CC BY
80
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИММУНОЛОГИЯ И ИММУНОГЕНЕТИКА
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018 УДК: 612.112.95.014.467
Чулкина М.М.1, Пичугин А.В.1, Лебедева Е.C.1, Холмухамедов Э.Л.2, Атауллаханов Р.И.1
ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ РЕЦЕПТОРА ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ (CD44) В МЕХАНИЗМАХ АКТИВАЦИИ ФИБРОБЛАСТОВ ЛИНИИ NIH/3T3 ПРИ ДЕЙСТВИИ ТЕТРАДЕКАПЕПТИДА TEKKRRETVEREKE И ЦИТОКИНА TGF-B1
1ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, 115522, Москва, Россия; 2 Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино, Россия
Ранее мы сообщали, что индуктор заживления эрозий, язв и ран тетрадекапептид TEKKRRETVEREKE (иммуно-модулирующий препарат Гепон) активирует MAPK-сипналыный путь в фибробластах, вызывает дифференцировку фибробластов в миофибробласты, а также увеличивает подвижность этих клеток в модели повреждения клеточно-по монослоя [1, 2]. В данной работе мы исследовали ролы рецептора пиалуроновой кислоты (CD44) в механизмах активации фибробластов при действии тетрадекапептида (ТДП) TEKKRRETVEREKE и цитокина TGF-pi. Технологией CRISPR-CAS9 нокаутировали CD44 в NIH/3T3 фибробластах и исследовали способность нокаутов к диф-ференцировке и заживлению повреждённого монослоя клеток в модели in vitro. Показано, что CD44KO NIH/3T3-фибробласты сохраняют способность к дифференцировке в миофибробласты под действием ТДП или TGF-pi. Активация МАРК-сигналыного пути при действии ТДП или TGF-pi не зависела от наличия или отсутствия рецептора CD44. При исследовании способности заживления повреждённого клеточного монослоя было показано, что у клеток CD44KO значительно повышена базалыная скорость движения по субстрату, покрытому коллагеном. ТДП увеличивал скорость заживления монослоя клеток дикого типа, но не влиял на скорость движения нокаутов. Наши данные указывает на отсутствие существенной связи между молекулярными механизмами активации фибробла-стов тетрадекапептидом TEKKRRETVEREKE и наличием у клеток CD44-рецептора.
Ключевые слова: фибробласты; дифференцировка; миофибробласты; TGF-@1; Гепон; ERK1/2; CD44. Для цитирования: Чулкина М.М., Пичугин А.В., Лебедева Е.С., Холмухамедов Э.Л., Атауллаханов Р.И. Исследование роли рецептора гиалуроновой кислоты (CD44) в механизмах активации фибробластов линии NIH/3T3 при действии тетрадекапептида TEKKRRETVEREKE и цитокина TGF-fiL Иммунология. 2018; 39(2-3): 114-122. DOI: http:// dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-2-3-114-122.
Chulkina M.M.1, Pichugin A.V.1, Lebedeva E.S.1, Holmuhamedov E.L.2, Ataullakhanov R.I.1
THE ROLE OF HYALURONIC ACID RECEPTOR (CD44) IN ACTIVATION MECHANISMS OF NIH/3T3 FIBROBLAST WITH THE TEKKRRETVEREKE SYNTHETIC PEPTIDE VERSUS TGF-B1 CYTOKINE
1 National Research Center - Institute of Immunology, Federal Medical-Biological Agency of Russia, 115522, Moscow, Russia;
2 Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Sciences, 142290, Pushchino, Russia
We have previously shown that TEKKRRETVEREKE tetradecapeptide (a healing therapeutics Gepon) induces activation of MAPK-signalling pathway in murine NIH/3T3 fibroblasts with their subsequent differentiation into myofibroblasts, and also increases cell motility in the scratch-test [1, 2]. In this study, we examine a possible role of CD44, a hyaluronic acid receptor, in the activation of fibroblasts with TEKKRRETVEREKE tetradecapeptide (TDP). By CRISPR-CAS9 technology we knocked out the CD44 mRNA and protein in NIH/3T3 fibroblasts and examined the ability CD44KO fibroblasts to in vitro differentiation and wound healing. It was shown that CD44KO NIH/3T3 fibroblasts fully retain their ability to differentiate under influence of TDP or TGF-pi. We show that TDP- or TGF-pi-induced activation of MAPK-signaling pathway does not depend on CD44. In in vitro "healing" of the damaged cell monolayer (scratch-test), the rate of CD44KO cell movement was significantly increased as compared to the wild type NIH/3T3 fibroblasts. Although TDP increased the rate of healing of the scratched wild-type cell monolayer, it did not affect the motility of CD44KO cells. Thus, a presence of CD44-receptor for extracellular matrix' hyaluronic acid is not necessary for TDP-induced activation of NIH/3T3 fibroblasts.
Keyword: fibroblasts; myofibroblasts; wound healing; TGF-ft1; Gepon; ERK1/2; CD44.
For citation: Chulkina M.M., Pichugin A.V, Lebedeva E.S., Holmuhamedov E.L., Ataullakhanov R.I. The role of hyaluronic acid receptor (CD44) in activation mechanisms of nih/3t3 fibroblast with the TEKKRRETVEREKE synthetic peptide versus TGF-P1 cytokine. Immunologiya. 2018; 39(2-3): 114-122. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-2-3-114-122
For correspondence: Ravshan I. Ataullakhanov, MD, PhD, Prof., Head of the Department of Immune Biotechnology, NRC Institute of Immunology FMBA, Russia, E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgments. The study had no sponsorship.
Received 11.03.18 Accepted 16.04.18
Для корреспонденции: Атауллаханов Равшан Иноятович, д-р мед. наук, проф., руководитель отдела иммунной биотехнологии ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com.
Введение
Процесс заживления в организме является сложным и многостадийным, регуляция каждого этапа последовательных изменений жестко регулируется [3-6]. Хорошо известно, что для нормального функционирования, связанного с регенерацией и заживлением, а также для поддержания гомео-стаза фибробласт находится в процессе постоянного ремоде-лирования матрикса [7]. Связь фибробласта с внеклеточным матриксом осуществляется через большое количество рецепторов на поверхности клетки, специфичных к узнаванию и связывающихся с определ'нными пептидными последовательностями элементов внеклеточного матрикса. Сигнал, полученный клеткой от этих рецепторов через систему сигнальных белков (зрин-радиксин-моезин (ERM) комплекс), переносится внутрь клетки и преобразуется в функциональный клеточный ответ [7, 8].
