Использование методов редактирования генома для создания изогенных клеточных линий, моделирующих болезнь Хантингтона in vitro Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

использование методов редактирования генома

для создания изогенных клеточных линий, моделирующих

болезнь хантингтона in vitro

А.А. Малахова 12■3, М.А. Сорокин12■3, А.Е. Сорокина 12■3, Т.Б. Маланханова 12■34, Н.А. Мазурок12■3, С.П. Медведев 12■3 4, С.М. Закиян12■3

1 ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики СО РАН», Новосибирск, Россия

2 ФГБНУ «Институтхимической биологии и фундаментальной медицины СО РАН», Новосибирск, Россия

3 ФГБУ «Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения имени академика Е.Н. Мешалкина» Министерства здравоохранения РФ, Новосибирск, Россия

4 Новосибирский национальный исследовательский государственный университет, Новосибирск, Россия

Genome editing approach for generation of isogenic cell lines modelling Huntington's disease in vitro

AA. Malakhova 123, M.A. Sorokin 123, A.E. Sorokina 12■3, T.B. Malankhanova 12■34, N.A. Mazurok 123, S.P. Medvedev12,3 4, S.M. Zakian 12,3

1 Federal Research Center Institute of Cytology and Genetics, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia

2 Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine, the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, Novosibirsk, Russia

3 State Research Institute of Circulation Pathology, Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Novosibirsk, Russia

4 National Research University Novosibirsk State University, Novosibirsk, Russia

Болезнь Хантингтона — это аутосомно-доминантное нейродегенеративное заболевание, обусловленное мутацией экспансии тринуклеотидных повторов в первом экзоне гена НТТ. Нейродегенеративные расстройства с трудом поддаются изучению из-за ограниченной доступности материала и позднего начала клинического проявления, поэтому клеточные модели in vitro предоставляют хорошую возможность для изучения молекулярных механизмов развития патологии. Новые подходы редактирования генома позволяют получать клеточные линии, которые могут служить в качестве моделей наследственных заболеваний, и дают возможность получения изогенных пар клеточных линий, которые обеспечат адекватный контроль для исследований.

В работе представлен метод введения в геном культивируемых клеток динамической мутации экспансии повтора CAG с помощью гомологичной рекомбинации. Для повышения частоты рекомбинационных событий использовали систему CRiSPR/Cas9, позволяющую направленно и специфично вносить двуцепочечные разрывы ДНК в геном клеток. Сконструирована донорная молекула, несущая 215 тринуклеотидных повторов CAG, фланкированных длинными плечами гомологии к первому экзону гена НТТ, которая служила матрицей для гомологичной рекомбинации.

Эффективность метода была проверена на клеточной линии HEK293 Phoenix. Получены клоны клеток, несущие как встройки тринуклеотидных повторов CAG в гене НТТ (55-215 триплетов), так и делеции протяженных участков первого экзона НТТ (до 561 п.н.). Показано, что наличие мутации в геноме клеток линии НЕК293 Phoenix влияет на их жизнеспособность и скорость пролиферации.

Ключевые слова: клеточные модели, редактирование генома, болезнь Хантингтона.

Huntington's disease is an autosomal dominant neurodegenerative disorder caused by trinucleotide repeats expansion mutation in the first exon of HTT gene. Neurodegenera-tive disorders are difficult to study due to limited material availability and late onset of the manifestation. In vitro cell models provide a good opportunity to study molecular mechanisms of the pathology. New genome editing approaches allow us to generate isogenic cell lines that can be useful for drug screening and studying mechanisms of molecular and cellular events triggered by certain mutation on an equal genetic background.

The aim of our work was establishing a method to introduce expanded CAG repeat tract into HTT gene by homology directed repair. We used a genome editing tool based on CRiSPR/Cas9 system to facilitate the process. A donor construct bearing 215 CAG trinucleotide repeats flanked with long homology arms was generated.

The method was approved on the HEK293Phoenix cell line. Mutant clones were obtained. it was shown that mutant HTT protein is expressed in the HEK293 mutant clones and affect their viability and proliferation rate.

Keywords: cell modells, genome editing, Huntington's disease.

Введение

Технологии, позволяющие направленно и высокоэффективно изменять последовательности ДНК в геноме культивируемых клеток человека и животных, чрезвычайно востребованы современной фундаментальной и практической медициной. Эти технологии могут быть использованы как для удаления из генома нежелательных последовательностей (точечных мутаций, провирусов, трактов тринуклеотидных повторов и др.), так и для внесения новых последовательностей (создание клеточных моделей наследственных заболеваний, улучшение про-

е-таП: amal@bionet.nsc.ru

изводительности клеточных продуцентов биомолекул и др.) [1]. В данной работе мы использовали технологию СШРН/Саэ9 для внесения в геном клеток человека тандемных тринуклеотидных повторов, вызывающих наследственное нейродегенеративное заболевание — болезнь Хантингтона (экспансия триплета CAG в первом экзоне гена НТТ) [2].

