, 7]. Очевидно, что п£2"" клетки растут гораздо быстрее, чем контрольные клетки. Другим очевидным различием п£2"" и п£2£1ох/£1(Жклеток является их внешний вид и способность к распластыванию (рис. 5): п£2""клетки выглядят более распластанными, с большим числом отростков. Клетки наползают друг на друга, образуя многослойные структуры, в то время как контрольные клетки стремятся образовать монослой. Наблюдается меньше нежизнеспособных всплывших кле-
->Аох/£1ох
ток,
чем
плашках
п£2и
Ш2-*-
Время
Рис. 3. Гипотетические кривые роста КР2-/- и КР2+/+ клеток.
а) КР2-/-: клетки растут экспоненциально в течение длительного времени. б) КР2+/+: по достижении конфлуэнтности клетки перестают делиться и выходят на плато.
900000
800000
* 700000 О
о
С 600000
со
500000
н
0 ф
1 400000 С
* 300000
200000
100000
0
^2-/-
и^Аох/Аох
время (дни)
Рис. 4. Кривая роста МЕР№2-/- и МЕРКР2йох/йох на 6-луночной плашке.
4
5
Рис. 5. Световая микроскопия МЕР№2-/- и МЕРКР2йох/йох. а) - МЕРОТ2-/-; б) - МЕРОТ2йох/:Е|ох
клетками. Замечено, что MEFNF2-/- быстрее прикрепляются к субстрату и распластываются. Прикрепившиеся и распластанные nf2-/- клетки обнаруживались на плашке уже через 15-20 минут после пассирования. MEFNF2- - проявили себя более устойчивыми к истощению в бессывороточной среде (рис. 6).
Полученная клеточная линия MEFNF2-- моделирует НФ II in vitro. Однако подкожное введение этих клеток мышам не ведёт к развитию опухолей. Потребовалось получить другую пару ли-
ний для использования в ксенографитных моделях.
Клеточные линии КІН ЗТЗ ОТ2ЛВВ и Ы1Н 3T3 puro получены с помощью вирусной индукции доминантно-негативной формы мерлина. NIH 3T3 NF2ABBpuro вели себя аналогично MEFNF 2" ": не обнаруживали контактного торможения роста, росли гораздо быстрее контрольной линии NШ 3Т3 риго, проявляли большую устойчивость к истощению среды. В отличие от МЕКЧР2 №Н ЗТЗ ОТ2ЛВВ обладают выраженной тумороген-ностью (рис. 7).
3,000
Рис. 6. Устойчивость к истощению в бессывороточной среде.
Рис. 7. Туморогенность клеточной линии NIH ЗТЗ NF2ABB.
Получены и охарактеризованы стабильные изогенные клеточные линии MEFNF2-/- и MEFNF2flox/flox, из которых MEFNF2-/- моделирует
НФ IIinvitro, а MEFNF2++ является контрольной линией. Проведённая сравнительная характеристика данных линий показала, что MEFNF2"" более жизнеспособны: быстрее растут, легче распластываются, более устойчивы к повреждающим воздействиям, но не обладают туморогенностью. Для моделирования НФ II in vivo получена линия NIH ЗТЗ NF2ABBpuro, вызывающая быстрый рост опухолей при введении под кожу. Получение данных клеточных линий сделало возможным целенаправленный поиск эффективной и необременительной для пациента терапии НФ II.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ahronowitzet I. et al. Mutational spectrum of the NF2 gene: a meta-analysis of 12 years of research and diagnostic laboratory findings // Hum. Mutat. - 2007. -N 28. - Р. 1-12.
2. Berghmans S., Murphey R.D., Wienholdset E. et al. tp53 mutant zebrafish develop malignant peripheral nerve sheath tumors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2005. - N 102 (2). - Р. 407-412.
3. Bianchi A.B. et al. Mutations in transcript isoforms of the neurofibromatosis 2 gene in multiple human tumour types // Nat. Genet. - 1994. - N б. - Р. 185-192.
4. Bretscheretl A. ERM proteins and merlin: integrators at the cell cortex // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. - 2002. -N 3. - Р. 58б-599.
5. Cheng J. Q. Frequent mutations of NF2 and allelic loss from chromosome band 22q12 in malignant mesothelioma: evidence for a two-hit mechanism of NF2 inactivation // Genes Chromosomes Cancer. - 1999. - N 24. - Р. 238-242.
6. McClatchey A.I. Membrane organization and tumor-igenesis - the NF2 tumor suppressor, Merlin // Genes Dev. - 2005. - N 19. - P. 2265-2277.
7. McClatchey A.I., Saotome I., Mercer K. et al. Mice heterozygous for a mutation at the Nf2 tumor suppressor locus develop a range of highly metastatic tumors // Genes Dev. - 1998. - N 12. - P. 1121-1133.
8. Morrison H. et al. The NF2 tumor suppressor gene product, merlin, mediates contact inhibition of growth through interactions with CD44 // Genes Dev. -2001. - N 15. - P. 968-980.
9. Kalamarideset M. Nf2 gene inactivation in arachnoidal cells is rate-limiting for meningioma development in the mouse // Genes Dev. - 2002. - N 16. -P. 1060-1065.
10. Lallemandet D. NF2 deficiency promotes tumori genesis and metastasis by destabilizing adherens junctions // Genes Dev. - N 17. - P. 112-116.
11. Lasotaet J. The neurofibromatosis type 2 gene is mutated in perineural cell tumors: a molecular genetic study of eight cases // Am. J. Pathol. - 2001. -N 158. - P. 1223-1229.
12. Pineau P., Marchio A., Nagamoriet S. et al. Homozygous deletion scanning in hepatobiliary tumor cell lines reveals alternative pathways for liver carcinogenesis // Hepatology. - 2003. - N37. - P. 852-861.
13. Robanus-Maandag E., Giovannini M., van der Valket et al M. Synergy of Nf2 and p53 mutations in development of malignant tumours of neural crest origin // Oncogene. - 2004. - N 23. - P. 6541-6547.
14. Sheikh H.A., Tometsko M., Niehouse L. et al. Molecular genotyping of medullary thyroid carcinoma can predict tumor recurrence // Am. J. Surg. Pathol. -2004. - N 28. - P. 101-106.
15. Xiao G.H., Gallagher R., Shetleret J. et al. The NF2 tumor suppressor gene product, merlin, inhibits cell proliferation and cell cycle progression by repressing cyclin D1 expression // Mol. Cell Biol. - 2005. -N 25. - P. 2384-2394.