Препарат Гепон успешно применяется в клинической практике и оказывает выраженный терапевтический эффект при лечении язв желудка, двенадцатиперстной кишки, язвенном колите, трофических язв мягких тканей при варикозной болезни, а также язвенно-некротических поражений толстого кишечника, возникающих у онкобольных как осложнение лучевой терапии [3-5]. Этот препарат является синтетическим тетрадекапептидом TEKKRRETVEREKE, последовательность которого гомологична шарнирной области белка эзрин. В предыдущих исследованиях мы показали, что ТДП вызывает быструю активацию фосфорилирования киназ ERK1/2 в фибробластах с последующей дифференцировкой активированных клеток в миофибробласты, содержащие сократительные микрофиламенты с белком a-SMA (a-smooth muscle actin) [2]. Активация ТДП достоверно повышала скорость движения фибробластов в тесте «заживления» поврежд'нного клеточного монослоя in vitro [1]. Это наблюдение позволило предположить участие рецепторов адгезии к внеклеточному матриксу в активации фибробластов ТДП. Согласно литературным данным, связь активации рецептора гиалуроновой кислоты (CD44) и скорости движения клеток опосредуется через МАРК-сигнальный каскад [12, 14, 2728]. CD44 принимает участие в различных клеточных функциях, в том числе во взаимодействии клетки с полимерами внеклеточного матрикса, что может существенно влиять на скорость движения клеток по субстрату [9-12]. Известно, что при связывании с компонентами внеклеточного матрикса -гиалуроновой кислотой и коллагеном - происходит кластеризация и активация CD44-рецепторов, что приводит к реорганизации цитоскелета и активации целого ряда сигнальных механизмов (FAK, Src, p56, p185, Rho, PKC) [13-15].
CD44 является важным рецептором для движения фи-бробластов. Регуляция активации данного рецептора имеет хорошие перспективы для разработки терапевтических препаратов, оказывающих влияние на заживление [17-19].
Цель данной работы - исследовать связи между наличием или отсутствием у фибробластов CD44-рецепторов и активацией фибробластов под влиянием тетрадекапептида TEK-KRRETVEREKE. Мы создали сублинию клеток NIH/3T3, у которых был нокаутирован ген CD44-рецептора (далее - клетки CD44KO). Это позволило сравнить действие ТДП на клетки NIH/3T3 дикого типа и CD44KO по нескольким эффектам в культуре in vitro, в частности, по активации MAPK-сигнального пути, дифференцировке в миофибробласты и изменению клеточной подвижности в тесте «заживления» повреждённого клеточного монослоя. Полученные данные свидетельствуют, что активация фибробластов тетрадекапептидом не зависит от наличия или отсутствия CD44-рецепторов.
Методы
Получение линии NIH/3T3 CD44KO
Получение нокаутной линии проводили совместно с лабораторией иммунохимии ФГБУ ГНЦ «Институт иммуно-
original article
логии». Для получения NIH/3T3-фибробластов, нокаутных по рецептору к гиалуроновой кислоте (CD44), использовали систему редактирования генома на основе эндонуклеазы CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) и направляющей РНК (guide-RNA, gRNA), специфичной к гену мишени [2О, 21]. Для снижения нецелевых эффектов, связанных с редактированием гена Cas9, объединили модификации эндонуклеазы повышенной точности eCas9 1.1 с методом двойного никинга (double nicking (DN)) [22, 23]. В вектор pcDNA 3.3 TOPO hCas9 DWA vector (Addgene, Кат. № 41815) включили три мутации K848A, K1003A и R1060A методом сайт-направленного мутагенеза (Quick Change PCR Mutagenesis technique) (Stratagene, США) (189). Плазмида guide-RNA - pKS gRNA BB была описана ранее и использовалась в данном исследовании (189). Целевые последовательности gRNA 5'-ATGGCCGCTACAGTATCTCC-3' и 5'-GAATACACCTGCGTAGCGGC-3' соответствовали 5'-концу 2 экзона гена CD44 мыши и подобраны с использованием веб-ресурса http://tools.genome-engineering.org.
Процедура трансфекции и отбор КО клеток. Так как CD44 является чувствительным к трипсину [34], во всех экспериментах для снятия клеток с культуральной поверхности использовали раствор энзимов с протеолитической и коллагенолитической активностью - Аккутазу (Sigma, Кат.№ A6964, США), согласно инструкции производителя. Для этого NIH/3T3 клетки были посажены на три чашки Петри 1О см, обработанные коллагеном 1-го типа (rat tail collagen, Sigma Кат.№ С3867, США) (1Омкг/см2), в плотности 1О ООО клеток/см2 в среде DMEM с содержанием глюкозы 4 мг/мл, 1О% FBS и размножены до конфлюэнтности 6О-7О%. После этого клетки сняли с поверхности, рессу-спендировали и однократно отмыли в 3О мл буфера PBS/ BSA, клеточный осадок рессуспендировали в 1 мл буфера, подсчитали количество клеток и перенесли по 5ОО ООО клеток в пробирки 1,5 мл. Двукратно отмывали 1 мл DPBS, после последней отмывки супернатант удаляли полностью и осадок клеток рессуспендировали в буфере для транс-фекции. Клетки трансфецировали 3 мкг eCas9n плазмидной ДНК, 1 мкг каждой из двух gRNA с использованием системы электропорации Neon (Invitrogen, США) (2 импульса 2О мс при 1350V).
После трансфекции клетки помещали в обработанный коллагеном 6-луночный планшет в полной среде DMEM. Через сутки удаляли неадгезированные клетки, оставшиеся клетки пересевали в 1О см чашки Петри. Через 3 сут анализировали экспрессию CD44 в культуре клеток и проводили первый раунд сортировки на проточном цитометре FACS ARIAII с программным обеспечением DIVA. Для этого суспензию клеток окрашивали моноклональными антителами к CD44 (BioLegend, Кат.№ 1О3О3О, США) и DAPI. В канале DAPI выделяли область живых клеток, далее эту популяцию анализировали в канале PerCP/C7. В качестве положительного контроля экспрессии CD44 применяли NIH/3T3 дикого типа (NIH/3T3-WT), в качестве отрицательного контроля использовали клетки без окрашивания антителами к CD44. Популяцию клеток со сниженной экспрессией CD44, полученную в результате сортировки, культивировали стандартным образом в течение 14 дней, пересевая при 6О-7О% кофлюэнтости, после этого повторно сортировали, как описано выше. Через 4 дня после второй сортировки культуру нокаутных клеток анализировали методом проточной цитофлюориметрии. Полученные нокаутные клетки были размножены и помещены в заморозку в аликвотах 1 ООО ООО клеток/мл в суспензии, в FBS с DMSO 5%. Во всех описанных экспериментах использовали клетки из разморозки, не более 3—5-го пассажа, аналогично как для NIH/3T3-WT.
Дифференцировка культуры. Для исследования влияния препарата ТДП и цитокина TGF-ß1 на дифференцировку фибробластов, клетки NIH/3T3 высеивали на слайд-камеры
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
со стеклянной поверхностью (SPL Life Sciences Co., Корея), обработанной коллагеном 1-го типа (rat tail collagen, Sigma Кат.№> С3867, США) (10мкг/см2), в плотности 3000 клеток/ см2 в среде DMEM с содержанием глюкозы 4 мг/мл, 10% FBS. Через 18 ч после адгезии клеток среду убирали, клетки промывали тёплым буфером PBS/BSA и проводили старвинг 24 ч в среде DMEM с 2% FBS. После старвинга среду отбирали, добавляли свежую среду с активаторами ТДП (10 мкг/мл) (ООО «Иммафарма», Россия) или TGF-ß1 (5нг/мл) (Sigma Кат.№ T7039, США), в контрольные лунки активатор не добавляли. Дифференцировку выполняли 48 ч, через каждые 24 ч осуществляли смену среды.