Для моделирования наследственных заболеваний в культуре клеток наиболее перспективным подходом являтся получение изогенных линий плюрипотент-ных стволовых клеток, которые могут быть дифференцированы в различные типы клеток для изучения

конкретных механизмов развития заболеваний. В случае болезни Хантингтона такими типами клеток являются нейроны стриатума, а также глиальные клетки, которые вносят вклад в развитие некоторых патологических процессов при болезни Хантингтона, например, нарушение обратного захвата ионов кальция при проведении нервного импульса [2—4]. Подобные клеточные модели являются перспективным материалом для скрининга потенциальных лекарственных препаратов, а также для изучения молекулярных механизмов нейродегенерации. При этом исходные клетки без мутации служат адекватным отрицательным контролем.

Однако прежде чем начать работать с плюри-потентными клеточными культурами, необходимо было разработать технологию внесения экспансии тринуклеотидных повторов в геном культивируемых клеток. Нами была создана система для внесения повторов CAG в ген НТТ методом гомологичной рекомбинации геномной ДНК с искусственно сконструированной донорной плазмидой, которая содержала 215 триплетов CAG, фланкированных длинными плечами гомологии к первому экзону гена НТТ. Для повышения эффективности гомологичной рекомбинации использовали систему CRiSPR/Cas9, которая вносит двунитевые разрывы на участке гомологии между донорной молекулой ДНК и целевым сайтом генома [1, 5—6]. Технология была опробована на линии клеток НЕК293 Phoenix.

Материал и методы

Сборка плазмидных конструкций

Донорная конструкция donor HTT_215rep. Фрагменты ДНК, содержащие 16 повторов CAG, фланкированные сайтами узнавания рестриктаз BsmBi и Bbsi, были амплифицированы с геномной ДНК с помощью праймеров HTT_replen_f9 5'-ATGAAGGCC TTCGAGTCCCTCAAGTCCTTC-3' и HTT_replen_r9 5'-CG GTGGCGGCTGTTGCTGCTGCTGCTGC-3'. Продукты ПЦР были очищены путем выделения из геля набором фирмы QiAGEN и клонированы в вектор pGEM-T Easy (Promega). Плазмидный клон, содержащий встройку нужного фрагмента ДНК, гидролизовали парами

рестриктаз Bbsi + Bsai и BsmBi + Bsai (сайт узнавания Bsai расположен в гене устойчивости к ампициллину) в буфере CutSmart (NEB) в течение 1 ч. при температуре 37°С, продукты гидролиза, содержащие встройку, очищали посредством электрофореза в агарозном геле и лигировали друг с другом. Лигазную смесь трансформировали в штамм recA13 Stbl3 E. coli, плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса. В результате получали плазмид-ную конструкцию, содержащую 2*N-2 повтора CAG, где N- число повторов в исходной плазмиде. Проводили 6 раундов «наращивания» тракта тринуклеотид-ных повторов.

Плечи гомологии к первому экзону гена НТТ размером 0,5 т.п.н. и 1,36 т.п.н. амплифицировали с геномной ДНК с помощью пар праймеров HTT_

f1_EcoRi 5'-CCGCGAGAATTCACACACAGCTTCG-3' и

HTT_r1_6R-BsmBi-Hindiii 5'-CTCAGGGAGTTCAGGA AGGTCGTCCTCTGCTTCGAA-3' и HTTJHindiN-BsmBi-6R_f4 5'-AAGCTTCGTCTCCAGCAGCAACAGCCGCCAC CGCCG-3' и HTT_r4_Kpni 5'-CTTCATGAGACCACGTCA AGTCCGGCCATGG-3', используя полимеразы iProof (Bio-Rad) либо Herculase ii Fusion DNA Polymerase (Agilent Tech.) и клонировали в векторе pGEM-T Easy (Promega). Плазмидные клоны секвенировали на автоматическом секвенаторе ABi 3130XL Genetic Analyser (Applied Biosystems) в центре коллективного пользования «Геномика» СО РАН и отбирали клоны, не содержащие нуклеотидных замен. Затем плечи гомологии вырезали с помощью рестрик-таз EcoRi, Hindiii и Kpni и клонировали в плазмидный вектор, сконструированный на основе pSMART LCKan (Lucigen) по модульному принципу. Для конструирования клонирующего вектора использовали праймеры, приведенные в табл.

Плазмиды, экспрессирующие компоненты системы CRISPR/Cas9. Для подбора 20-нуклеотидных последовательностей протоспейсеров для системы CRiSPR/Cas9 в локусе HTT был использован алгоритм, опубликованный на Web-сайте http://crispr. mit.edu/ [7]. Было выбрано 5 протоспейсеров, комплементарных последовательностям первого экзона гена НТТ, лежащих в пределах 500 нуклеотидов по обе стороны от тракта повторов CAG.

Таблица. Праймеры, использованные для конструирования клонирующего вектора для донорной плазмиды

Название модуля Праймер Последовательность праймера

Ген устойчивости GG_Spect_F 5' -CGCTCTGGTCTCGCTATGCGCTCACGCAAC-3'

к спектромицину GG_Spect_R2 5' -GTCCTGGGTCTCTCATTATTTGCCGACTACCTTGG-3'

Низкокопийный GG_pSMART_LC_F 5' -GGCGTCGGTCTCTAAATGACCAAACAGGAAAAAAC-3'

ориджин репликации GG_pSMART_LC_R GGTGCGGGTCTCCATAGCTCCTGAAAATCTCGATA-3'

Терминаторы GG_T3Te_F 5' -CCGTTGGGTCTCGTACGAAGAAAGGCCCACCC-3'

транскрипции GG_T7Te_F 5' -AATGAGGGCCCAAATGTAATCACCTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTG-3'

GG_T7Te_R 5' -TCCGCAGAAAGGCCCACCCGAAGGTGAGCCAGGTGATTACATTTGGGCCCT-3'

Полилинкер SL1 5' -CAGTCCAGTTACGCTGGAGTC-3'

SR2 5' -GGTCAGGTATGATTTAAATGGTCAGT-3'

Для получения плазмидных конструкций, экс-прессирующих компоненты системы CRiSPR/Cas9, использовали протокол, представленный на Web-сайте www.genome-engineering.org [1]. Согласно предложенной методике, были синтезированы 5 пар олигонуклеотидов (прямой, комплементарный):

1)HTT1_s 5-' CACCGCTAGGGCTGTCAATCATGC-3' HTT1_as 5'-AAACGCATGATTGACAGCCCTAGC-3';

2) HTT2_s 5'-CACCGCGTTGTGAAGAGAACTTGG-3' HTT2_as 5'-AAACCCAAGTTCTCTTCACAACGC-3';

3) HTT3_s 5'-CACCGTGAGGGAGCGGGGCTGAAG-3' HTT3_as 5'-AAACCTTCAGCCCCGCTCCCTCAC-3';

4) HTT4_s 5'-CACCGCTGCTGCTGGAAGGACTTG-3' HTT4_as 5'-AAACCAAGTCCTTCCAGCAGCAGC-3';

5) HTT5_s 5'-CACCGACTCTGCCAATGGCTGGCC-3' HTT5_as 5'-AAACGGCCAGCCATTGGCAGAGTC-3'.

Двуцепочечные олигонуклеотиды клонировали в вектор pSpCas9(BB)-2A-GFP (pX458, Addgene plasmid # 48138). В результате было получено 5 конструкций: pX458-HTT1, pX458-HTT2, pX458-HTT3, pX458-HTT4, pX458-HTT5.

Культивирование и трансфекция клеток

линии НЕК293 Phoenix

Клетки линии НЕК293 Phoenix культивировали в среде, содержащей DMEM/F12 (1:1), 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 200 мМ GlutaMAX (Life Technologies), 1% пенициллин/стрептомицин (Life Technologies). Трансфекцию клеток НЕК293 Phoenix проводили кальций-фосфатным методом. Клетки рассаживали в количестве 105 клеток на 1 лунку 12-ячеечного планшета. Трансфекцию проводили через 18—20 ч. после рассева клеток. Для этого смешивали в одной пробирке 2 мкг плазмидной ДНК (одной из pX458-HTT1, pX458-HTT2, pX458-HTT3, pX458-HTT4, pX458-HTT5 или празмиды pMAX-GFP (Lonza) в качестве отрицательного контроля), 0,25 мМ CaCl2 и Н2О до объема 120 мкл, затем по каплям добавляли равный объем раствора HBS 2X (0,28 М NaCl, 1,5 мМ Na2HP04, 50 мМ HEPES, рН 7.1) при постоянном перемешивании, оставляли на 15 минут при комнатной температуре и затем добавляли смесь к клеткам в ростовую среду. Планшет с клетками помещали в СО2-инкубатор и культивировали при температуре 37°C в атмосфере 5% СО2. Среду меняли через 8—10 ч. после трансфекции. Через 48 ч. после трансфекции в клетках наблюдалась флуоресценция GFP.