Микроскопия. Для исследования дифференцировки фибробластов под влиянием ТДП и TGF-ß1 окрашивали специфичный маркер дифференцированных миофибро-бластов - alpha smooth muscle actin (a-SMA) и визуализацию окрашенных клеток на конфокальном микроскопе Carl Zeiss AxioObserver Z.1. Для этого после эксперимента клетки промывали теплым PBS/BSA, фиксировали 4% PFA 37 °C 20 мин, промывали DPBS двукратно 500 мкл, премеа-билизировали 0,1% раствором сапонина в PBS и окрашивали моноклональными антителами, конъюгированными с флуоресцентной меткой FITC (Кат.№ ab8211, Abcam, США) в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем отмывали от избытка антител трехкратно 500 мкл DPBS. К окрашенным образцам добавляли протектор окрашивания Prolong Gold Anti-Fade Reagent (CST, Кат.№ 8961, США), содержащий краситель DAPI для окрашивания ядер, закрывали препарат покровным стеклом и проводили визуализацию окрашенных структур цитоскелета. Для визуализации фос-форилированных форм киназ ERK1/2 клеточные препараты готовили согласно протоколу производителя антител. Фи-бробласты были посеяны на слайд-камеры со стеклянной поверхностью (SPL Life Sciences Co., Корея), обработанной коллагеном, в плотности 50 000 клеток/см2 в среде DMEM с содержанием глюкозы 4 мг/мл, 10% FBS. Через 18 ч после адгезии клеток среду убирали, клетки промывали тёплым буфером PBS/BSA, и выполняли старвинг 24 ч в среде DMEM с 2% FBS. После старвинга среду отбирали, добавляли свежую среду с активаторами ТДП (10мкг/мл) (ООО «Иммафарма», Россия) или TGF-ß1 (5нг/мл) (Sigma Кат.№ T7039, США), в контрольные лунки активатор не добавляли. По завершению эксперимента клетки промывали теплым PBS, фиксировали 4% PFA 37 °С 20 мин, промывали PBS двукратно 500 мкл, премеабилизировали ледяным 96% метанолом на льду 20 минут, после чего клетки промывали PBS двукратно 500 мкл и инкубировали 1 ч в PBS, содержащем 0,5% BSA. Фиксированные и премеабилизированные клетки инкубировали 18 ч при +40 °С с моноклональными антителами anti-phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/ Tyr204) (D13.14.4E) XP® (CST, Кат.№ 4695; Кат.№ 4370, США) в буфере для забивки (разведение антител 1:200). После чего клетки отмывали трижды по 5 мин на шейкере в 500 мкл PBS/BSA, затем окрашивали вторичными антителами goat anti-rabbit IgG (H+L), конъюгированными с флуоресцентной меткой Alexa Fluor 488 в разведении 1:300 (Life technologies, Кат.№ A11034, США). Инкубировали 1 ч при комнатной температуре и двукратно промывали 500 мкл PBS/BSA. К полученным образцам добавляли протектор окрашивания Prolong Gold Anti-Fade Reagent (CST, Кат.№ 8961, США), содержащий краситель DAPI для окрашивания ядер, закрывали препарат покровным стеклом и проводили визуализацию клеток на конфокальном микроскопе Carl Zeiss AxioObserver Z.1.
Количественный анализ изображений. Для анализа степени дифференцировки культуры для каждого экспериментального варианта проводили съёмку 10-15 полей при увеличении х20. Изображения сохраняли в формате tiff и использовали для анализа в программе ImageJ 1.48v. В канале
Dapi определяли маску для ядер клеток и, используя макро Analyze Particles, подсчитывали общее количество клеток. Затем в канале FITC в мануальном режиме считали количество клеток, содержащих a-SMA-позитивные волокна в структуре цитоскелета. В поле просчитывалось 60-90 клеток. Вычисляли процентное содержание дифференцированных клеток в поле как отношение клеток, содержащих a-SMA-филаменты, к общему количеству клеток.
Для анализа фосфорилирования киназ ERK1/2 измеряли среднее значение флюоресценции. Для каждого экспериментального варианта проводили съёмку 10-15 полей при увеличении х20. Для анализа изображений предварительно вычитали фоновое значение флюоресценции для каждого изображения с помощью макро ImageJ-macro «Intensity Ratio Nuclei Cytoplasm Tool», используя параметры настройки: radius=1; offset=1; iterations=1, затем автоматически вычисляли среднее значение интенсивности для всего изображения, как описано [25]. Проведено 3 независимых эксперимента, в поле съёмки просчитывалось 35-50 клеток, приведено среднее значение для экспериментов. Значение флюоресценции опытных образцов нормировали на значение флюоресценции контрольных образцов для каждого эксперимента.
Вестерн-блоттинг. Для анализа экспрессии a-SMA белка в дифференцированных культурах фибробластов NIH/3T3 клетки были посажены в плотности 3000/см2 в 6-луночный плейт (LUX tissue culture), обработанный коллагеном, после адгезии клеток был проведён старвинг и 48 ч активации (описано выше). Для анализа динамики экспрессии фосфорилированной и общей формы белков SMAD2 и ERK1/2 в культуре фибробластов NIH/3T3 при активации цитокином TGF-ß1 и ТДП клетки были посажены в плотности 50 000/см2 в среде DMEM с содержанием глюкозы 4 мг/мл, 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в 6-луночный плейт (LUX tissue culture), обработанный коллагеном, Через 18 ч после адгезии клеток среду убирали, клетки промывали тёплым буфером PBS/BSA и проводили старвинг 24 чв среде DMEM с 2% FBS. После старвинга среду отбирали, добавляли свежую среду с активаторами ТДП (10мкг/мл) (ООО «Иммафарма», Россия) или TGF-ß1 (5нг/мл) (Sigma Кат.№Т7039, США), в контрольные лунки активатор не добавляли. По завершении эксперимента культуральную среду удаляли, промывали клетки на льду холодным раствором DPBS 3 раза, убирали остатки буфера и лизировали клетки в 100 мкл буфера (Invitrogen, Cell Extraction Buffer, Кат.N^FNN0011) в присутствии ингибиторов протеаз (Sigma, P2714-1BTL) 30 мин при 4°C. Клеточные экстракты осаждали на центрифуге (Eppendorf 5424R, Germany) (14,000 rpm, 10 мин, 4 °C), отбирали супернатан-ты и измеряли в них концентрацию белка с использованием коммерческого набора (Pierce, Protein Assay Reagent, Кат.№ 23225). Полученную смесь клеточных белков (10 мкг) разделяли в 8% SDS-PAGE и переносили на PVDF-мембрану (Amersham Hybond-P). Для детекции целевых белков мембрану последовательно в течение 1 ч инкубировали с первичными антителами к a-SMA (Abcam, Кат.№ ab5694, США), pSMAD2/3 (Pho spho - Smad2 (Ser465/467)/Smad3 (Ser423/425) CTS, Кат.№ 8828, США), pErk1/2 (T202/204) (CST, Кат.№ 4370, США) в разведении 1:1000 и GAPDH (Abcam, Кат.№ ab8245) в разведении 1:2000, а затем с вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена в разведении 1:1000000 (Sigma, Кат.№ A0545-1ML). Визуализацию результатов осуществляли методом хемилю-минесценции (SuperSignal West Femto Maximum sensitivity, Pierce Кат.№ 34095). Интенсивность белковых полос анализировали с помощью программы ImageJ 1.48v. Для этого в полученных изображениях в формате tiff, разрешением 8-bit выделяли анализируемые белковые полосы, затем, используя макро Analase Gels, получали пики интенсивности для каждой белковой полосы и вычисляли площади пиков.