Анализ эффективности работы CRISPR/Cas9

с помощью эндонуклеазы I фага Т7

Клетки снимали 0,25% трипсином/ЭДTА через 48 ч. после трансфекции. ДНК выделяли с помощью набора для выделения ДНК (QiAGEN). Анализ наличия микроинсерций/делеций в исследуемом локусе проводили с помощью анализа гетеродуплексов, используя эндонуклеазу i фага T7 (New England Biolabs), по описанной методике [6]. Амплификацию фрагментов для анализа проводили с использованием праймеров HTT-F6 5'-GCCTTGCTGTGTGAGGCAGAAC-3' и HTT-R8 5'-GTGTCGGCGACGACGGAGTC-3' (для анализа активности конструкций pX458-HTT1, pX458-HTT4 и pX458-HTT5) и праймеров HTT-F7 5'-GGATGGCGGTAACCCTGCAG-3' и HTT-R7 5'-GATCAGACTCTCCCTTCTCCCGAC-3' (для анализа активности конструкций pX458-HTT2 и pX458-HTT3).

Внесение повторов CAG в экзон 1 гена НТТ

клеток линии НЕК293 Phoenix

Клетки рассаживали на 12-луночные планшеты по 105 клеток на лунку. Трансфекцию проводили кальций-фосфатным методом, как описано выше. На одну лунку добавляли 1—3 мкг плазмидной ДНК pX458-HTT4 и 1—3 мкг донорной плазмиды в разных соотношениях. Через 8—10 ч. в после трансфекции культуральную среду меняли на свежую, через 48 ч. после трансфекции клетки сортировали по свечению GFP на приборе S3 Cell Sorter (Bio-Rad).

Сортированные клетки рассаживали на 96-луноч-ные планшеты из расчёта одна клетка на лунку, либо высаживали на чашку Петри и субклонировали через 3 и 6 дней после сортировки (6 и 9 день после трансфекции соответственно). После того, как клоны единичных клеток формировали монослой, с них делали реплики, рассаживая на два планшета, один из которых использовали для выделения геномной ДНК клонов для анализа, а второй сохраняли для дальнейшего культивирования.

Анализ длины аллелей гена НТТ в субклонах

НЕК293 Phoenix

Для выделения геномной ДНК субклонов НЕК293 Phoenix из лунок 96-ячеечных планшетов отбирали ростовую среду, промывали фосфатным буфером, в каждую лунку добавляли по 35 мкл буфера для выделения ДНК (10 мМ^-НС1, pH 8.0; 10 мМ ЭДТА, pH 8.0; 0,35% igepal CA630; 0,35% Tween 20; 0,4 мг/мл протеиназы К) и инкубировали в течение 3 ч. при температуре 65°С во влажной камере. Затем планшеты вместе с влажной камерой (во избежание испарения жидкости) переносили на 4°С и оставляли на ночь. В каждую лунку добавляли по 165 мкл Н2О, для последующего анализа в реакции ПЦР брали по 4—5 мкл образца геномной ДНК (при общем объеме реакции 25 мкл).

Анализ длины внесенного тракта повторов проводили с помощью ПЦР с праймерами HTT-F10 5'-CCCAAGGCCACCTCGGCTCAGAGTC-3' HTT-R11 5'-CGCAGGCTGCAGGGTTACCGCCATC-3' в следующих условиях: 65 мМ Tris-HCl, pH 8.9; 16 мМ (NH4)2S04; 1,5 мМ MgCl2; 0,05% Tween 20, 3% глицерин, 6% DMS0, 0,5 ед. Taq-polymerase, 0,2 мкМ каждого праймера, 50-200 нг геномной ДНК, на термоцикле-ре С1000 Touch Bi-Rad (прогрев 96°С - 5 мин.; 40 циклов: 96°С — 20 сек., 72°С — 3 мин.; стадия дополнительного синтеза 72°С — 15 мин.).

Для подтверждения внесения мутаций в ген НТТ продукты ПЦР очищали с помощью электрофореза в агарозном геле, клонировали в векторе pGEM-T Easy (Promega) и секвенировали с использованием специфичных праймеров HTT-F10 и HTT-R11.

Анализ экспрессии белка НТТ в клетках

с помощью ОТ-ПЦР

РНК выделяли при помощи реагента Trizol Reagent (Ambion). Образцы обрабатывали с помощью DNAfree DNA Removal fät (Ambion), чтобы избавиться от контаминации геномной ДНК. кДНК синтезировали с использованием Super-Scriptiii (invitrogen). Для анализа экспрессии гена НТТ использовали прайме-ры HTT-F7 5'-GGATGGCGGTAACCCTGCAG-3' и HTT-R7 5'-GATCAGACTCTCCCTTCTCCCGAC-3'. Для каждой пары праймеров проводили реакцию негативного

оригинальные ИССЛЕДОВАНИЯ 109

контроля (ОТ-), в которой в качестве матрицы использовали реакционную смесь, содержащую все компоненты, необходимые для синтеза кДНК, за исключением обратной транскриптазы.

Анализ локализации белка НТТ

в клетках методом иммунофлуоресцентного

окрашивания

Клетки рассаживали на 4-ячеечные планшеты. При достижении 80—90% конфлюэнтности монослоя клетки промывали фосфатным буфером и фиксировали 4% формальдегидом 10 мин., обрабатывали 0,1% раствором Triton-X100 10 мин., блокировали раствором 2,5% БСА в фосфатном буфере 30 мин. и далее инкубировали с антителами anti-Huntington (MAB2166, Millipore) в течение ночи при температуре 4°С. Затем препараты отмывали фосфатным буфером 2 раза по 15 минут и инкубировали со вторыми антителами, конъюгированными с флуорохромом Alexa488 (Life Technologies, A21121). Дважды промывали фосфатным буфером и окрашивали 0,1% □APi (Vector Laboratories). Препараты анализировали с помощью лазерного сканирующего микроскопа LSM 780 NLO (Zeiss) в Центре коллективного пользования микроскопического анализа биологических объектов СО РАН.

Анализ уровня апоптоза

Уровень апоптоза в культурах клеток исследовали с помощью набора FiTC Annexin V Apoptosis □ etection Kit with Pi (BioLegend) по предложенному производителями протоколу. Результат оценивали с помощью проточной цитофлуориметрии на приборе Bd FACSCantoii и программного обеспечения Bd FACSdiva.

Оценка интенсивности пролиферации

Клетки рассаживали на 12-ячеечные планшеты по 2х105 на лунку, затем через каждые 24 ч. в течение 6 дней клетки снимали 0,25% трипсином/ ЭДТА, окрашивали трипановым синим (0,4% раствор, invitrogen) и считали на счетчике Countess automated cell counter (invitrogen). Эксперимент проводили в трех повторностях, достоверность различий оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа.

Результаты

Создание донорной конструкции donor

HTT_215rep методом клонирования

Golden Gate

В качестве матрицы для гомологичной рекомбинации использовли донорную плазмиду, несущую тракт 215 повторов CAG, фланкированный длинными плечами гомологии к первому экзону гена НТТ. Донорная конструкция donor HTT_215rep была получена методом последовательного Golden Gate клонирования, что позволило избежать внесения в донорную последовательность ДНК сайтов рестрикции и сохранить 100% гомологию последовательностей, фланкирующих удлиненный тракт повторов CAG, с геном НТТ человека. Для сборки этой конструкции необходимо было провести подбор оптимального дизайна клонирующего плазмидного вектора, который позволяет повысить репликативную стабильность встройки и снизить вероятность нежелательных рекомбинационных событий за счёт минимизации размера клонирующего вектора, а также штаммов E. coli, наиболее подходящих для клонирования нестабильных участков повторяющихся последовательностей ДНК.

Клонирующий вектор для донорной последовательности ДНК donor HTT_215rep сконструирован на основе плазмидного вектора pSMART по модульному принципу, имеет размер около 2 т.п.н., состоит из следующих функциональных модулей: модуль устойчивости к спектиномицину; модуль низкокопий-ного ориджина репликации ColEI в сочетании с геном ROP; модуль полилинкера для встройки участка донорной ДНК. Модули разделены тремя терминаторами транскрипции, которые препятствуют транскрипции встройки (рис. 1Б).

Схема наращивания тракта тринуклеотидных повторов представлена на рис. 1А. В результате серии раундов рестрикции/лигирования была получена плазмида, содержащая более 200 повторов CAG. Рестрикционный анализ и секвенирование показали, что данная конструкция содержит 215 повторов CAG (а не 226, как предполагалось по схеме). Отклонение от ожидаемого алгоритма наращивания повторов вызвано, по всей видимости, репликативной нестабильностью повторяющихся последовательностей ДНК в культурах бактериальных клеток.

. ™ ,

ш

щ

к

m

■

Б

Рис. 1.