ORIGINAL ARTICLE
Полученные значения для целевого белка приводили в отношении к значениям нормировочного белка GAPDH. Для каждого экспериментального варианта исследовали 2 лунки, всего было проведено 3 независимых эксперимента -приведено среднее по экспериментам.
ПЦР-РВ. Клетки NIH/3T3 были посажены на обработанный коллагеном 96-луночный плейт в плотности 3,000/ см2, культивировали 18 ч в полной среде ДМЕМ 10% FBS, затем меняли среду на ДМЕМ 2% FBS и проводили старвинг 24 ч. После старвинга среду отбирали, добавляли свежую среду с активаторами ТДП (10мкг/мл) (ООО «Иммафарма», Россия) или TGF-P1 (5нг/мл) (Sigma Кат.№ T7039, США), в контрольные лунки активатор не добавляли. Клетки инкубировали 24 ч в культуральном термостате при 370C и 5% CO2. По окончании эксперимента убирали среду, добавляли 100 мкл лизирующего буфера, содержащего гуанидин изотиацианат в каждую лунку плейта, после чего лизат трех лунок объединяли в одну пробу. Затем выделяли РНК коммерческим набором «РНК-Экстран» («Синтол», Россия), согласно инструкции производителя. Принцип выделения РНК основан на кислой фенольной экстракции и спиртовой преципитации по Хомчинскому. Осадок нуклеиновых кислот растворяли в 10 мкл mQ, обработанной DEPC, далее проводили обработку ДНКазой (Thermo Scientific, Кат.№ EN0521) (1 мкл 30 мин при 370C, инактивировали ДНКазу 1 мкл 25 mM EDTA 10 мин при 65 0C). Отжиг праймера для ОТ выполняли при 65 0C 5 мин, после чего пробы немедленно охлаждали на льду. Реакцию обратной транскрипции осуществляли со специфическими праймерами для каждого гена (обратный праймер), используя коммерческий набор реагентов для обратной транскрипции («Синтол», Россия), реакцию проводили, согласно инструкции производителя. Полученную кДНК использовали для ПЦР в режиме реального времени. Постановку ПЦР проводили в дублях, в анализе использовали среднее значение порогового цикла (Cp) дублей. Последовательности праймеров и зондов (синтез «Синтол», Россия), приведены в табл. 1.
Для ПЦР и детекции флюоресценции использовали детектирующий амплификатор DTprime4 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия) с программным обеспечением, предоставляемым производителем прибора (RealTime_PCR v.7.3). Программа амплификации: 94 0С-5 мин 94 0С-10 сек
62 0С-20 сек* 40 циклов
72 0С-5 сек 10 0С - хранение
Примечание. * - на этом этапе измеряют флюоресценцию.
Уровень относительной экспрессии мРНК целевых генов вычисляли, используя ДДСр метод, по формуле [26]:
^=2(Срнорм. гена-Сриссл. гена ) где
Cp (норм. гена) - значение порогового цикла нормировочного гена, автоматически определяемое прибором (среднее по дублям); Cp (иссл. гена) - значение порогового цикла исследуемого гена, автоматически определяемое прибором (среднее по дублям).
В качестве нормировочного гена использовали ß-actin. Для каждого опыта вычисляли отношение значения экспрессии исследуемого гена в активированных образцах к контрольному значению.
Выполнено три независимых эксперимента, приводится среднее по экспериментам.
Скратч-тест. Для исследования влияния препарата ТДП на подвижность клеток в скратч-тесте в 96-луночный плейт, обработанный коллагеном, клетки высеивали в плотности 100 клеток/см2 в среду DMEM с 2% FBS, после 18 ч культивирования среду убирали, клетки промывали тёплым PBS/BSA, на монослой клеток носиком для пипетки на 200 мкл наносили царапину по центру лунки, располагая носик строго перпендикулярно дну лунки. Лунки промывали дважды 200 мкл тёплым PBS/BSA, для того чтобы убрать повреждённые и открепившиеся от подложки клетки из области царапины, добавляли 100 мкл свежей среды DMEM с 2% FBS и проводили фотографирование каждой лунки с использованием микроскопа Opton ICM 405 (Carl Zeiss, Германия) и камеры Levenhuk C800 (Китай). Затем плейт помещали в культуральный термостат на 30 мин. После этого добавляли 100 мкл среды с активаторами, в контрольные лунки активаторы не добавляли. После 6 ч инкубации проводили повторную съёмку лунок в том же самом поле обзора. На дно лунки с внешней стороны плейта наносили царапину острием иголки, что позволяло с высокой точностью сопоставлять изображения лунки в нулевой точке эксперимента и по завершении эксперимента. Два изображения одной лунки накладывали одно на другое, сопоставляя заранее нанесённый маркер, выделяли область, свободную от клеток в точках 0 ч и 6 ч, после чего вычисляли площадь этой области. Скорость клеток за единицу времени рассчитывали по формуле где
v=(s1-s2)/2-lh
si - площадь области, свободной от клеток, в начале эксперимента;
s2 - площадь области, свободной от клеток, по завершении эксперимента;
l - длина царапины;
h - время эксперимента.
Для определения количества клеток, вышедших в зону царапины, в программе ImageJ 1.48v наносили маркеры на клетки, находящиеся в границах области повреждения, далее в автоматическом режиме подсчитывали количество этих маркеров. Плотность клеток в области повреждения рассчитывали как отношение полученного значения (количества клеток) к разнице площадей S1-S2.
Проведено 3 независимых эксперимента, в которых исследовали по 6 лунок каждого варианта. Приводится среднее по трём экспериментам.
Статистический анализ. Для сравнения результатов
Последовательности праймеров и зондов для ПЦр-рв
Таблица 1
Ген
Последовательность олигонуклеотидов 5'-3'
Длина продукта, п.н. Учётный номер последовательности
(FORWARD) AGAGGGAAATCGTGCGTGAC 138
P-actin (REVERSE) CAATAGTGATGACCTGGCCGT
(PROBE) FAM-CACTGCCGCATCCTCTTCCTCCC-RTQ
(FORWARD) TCAGGGAGTAATGGTTGGAATG 112
a-sma (REVERSE) GGTGATGATGCCGTGTTCTA
(PROBE) FAM-CCTCTCTTGCTCTGGGCTTCATC-RTQ
(FORWARD) TGACGTCACTGGAGTTGTACGG 140
tgf-pi (REVERSE) GGTTCATGTCATGGATGGTGC
_(PROBE) FAM-TTCAGCGCTCACTGCTCTTGTGACAG-RTQ_
NM 007393
NM 007392
NM 011577
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
в опытных и контрольных группах использовали парный t-test Стьюдента, достоверными различия считали при р<0,05.