Схема сборки донорной конструкции HTT_215rep: А — схема наращивания тракта тринуклеотидных повторов CAG методом клонирования Golden Gate;

Б — схема сборки донорной конструкции HTT_215rep

Методом Golden Gate клонирования тракты три-нуклеотидных повторов были объединены с плечами гомологии, в результате чего была получена плаз-мидная конструкция donor HTT_215rep, содержащая 215 тринуклеотидных повторов CAG и плечи гомологии к первому экзону гена НТТ (рис. 1Б).

Выбор целевого сайта в геноме клеток для системы CRISPR/Cas9 и проверка активности конструкций CRISPR/Cas9 в клетках линии НЕК293Phoenix

Было выбрано 5 последовательностей, которые отвечают критериям протоспейсера и расположены в пределах 500 нуклеотидов по обе стороны от тракта тринуклеотидных повторов (рис. 2). Биоинфор-матический анализ возможной нецелевой активности созданных конструкций с помощью программы CROP-iT подтвердил специфичность их действия.

В отсутствие донорной ДНК двуцепочечные разрывы репарируются по механизму негомологичного сшивания концов, в результате которого в последовательности ДНК образуются небольшие инсерции и/или делеции. После денатурации и последующей медленной ренатурации продуктов ПЦР, полученных с района генома, содержащего инсерции и/или деле-ции, образуются гетеродуплексы ДНК с неспаренны-ми основаниями, которые детектируются с помощью гидролиза эндонуклеазой i фага Т7. Таким образом, наличие продуктов гидролиза свидетельствует о нуклеазной активности системы CRiSPR/Cas9 в целевом локусе.

Для проверки активности полученных конструкций была произведена трансфекция клеток линии HEK293 Phoenix плазмидами рХ458-НТТ1, рХ458-НТТ2, рХ458-НТТ3, рХ458-НТТ4, рХ458-НТТ5, а также для контроля была взята плазмида pMAX-GFP (Lonza). На третий день после трансфекции клетки сортировали по свечению GFP, и выделяли геномную ДНК для гетеродуплексного анализа с помощью эндонуклеазы i фага Т7. Продукты гидролиза были обнаружены

в образцах, трансфицированных плазмидами рХ458-НТТ2, рХ458-НТТ3 и рХ458-НТТ4, что свидетельствует о работе системы CRiSPR/Cas9 (рис. 3). Для дальнейшей работы была выбрана плазмида рХ458-НТТ4, так как протоспейсер для данной конструкции находится в непосредственной близости от тракта тринуклеотидных повторов в локусе НТТ (рис. 2).

Внесение мутаций в геном клеток и анализ

рекомбинантных клонов методом ПЦР

Для внесения удлиненного тракта тринуклеотидных повторов CAG в геном клеток линии HEK293 Phoenix проводили котрансфекцию плазмидами pX458-HTT4 и donor НТТ_215гер. На третий день после трансфекции клетки сортировали по свечению GFP и рассаживали на 96-луночные планшеты для получения клонов единичных клеток, либо высевали на чашки Петри и субклонировали на 6 и 9 день после трансфекции. Для оценки длины аллелей гена НТТ полученных рекомбинантных клонов методом ПЦР использовали праймеры, один из которых комплементарен последовательности вблизи блока повторов в З'-плече гомологии, а второй лежит за пределами 5'-плеча гомологии. Это предотвращает получение ПЦР-продукта, синтезированного с донорной плазмидной конструкции, которая могла сохраниться в культуре клеток либо встроиться в геном клеток.

Получено и проанализировано около 300 клонов (по 100 клонов на каждый из трех экспериментов, различающихся сроком субклонирования трансфи-цированных клеток). В результате анализа выявлены как клоны со встройками повторов различной длины (около 1—5% клонов), так и клоны с делециями участков первого экзона гена НТТ (5—12% проанализированных клонов) (рис. 4 А—В). При субклонировании клеток на третий день после трансфекции было получено больше субклонов, содержащих мутации (деле-ции или инсерции) в гене НТТ (18 субклонов), чем при субклонировании на 6 и 9 день после трансфекции

Рис. 2.

Схема расположения мишеней для CRiSPR/Cas9 в локусе НТТ: Н1-5 — протоспейсеры для систем CRiSPR/Cas9, синтезируемых с конструкций pX458-HTT1-5 соответственно; F10, R11 - праймеры для анализа длины мутантного аллеля

А

Б

Рис. 3.

Гетеродуплексный анализ активности конструкций CRISPR/Cas9.

Стрелками указаны продукты гидролиза нуклеазой 1 фага Т7.