Результаты
Для получения нокаутных по CD44 ЖН/3Т3 использовали технологию CRISPR-CAS9. Клетки дикого типа экспрессируют CD44 на 100% популяции (рис. 1, а). Для получения чистой популяции клеток с отсутствием рецептора CD44 проведено два раунда сортировки клеток FACS. Через трое суток после трансфекции наблюдалли снижение экспрессии CD44 в 70% популяции клеток (рис. 1, б). Методом FACS-сортировки была обогащена популяция клеток, лишённых CD44. После первого раунда сортировки и 14 дней культивирования клеток со сниженной экспрессией CD44-рецептора в полученной культуре клеток содержалось 3% CD44-позитивных и 97% CD44-негативных клеток (см. рис. 1, б). Для достижения максимальной чистоты культуры нокаута осуществили повторную сортировку, в результате которой чистота культуры нокаута достигла 99,9% (см. рис. 1, б). Микрофотографии на рис. 1 демонстрируют морфологию клеток нокаутной культуры CD44KO и морфологию клеток ЖЫ/3Т3 дикого типа при равнозначной плотности культуры. Культура клеток, нокаутных по рецептору CD44, морфологически не отличалась от культуры клеток дикого типа.
Далее на полученной сублинии CD44KO-фибробластов исследовали молекулярные механизмы активации под действием ТДПа и TGF-pl для оценки роли CD44-рецептора в процессах активации и дифференцировки фибробластов.
Известно, что рецептор к гиалуроновой кислоте играет важную роль в процессах активации, перестройки цитоскелета и изменения клеточной подвижности. В предыдущем исследовании нами показано, что ТДП ускоряет движение фибробластов в модели заживления повреждения монослоя - «скратч-тесте»
а
CD44WT
№ сЛр»
"i- 100%
V к1 и* СОИ РЕ-С*?-А 2'
6^ CD44WT
ш я # .1 Ш ДШ]
CD44KO
б
CD44KO
£ :о« itwi i -n CD«to
о »9- m 30%
£ „» ц" С0«Р£-Су?-А #
Д 1 сортировка
щ tfl CW4»
о*■ J \ 97« ч
— ____ -
i' »' COKP&Cyi-A
2 сортировка
Count JH ;D(4kw CO«»
tr a* CW< Р£-Су7А ill1)« i ¡¡l
Рис. 1. Получение культуры СЭ44КО ШЫ/3Т3 фибробластов. Гистограмма распределения флюоресценции в канале РЕ/Су7 для клеток дикого типа, окрашенных антителами к СЭ44 (а); гистограмма распределения флюоресценции в канале РЕ/Су7 для нокаутной культуры, окрашенной антителами к СЭ44 через трое суток после трансфекции (верхний рисунок), через 14 суток после первой сортировки (средний рисунок) и через трое суток после второй сортировки (нижний рисунок) (б); микрофотографии клеточных культур фибробластов ШЫ/3Т3 дикого типа и нокаутных по СЭ44 (в).
а Контроль
ТДП
TGF-P1
б
-| 60 5
40 -
20 -
CD44WT
CD44KO
Рис. 2. Влияние рецептора CD44 на скорость заживления повреждения in vitro. Микрофотографии типичных полей «скратч-теста» через 6 часов после нанесения повреждения и инкубации в присутствии активаторов ТДП (10мкг/мл) и TGF-P1 (5нг/мл) для фибробластов NIH/3T3 CD44WT и CD44KO (а); количественный анализ скорости движения клеток в «скратч-тесте» (N=3, n=6,p<0,05) (б).
0
а
CD44WT
pERK1/2 AF488 DAPI DIC
Merge
CD44WT
ТДП
5 30
60
TGF-ß1
5 30 60
б CD44KO
ж
JP ¡Г* tum т
pERK1/2 AF488 DAPI DIC
Merge
CD44KO
ТДП
5 30
60
TGF-ß1
5 30 60
в
™ 2
ORIGINAL ARTICLE
CD44WT
О g с -& 0
*
_
*
uQ
л<?
ps
CD44KO
cc 2
mi
О Î2 с -& 0
ш
Л<?
,os
J
<JiL
□c 3
" i CQCN S
« 2
Pu I
0 5 30 60 Время экспозиции, мин
Ее 3
" I
ta т— <С
S 2
I
iu 2 га _
х g g 1
!" S ü
S ю га
0 5 30 60 Время экспозиции, мин
0 5 30 60 Время экспозиции, мин
□с 3
" I
m с^ <
« 2 Ï» н |
«S«
х с s
® 15 Ü
S ю га
1
0 5 30 60 Время экспозиции, мин
2
0
0
0
0
0
Рис. 3. Активация МАРК-сигнального пути в фибробластах ШН/3Т3 CD44WT и CD44KO при действии ТДП и цитокина TGF-PL Конфокальные изображения типичных полей культур CD44WT (а) и CD44KO (б) при пятиминутной экспозиции пептидом Гепон (10мкг/мл) и TGF-P1 (5нг/мл), окрашенных антителами к фосфорилированной форме киназ ERK1/2, ядра - DAPI; количественный анализ эпифлюоресценции в канале FITC клеток, окрашенных AF488 мечеными антителами к фосфорилированной форме киназ ERK1/2 CD44WT (в) и CD44KO (г) при пятиминутной экспозиции активаторов (для анализа использовали 10-15 изображений для каждого варианта (N=2, _р<0.05)); денситограмма вестерн-блоттинга экстрактов контрольных и активированных образцов ШН/3Т3 фибробластов CD44WT (д) и CD44KO (е); количественный анализ денситограмм - нормированное на GAPDH содержания белков pERK1 и pERK2 в динамике активации ШН/3Т3 фибробластов CD44WT (ж) и CD44KO (з) (N=3, p < 0,05).
[1]. Для исследования участия СБ44 в этом процессе мы использовали СБ44КО №Б/3Т3. Для этого на монослой клеток наносили повреждение, как описано в методике, и оценивали скорость закрытия этого повреждения. На рис. 2, а представлены фотографии повреждения через 6 ч действия активаторов - ТДП (10мкг/мл) и цитокина TGF-pl (5 нг/мл) (синяя линия проведена по границе монослоя клеток в начале эксперимента, красная - по окончании эксперимента). Исследование скорости заживления повреждённого монослоя показало, что в культуре нокаутных по СБ44 рецептору клеток скорость движения фибробластов существенно выше и составляет 44,6±1,9 мкм/ч, в то время как в культуре дикого типа это значение - 22,2±1,0 мкм/ч (рис. 2, б). При действии пептида ТДП в клетках дико-
го типа наблюдали увеличение скорости движения клеток до 29,1±1,0 мкм/ч. В нокаутных клетках увеличения скорости движения при действии пептида не наблюдали, скорость движения клеток составила 43,1±2,3 мкм/ч. Присутствие цитокина TGF-Р1 не оказывало влияния на изменение скорости движения ни в клетках дикого типа, ни в нокаутных клетках.
Далее нами исследовано участие СБ44 в активации МАРК- сигнального пути при действии ТДП и цитокина TGF-Р1. Известно, что этот сигнальный путь связан с активацией и контролем клеточного движения, а также показана связь СБ44 с активацией ЕКК1/2 сигнального пути. Методами конфокальной микроскопии и Вестерн-блоттинга исследовано фосфори-лирование киназ ЕКК1 и ЕКК2 при действии ТДП и цитокина
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
б
а
CD44WT
CD44KO
^
S I
Ä (D
s
И
- i е I ц ь? Й 6
50
25
4-°
а<?