К — контроль (реакции, полученные с геномной ДНК линии НЕК293 Phoenix, трансфицированной плазмидой pMAX-GFP)

(6 и 12 субклонов соответственно). Возможно, это связано с тем, что при совместном культивировании сортированных клеток конкурентное преимущество получают клетки, не несущие мутации в гене НТТ. С помощью секвенирования были подтверждены встройки протяженных участков повторов в первом экзоне гена НТТ длиной до нескольких сотен пар нуклеотидов (от 55 до 215 повторов CAG). Деле-ции имеют длину до 561 п.н. и затрагивают район, в котором производился гидролиз нуклеазой Cas9.

Повышение доли донорной плазмиды в смеси плаз-мид, трансфицируемых в клетки, до молярного соотношения 1:6 pX458-HTT4:donor HTT_215rep не приводило к повышению доли клеточных клонов со встройками тринуклеотидных повторов.

В результате повторного анализа длины мутант-ных аллелей НТТ в клонах клеток на 8—10 пассаже обнаружено сокращение длины мутантного аллеля гена НТТ в процессе культивирования мутантных клонов НЕК293 Phoenix (рис. 4 Г).

Рис. 4. ПЦР-анализ длины аллелей гена НТТ в клонах клеток НЕК293 Phoenix и анализ экспрессии гена НТТ: А—В — ПЦР-анализ длины аллелей НТТ в субклонах НЕК293 Phoenix после трансфекции плазмидами рХ458-НТТ4 и donor HTT_215rep, субклонированных на 3, 6 и 9 сут. после трансфекции, соответственно (стрелками указаны положение продукта ПЦР с нормального аллеля); Г — изменение длины мутантных аллелей НТТ при культивировании мутантных субклонов 4В, 6Н и 3В; Д — ОТ-ПЦР анализ экспрессии НТТ в мутантных клонах 4В, 6Н и НЕК293 Phoenix

4В 6Н НЕК293 PhL. -

- + + - + - Г-ГГ

- -

— —

Подобный феномен был описан также при культивировании индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных в результате репрограмми-рования фибробластов кожи пациентов с болезнью Хантингтона [8]. Механизм сокращения количества повторов CAG в гене НТТ в культурах клеток является предметом для дальнейших исследований.

Анализ экспрессии белка НТТ и оценка его влияния на жизнеспособность и пролиферацию мутантных клеток

Известно, что белок НТТ экспрессируется практически во всех типах клеток организма, однако функции этого белка все еще полностью не установлены. ОТ-ПЦР анализ показал наличие экспрессии НТТ в клетках линии НЕК293 Phoenix и полученных мутантных клонах (рис. 4Д).

Для анализа паттерна распределения НТТ в клетке было проведено иммунофлуоресцентное окрашивание антителами на белок НТТ (N-концевой домен)

двух клонов (4В и 6Н), несущих мутантные аллели гена НТТ различной длины, и исходной линии клеток (изогенного контроля) (рис. 4Г). Иммунофлуорес-центное окрашивание показало цитоплазматическую и ядерную локализацию белка НТТ с небольшим обогащением по периферии ядра во всех проанализированных культурах клеток (независимо от наличия и длины привнесенного тракта повторов), что согласуется с имеющимися данными по распределению данного белка в клетке (рис. 5) [9].

Для оценки влияния мутантного белка в клетке на показатели ее жизнедеятельности были исследованы скорость пролиферации и уровень апоптоза в культурах клеток.

Интенсивность пролиферации мутантных клонов оценивали ежедневным подсчетом числа клеток на лунках, в которые изначально было посажено одинаковое количество клеток (по 2х105 клеток на лунку). Мутантный клон 4В демонстрировал достоверное отставание в росте от исходной культуры клеток (рис. 6А).

А

Iii

»

, .л'

ШШЩ шшёй

gjggffipj.-;-

я'-;'

■. ■ „ ■

i Ж' »i

■. - 'Ш

«

Рис. 5.

Клоны НЕК293 Phoenix, иммунофлуоресцентное исследование с антителами к НТТ: А — профиль распределения флуоресцентного сигнала в клетке;

Б — распределение флуоресцентного сигнала в объёме клетки

А

О 2 ш

н

и 0) 2 т S

с;,

о

Ш

-»•HEK293 Phoenix т

— 4B НТТ Л 6H НТТ /Г

/ /

/ J

///

//у

л/

Рис. 6.

Анализ жизнеспособности мутантных клонов 4В и 6Н по сравнению с исходной линией клеток НЕК293 Phoenix:

А — график интенсивности пролиферации мутантных субклонов 4В и 6Н по сравнению с исходной линией клеток НЕК293 Phoenix;

Б — анализ уровня апоптоза мутантных субклонов 4В, 6Н и клеток линии НЕК293 Phoenix методом проточной цитофлуориметрии с помощью окраски аннексином V и йодидом пропидия

Б

Оценка жизнеспособности мутантных линий клеток проводилась с помощью окраски аннексином V и иодидом пропидия. Был выявлен повышенный уровень апоптоза клеток мутантных клонов 4В и 6Н (5,8 и 8% клеток, находящихся на поздней стадии апоптоза, соответственно) по сравнению с исходной линией 4EK293Phoenix (3,8%) (рис. 6Б).

Таким образом, полученные изогенные линии клеток, несущие различные варианты мутантного аллеля гена НТТ, демонстрируют отставание в росте и повышенный уровень апоптоза по сравнению с контрольной линией клеток НЕК293 Phoenix.

Обсуждение

Современные технологии геномного редактирования позволяют получать изогенные клеточные линии с высокой эффективностью. Нами была разработана технология внесения тринуклеотидных повторов CAG в первый экзон гена НТТ культивируемых клеток человека. Методика была опробована на культуре клеток НЕК293 Phoenix. Удалось получить мутант-ные линии клеток, несущие от 55 до 215 повторов CAG в первом экзоне гена НТТ. Известно, что проявление заболевания начинается при длине тракта повторов более 35 мономеров, а возрастание длины повторенного тракта приводит к развитию более тяжелой формы заболевания в более раннем возрасте пациента [2—3]. Возможность создания панели изогенных линий клеток, несущих мутантные аллели гена НТТ, обусловливающие развитие заболевания различной степени тяжести, представляет большой интерес для изучения молекулярных механизмов патологии. При этом наличие «здорового» изогенно-го контроля, не несущего мутаций в гене НТТ, позволит исключить влияние генетического фона на

ответ клеток при воздействии на них потенциальными лекарственными препаратами.

Эффективность внесения мутаций в геном составила от 1 до 5%. Наряду с целевыми мутациями встройки удлиненных тринуклеотидных трактов наблюдались крупные делеции в первом экзоне гена НТТ. Возможно, это объясняется тем, что в отсутствие донорной молекулы двунитевые разрывы ре-парировались негомологичным соединением концов [1, 6]. Поскольку для гомологичной рекомбинации необходимо, чтобы в результате трансфекции в клетку попали сразу две плазмиды, то вероятность получения клонов с инсерцией блока тринуклеотид-ных порторов ниже, чем вероятность возникновения делеции.

Было показано, что наличие мутации в гене НТТ влияет на жизнеспособность НЕК293 Phoenix. Поэтому эксперименты по изучению некоторых аспектов функционирования мутантного белка НТТ можно проводить на мутантных линиях НЕК293 Phoenix, например, изучать механизм агрегации мутантных белков. Однако для создания более адекватной модели заболевания необходимо получить культуру клеток, максимально приближенную к тем типам клеток организма, которые страдают при болезни Хантингтона и задействованы в развитии патологии, т.е. средние шипиковые нейроны стриатума, глиальные клетки (астроциты) [2—4]. Для этого необходимо получение плюрипотентной линии клеток, способной дифференцироваться в различные типы нейральных клеток и моделировать заболевание in vitro.

Благодарности

Работа поддержана Программой РАН «Фундаментальные науки-медицине» № 0324-2015-0021.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Cong L., Ran F.A., Cox D. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 2013; 339(6121): 819-23.

2. Rubinsztein D.C., Carmichael J. Huntington's disease: molecular basis of neurodegeneration. Expert. Rev. Mol. Med. 2004; 5(20): 1-21.

3. Walker FO. Huntington's disease. Lancet 2007; 369(9557): 218-28.

4. Juopperi T.A., Kim W.R., Chiang C.-H. et al. Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells. Mol. Brain. 2012; 5: 17.

5. Немудрый А.А., Валетдинова К.Р., Медведев С.П. и др. Системы редактирования геномов TALEN и CRISPR/Cas инструменты открытий. Acta Naturae 2014; 6(3 (22)): 20-42.

6. Ran F.A., Hsu P.D., Wright J. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 2013; 8(11): 2281-308.

7. Hsu P.D., Scott D.A., Weinstein J.A. et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 2013; 31(9): 827-32.

8. Camnasio S., Carri A.D., Lombardo A. et al. The first reported generation of several induced pluripotent stem cell lines from homozygous and heterozygous Huntington's disease patients demonstrates mutation related enhanced lysosomal activity. Neurobiol. Dis. 2012; 46(1): 41-51.

9. Wu L.L.-Y. Zhou X.F. Huntingtin associated protein 1 and its functions. Cell Adhes. Migr. 2009; 3(1): 71-6.

Поступила: 14.03.2016