го
ä 1? О
V СР
S d
« х Ö £ ГО ГО
с
¡5 го
S £ S <
I— ^
о cé
« i
§ £
й là 2
m ^
S x =
? ï к
-о i s
<o z я
s 0£ s
*
f
X
s _ ^
S i
Ä <D
s
H
- i e I
5 6
100
75
50
25
*
T
■
4-°
A<?
ps
&
CD44WT CD44KO
Контроль ТДП TGF-ß1
CD44WT CD44KO
Контроль ТДП TGF-ß1
Рис. 4. Исследование способности нокаутов CD44KO ШН/3Т3 к дифференцировке в миофибробласты под действием пептида ТДП и TGF-Р1. Конфокальные изображение культур фибробластов NIH/3T3 CD44WT и CD44KO после 48 часов культивирования с активаторами ТДП (10мкг/мл) и TGF-P1 (5нг/мл) (волокна - a-SMA, ядра - DAPI) (а); количественная оценка дифференцирования культур под действием активаторов - % клеток, содержащих а^МА волокна в CD44WT и CD44KO (N=3, р < 0,05) (б); изменение экспрессии гена а-ята (в) и tgf-pl (г) через 24 часа активации в CD44WT и CD44KO (N=3, р < 0,05).
0
0
в
г
4
3
2
1
0
TGF-ß1 на в CD44WT и CD44KO NIH/3T3 фибробласты. Нами установлено, что ТДП также как цитокин TGF-ß1 вызывает активацию MAPK сигнального пути с фосфорилированием киназ ERK1 и ERK2 независимо от наличия рецептора CD44. На рис. 3, а и б показаны типичные конфокальные изображения активированных клеток CD44WT и CD44KO NIH/3T3 при пятиминутной экспозиции ТДП (10 мкг/мл) и цитокина TGF-ß1 (5 нг/мл), окрашенных специфичными антителами к фосфорилированной форме киназ ERK1 и ERK2. Количественную оценку проводили с использованием среднего значения флюоресценции, как описано в методике. Установлено, что при 5-минутной экспозиции как в клетках дикого типа, так и в нокаутах по CD44 увеличивается содержание фосфорилиро-ванной формы киназ ERK1 и ERK2. При действии ТДП среднее значение флюоресценции увеличено в 1,2±0,05 раза, а при действии TGF-ß1 в 1,5 (±0,1) раза для фибробластов CD44WT и в 1,3±0,2 раза при действии ТДПа и в 1,6±0,3 раза при действии TGF-ß1 в клетках CD44KO соответственно (рис. 3, в, г). Для исследования кинетики фосфорилирования киназ ERK1 и ERK2 использовали метод Вестерн-блоттинга. Как видно на денситограммах (рис. 3 д, е), кинетика фосфорилирования для CD44WT и CD44KO NIH/3T3 имеет общий характер с выра-
женным пиком фосфорилирования на 5 мин действия обоих активаторов. Количественный анализ денситограмм показал, что изменение уровня содержания фосфорилированной кина-зы ERK1 при действии препарата ТДП составило 2,1±0,3 раза в клетках CD44WT и 2,9±0,5 раза в CD44KO, при действии цитокина TGF-ß1 это значение было 2,2±0,1 раза в клетках CD44WT и 2,4±0,1 раза в CD44KO. Изменение содержания фосфорилированной киназы ERK2 при действии препарата ТДП составило 1,6±0,3 раза в клетках CD44WT и 2,2±0,2 раза в CD44KO, при действии цитокина TGF-ß1 это значение было 1,8±0,4 раза в клетках CD44WT и 2,4±0,1 раза в CD44KO (рис. 3 ж, з). Затем происходит снижение количества фосфо-рилированных киназ и при часовой экспозиции сравнивается с контрольным значением в неактивированных клетках (рис. 3, ж, з). Таким образом, количественные изменения в фосфори-лировании киназ ERK1 и ERK2 при действии ТДП и цитокина TGF-ß1 не зависят от наличия рецептора CD44.
Далее, мы исследовали участие рецептора CD44 в диффе-ренцировке культуры NIH/3T3 фибробластов в миофибробласты под действием ТДП и цитокина TGF-ß1. Нами установлено, что CD44KO, так же как клетки дикого типа при действии ТДП и цитокина TGF-ß1, дифференцируются в миофибробласты с
а
CD44WT TGF-ß1 ТДП
5 30 60 0 5 30
б
60
CD44KO TGF-ß1 ТДП
5 30 60 0 5 30
60
P-SMAD2 GAPDH
в
P-SMAD2 GAPDH
SMAD2 GAPDH
м - *
О
J N<
ü<C го >-2 I <u (Л к
<D го
X ^
-о- ТДП -®-TGF-ß1
Время экспозиции, мин
Время экспозиции, мин
Рис. 5. Активация 8МАЭ сигнального пути в фибробластах ШЫ/3Т3 CD44WT и СЭ44КО при действии ТДП и цитокина TGF-P1. Временная кинетика экспрессии общей и фосфорилированной формы белка SMAD2 в фибробластах линии ШЫ/3Т3 CD44WT и CD44KO при активации пептидом ТДП (10мкг/мл) и цитокином TGF-P1 (5 нг/мл). Денситограмма вестерн-блоттинга экстрактов контрольных и активированных образцов CD44WT (а) и CD44KO (б); количественный анализ денситограмм - нормированное на GAPDH содержание pSMAD2 в динамике активации ШЫ^З фибробластов CD44WT (в) и CD44KO (г) (N=2, р < 0,05).
увеличением числа дифференцированных клеток, содержащих а^МА волокна (рис. 4, а). Необходимо отметить, что в наших экспериментах процент спонтанной дифференцировки в контрольных образцах СБ44КО выше, чем в образцах дикого типа и составлял 2,1±0,6% и 4,7±1,5% для CD44WT и СБ44КО соответственно. Также при активации в нокаутированных клетках процент клеток, содержащих а^МА-позитивные волокна был выше как при действии ТДП, так и при действии цитоки-на TGF-pl. При действии ТДП процент клеток, содержащих а^МА-волокна был 14,6±2,0% для CD44WT и 31,3±3,3% для СБ44КО, а при действии цитокина TGF-pl это значение составило 34,3±3,6% и 70,1 ±3,7% для CD44WT и СБ44КО соответственно (см. рис. 2, б). Установлено, что относительная экспрессия мРНК гена а^та при действии ТДП на фибробласты через 24 ч увеличивается в 1,6±0,1 раза в клетках дикого типа и в 2,0±0,3 раза в клетках, нокаутных по СБ44. При действии цитокина TGF-pl увеличение экспрессии гена а^та составило в 3,2±0,2 раза и в 4,0±0,2 раза для CD44WT и СБ44КО соответственно (рис. 4, в). Изменение относительной экспрессии мРНК гена tgf-в1 обнаружено только при действии цитокина TGF-pl как на клетки дикого типа, так и на нокаутные клетки, это изменение составило 2,3±0,5 раза и 2,3±0,4 раза для С044^Т и СБ44КО соответственно. Пептид ТДП не вызывал изменение транскрипции данного гена (рис. 4, г).
Для исследования сигнального пути SMAD в CD44WT и СБ44КО изучали кинетику фосфорилирования SMAD2 в течение первого часа действия активаторов. Выявили, что препарат ТДП не вызывает фосфорилирования SMAD2 ни в клетках дикого типа, ни в нокаутных образцах (рис. 5, а,
ORIGINAL ARTICLE
б). При действии цитокина TGF-ß1 активация SMAD сигнального пути от рецептора TGF-ß1 сохраняется в нокаутных клетках. При 30-минутной экспозиции увеличение фосфорилирования наблюдается в 2,4±0,1 раза для CD44WT и в 2,1±0,1 раза для CD44KO (рис. 5, в, г). Таким образом, нами установлено, что ТДП не активирует SMAD-сигнальный каскад по классическому пути от рецептора TGF-ß, тогда как сам цитокин TGF-ß1 вызывает фосфорилирование транскрипционного фактора SMAD2 в течение первого часа активации в CD44WT и CD44KO.
Обсуждение
Хорошо известно, что CD44-рецептор играет важную роль в клеточной адгезии, взаимодействии клетки с матриксом, клеточном движении, связанном с миграцией и инвазией [12, 14, 27-28]. В нашей работе было показано, что нокаутирование CD44 оказывало существенное влияние на скорость движения фибро-бластов в модели повреждения монослоя. Это согласуется с рядом работ, в частности с работой Acha-rya P.S. и соавт. [29], в которой было показано, что фибробласты с нарушением транскрипции CD44 при действии siRNA увеличивали скорость движения, но теряли направленность движения. В работе Tsuneki M. и соавт. [30] установили, что нокаутирование рецептора CD44 в фибробластах приводит к увеличению миграции клеток через 8 мкм Transwel и усилению инвазии клеток через мембрану, обработанную Matrigel. В предыдущих исследованиях нами было показано увеличение скорости движения фибробластов NIH/3T3 при действии ТДП в тесте «заживления» поврежденного клеточного монослоя. Однако в культуре фибробластов, нокаутных по CD44, увеличения скорости движения фибробластов не наблюдалось. По-видимому, лишенные CD44-рецепторов фибробласты движутся с предельно возможной для этих клеток скоростью и дополнительная активация этих клеток тетрадекапептидом не приводит к дополнительному ускорению их движения.
Как оказалось, отсутствие ускоряющего влияния ТДП на клетки CD44KO не означало отсутствия их активации. Под влиянием ТДП в клетках CD44KO активировался сигнальный MAPK-каскад (см. рис. 3) и происходила дифференци-ровка CD44KO-фибробластов в CD44KO-миофибробласты (см. рис. 4).
В литературе широко обсуждается роль компонентов внеклеточного матрикса в процессах активации и дифференци-ровки фибробластов [7, 8]. В ряде работ исследовано участие рецептора CD44 в дифференцировке миофибробластов [25, 29, 32, 33]. В частности, в работе Simpson R.M. и соавт. [32] показано, что при использовании siRNA к CD44 нарушается
0
0
2
3
2
0
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
способность фибробластов к дифференцировке в миофибробласты, а так же отсутствует фосфорилирование ERK киназ при действии TGF-pi. Отличие наших наблюдений от результатов Simpson R.M. [32] может быть связано с использованным типом клеток - наши эксперименты были проведены на линии эмбриональных фибробластов NIH/3T3, а не на клетках первичных культур.
В нашей работе активация ERK-киназ и дифферен-цировка фибробластов в миофибробласты происходили одинаково хорошо в культурах фибробластов NIH/3T3 дикого типа и CD44KO, т. е. не зависели от наличия или отсутствия CD44-рецепторов. При действии тетрадекапептида TEKKRRETVEREKE или цитокина TGF-pi фибробласты CD44KO и клетки NIH/3T3 дикого типа дифференцировались в миофибробласты с приобретением характерных клеточных размеров и формы, и реорганизацией цитоскелета с образованием сократительных a-sma-микрофиламент.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ЛИТЕРАТУРА (пп. 6-33 см. В REFERENCES)
1. Чулкина М.М, Лебедева Е.Л., Холмухамедов Э.Л., Атауллаханов Р. И. Гомолог шарнирной области эзрина тетрадекапептид (TEKKRRETVEREKE) активирует дифференцировку фибробластов линии NIH/3T3. Иммунология, 2017; 38(1): 4-11.
2. Чулкина М.М., Лебедева Е.С., Пичугин А.В., Холмухамедов Э.Л., Ата-уллаханов Р.И. Индуктор регенерации тетрадекапетид (TEKKRRET-VEREKE) активирует MAPK-киназный сигнальный путь в NIH/3T3 фибробластах. Иммунология, 2017; 38(4): 172-9.
3. Дудченко М.А., Лысенко Б.Ф., Челишвили А.Л., Катлинский А.В., Атауллаханов Р.Р. Комплксное лечение трофических язв. Лечащий врач. 2002; 10: 72-5.
4. Лазебник Л.Б., Звенигородская Л.А., Атауллаханов Р.И., Пичугин А.В., Чикунова Б.З., Фирсакова В.Ю. Иммуномодулятор Гепон у бол-ных пожилого возраста с эрозивно-язвеннми поражениями гастродуо-денальной зоны Русский медицинский журнал. 2004; 12(23): 1349-52.
5. Кириенко А.И., Атауллаханов Р.И., Богачёв В.Ю., Богданец Л.И., Пичугин А.В., Журавлёва О. Трофические язвы венозной этиологии и их связь с иммунным статусом. Аллергология и сосудистая хирургия. 2007; 13(1): 76-85.
REFERENcES
1. Chulkina M.M., Lebedeva E.S., Holmuhamedov E.L., Ataullakhanov R.I. Ezrin hinge region peptid TEKKRRETVEREKE mediated fibroblast to myofibroblast differentiation in NIH/3T3 cells. Immunologiya. 2017; 38(1): 4—11. (in Russian)
2. Chulkina M.M., Lebedeva E.S., Pichugin A.V., Holmuhamedov E.L., Ataullakhanov R.I. Ezrin hinge region peptid TEKKRRETVEREKE stimulated Mitogen-Activated Protein Kinase/Extracellular-Signal-Regulated Kinase (MAP kinase/ERK) activity in murine fibroblast NIH/3T3. Immunologiya. 2017, 38(4): 172-9. (in Russian)
3. Dudchenko M.A., Lysenko B.F., Chelishvili A.L., Katlinski A.V., Ataullakhanov R.R. Combination therapy of trophic ulcers. Lechashchiy vrach. 2002; 10: 72-5. (in Russian)
4. Lazebnik L.B., Zvenigorodskaia L.A., Firsakova V., Pichygin A.V., Ataullakhanov R.I. Use of the immunomodulator hepon in the treatment of erosive peptic ulcer lesions. Eksperimental'naya i klinicheskaya gastroenterology.. 2003; 3: 17-20. (in Russian)
5. Kirienko A.I., Ataullakhanov R.I., Bogachev V., Bogdanets L.I., Pichugin A.V., Zhuravleva O.V. Trophic venous ulcers and their relationship with the immune status. Angiologiya i sosudistaya khirurgiya. 2007; 13(1):76-85. (in Russian)
6. Sixt M. Cell migration: fibroblasts find a new way to get ahead. J. Cell Biol. 2012; 197(3): 347-9. doi: 10.1083/jcb.201204039.
7. Klingberg F., Hinz B., White E.S. The myofibroblast matrix: implications for tissue repair and fibrosis. J. Pathol. 2013; 229(2): 298-309. doi:10.1002/path.4104.
8. Tracy L.E., Minasian R.A., Caterson E.J. Extracellular Matrix and Dermal Fibroblast Function in the Healing Wound. Adv. Wound Care (New Rochelle). 2016; 5(3):119-36.
9. Cichy J., Pure E. The liberation of CD44. J. Cell. Biol. 2003; 161: 839-43. 10. Mythreye K., Blobe G.C. Proteoglycan signaling co-receptors: Roles in
cell adhesion, migration and invasion. Cell Signal. 2009; 21: 1548-58.
11. Kirschner N., Haftek M., Niessen C.M., Behne M.J., Furuse M., Moll I., Brandner J.M. CD44 regulates tight-junction assembly and barrier function. J. Invest Dermatol. 2011; 131: 932-43.
12. Hiraga T., Ito S., Nakamura H. Cancer stem-like cell marker CD44 promotes bone metastases by enhancing tumorigenicity, cell motility, and hyaluronan production. Cancer Res. 2013; 73: 4112-22.
13. Seiki M. The cell surface: The stage for matrix metalloproteinase regulation of migration. Curr Opin. Cell. Biol. 2002; 14: 624-32.
14. Twarock S., Tammi M.I., Savani R.C., Fischer J.W. Hyaluronan stabilizes focal adhesions, filopodia, and the proliferative phenotype in esophageal squamous carcinoma cells. J. Biol. Chem. 2010; 285: 23276-84.
15. Mellor L., Knudson C.B., Hida D., Askew E.B., Knudson W. Intracellular domain fragment of CD44 alters CD44 function in chondrocytes. J. Biol. Chem. 2013; 288: 25838-50.
16. Misra S., Hascall V.C., Markwald R.R., Ghatak S. Interactions between Hyaluronan and Its Receptors (CD44, RHAMM) Regulate the Activities of Inflammation and Cancer. Front. Immunol. 2015; 6: 201. doi: 10.3389/ fimmu.2015.00201.
17. Piotrowicz R.S., Damaj B.B., Hachicha M., Incardona F., Howell S.B., Finlayson M. A6 peptide activates CD44 adhesive activity, induces FAK and MEK phosphorylation, and inhibits the migration and metastasis of CD44-expressing cells. Mol. cancer therapeutics. 2011; 10(11): 207282. doi: 10.1158/1535-7163.MCT-11-0351.
18. Yang X., Sarvestani S.K., Moeinzadeh S., He X., Jabbari E. Effect of CD44 binding peptide conjugated to an engineered inert matrix on maintenance of breast cancer stem cells and tumorsphere formation. PloS one. 2013; 8(3): e59147. doi: 10.1371/journal.pone.0059147.
19. Finlayson M. Modulation of CD44 Activity by A6-Peptide. Frontiers in immunology. 2015; 6: 135. doi: 10.3389/fimmu.2015.00135.
20. Cho S.W., Kim S., Kim J.M., Kim J.S. Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nat Biotechnol. 2013; 31(3): 230-2. doi: 10.1038/nbt.2507.
21. Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 2013; 339(6121): 823-6. doi: 10.1126/science.1232033.
22. Ran F.A., Hsu P.D., Wright J., Agarwala V., Scott D.A., Zhang F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat. Protoc. 2013; 8(11):2281-308. doi: 10.1038/nprot.2013.143.
23. Hsu P.D., Scott D.A., Weinstein J.A., Ran F.A., Konermann S., Agarwala V. et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat. Biotechnol. 2013; 31(9): 827-32. doi: 10.1038/nbt.2647.
24. Tarasevich A., Filatov A., Pichugin A., Mazurov D. Monoclonal antibody profiling of cell surface proteins associated with the viral biofilms on HTLV-1 transformed cells. Acta Virol. 2015; 59(3): 247-56.
25. Webber J., Jenkins R.H., Meran S., Phillips A., Steadman R. Modulation of TGFbeta1-dependent myofibroblast differentiation by hyaluronan. Am. J. Pathol. 2009; 175(1): 148-60. doi: 10.2353/ajpath.2009.080837.
26. Bustin S.A., Benes V., Nolan T., Pfaffl M.W. Quantitative real-time RT-PCR-a perspective., J. Mol. Endocrinol. 2005; 34(3): 597-601.
27. Bourguignon L.Y., Xia W., Wong G. Hyaluronan-mediated CD44 interaction with p300 and SIRT1 regulates beta-catenin signaling and NFkappaB-spe-cific transcription activity leading to MDR1 and Bcl-xL gene expression and chemoresistance in breast tumor cells. J. Biol. Chem. 2009; 284: 2657-71.
28. Suwan K., Choocheep K., Hatano S., Kongtawelert P., Kimata K., Wa-tanabe H. Versican/PG-M Assembles Hyaluronan into Extracellular Matrix and Inhibits CD44-mediated Signaling toward Premature Senescence in Embryonic Fibroblasts. J. Biol. Chem. 2009; 284: 8596-604.
29. Acharya P.S., Majumdar S., Jacob M., Hayden J., Mrass P., Weninger W., Assoian R.K., Puré E. Fibroblast migration is mediated by CD44-dependent TGF beta activation. J. Cell. Sci. 2008; 121(9): 1393-402. doi: 10.1242/jcs.021683.
30. Tsuneki M., Madri J.A. CD44 Influences fibroblast behaviors via modulation of cell-cell and cell-matrix interactions, affecting Survivin and Hippo pathways. J. Cell Physiol. 2016; 231(3): 731-43. doi: 10.1002/jcp.25123.
31. Knudson W., Aguiar D.J., Hua Q., Knudson C.B. CD44-anchored hy-aluronan-rich pericellular matrices: An ultrastructural and biochemical analysis. Exp. Cell Res. 1996; 228: 216-28.
32. Simpson R.M., Meran S., Thomas D., Stephens P., Bowen T., Steadman R., Phillips A. Age-related changes in pericellular hyaluronan organization leads to impaired dermal fibroblast to myofibroblast differentiation. Am. J. Pathol. 2009; 175(5): 1915-28. doi: 10.2353/ajpath.2009.090045.
33. Midgley A.C., Rogers M., Hallett M.B., Clayton A., Bowen T., Phillips A.O., Steadman R. Transforming growth factor-ß1 (TGF-ß1)-stimulated fibroblast to myofibroblasts differentiation is mediated by hyaluronan (HA)-facilitated epidermal growth factor receptor (EGFR) and CD44 co-localization in lipid rafts. J. Biol. Chem. 2013; 288(21): 14824-38. doi: 10.1074/jbc.M113.451336
34. Takeda M., Ogino S., Umemoto R., Sakakura M., Kajiwara M., Sugahara K.N. et al. Ligand-induced structural changes of the CD44 hyaluronan-bind-ing domain revealed by NMR. J Biol Chem. 2006; 281(52): 40089-95.
Поступила 11.03.18 Принята в печать 16.04.18
