CC BY
36
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017
УДК 615.276.4.03:616-001.4-08].015.44.076
Чулкина М.М.1, Лебедева Е.Л.1, Холмухамедов Э.Л.2, Атауллаханов Р.И.1
ГОМОЛОГ ШАРНИРНОЙ ОБЛАСТИ ЭЗРИНА ТЕТРАДЕКАПЕПТИД TEKKRRETVEREKE АКТИВИРУЕТ ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ ФИБРОБЛАСТОВ ЛИНИИ МН/3Т3
■Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115478, г Москва, Россия;
2Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, г. Пущино, Россия
В клинической практике успешно применяют тетрадекапептид TEKKRRETVEREKE (лекарственный препарат Гепон), копирующий фрагмент шарнирной области белка эзрина. Показана высокая эффективность местного применения этого препарата для лечения незаживающих эрозий и язв [1—3]. Механизм действия данного препарата, а также тип клеток, на который действует пептид, не известен. В работе исследовано влияние Гепона на дифференцировку фибробластов линии NIH/3T3 и способность «заживлять» in vitro повреждение монослоя клеток в scratch-тесте. В качестве контрольного активатора дифференцировки фибробластов использован цитокин TGF-P1. Установлено, что Гепон, как и TGF-P1, вызывает дифференцировку фибробластов в миофибробласты, что сопровождается увеличением размеров клеток, усилением синтеза a-SMA (alpha smooth muscle actin) и реорганизацией цитоскелета с включением данного белка в структуру микрофиламент. В контрольной неактивированной культуре клеток NIH/3T3 содержание клеток с a-SMA-микрофиламентами составляло 2 ± 0,5%, а после активации TGF-P1 или Гепоном — 34,3 ± 3,6 и 14,6 ± 2,1% соответственно. После активации Гепоном, но не TGF-P1, повышалась подвижность МН/3Т3-клеток. В scratch-тесте Гепон увеличивал в среднем на 34% скорость «заживления» повреждения клеточного монослоя. Результаты исследования показывают, что заживляющее действие лекарственного препарата Гепон может быть основано на его активирующем влиянии на фибробласты, которое индуцирует дифференцировку этих клеток в миофибробласты и повышает их подвижность в зоне повреждения.
Ключевые слова: фибробласты; регенерация; дифференцировка; миофибробласты; a-SMA, TGF-ft1; клеточное движение.
Для цитирования: ЧулкинаМ.М., Лебедева Е.Л., Холмухамедов Э.Л., Атауллаханов Р.И. Гомолог шарнирной области эзрина тетрадекапептид TEKKRRETVEREKE активирует дифференцировку фибробластов линии NIH/3T3. Иммунология. 2017; 38(1): 4-11. DOI: 10.18821/0206-4952-2017-38-1-4-11
ChulkinaM.M.1, Lebedeva E.S.1, Holmuhamedov E.L.2, Ataullakhanov R.I.1
EZRIN HINGE REGION PEPTIDE TEKKRRETVEREKE ACTIVATES NIH/3T3 FIBROBLASTS TO MYOFIBROBLASTS DIFFERENTIATION
TRC Institute of Immunology, FMBA, Russia
2Institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Sciences, Pushchino, Russia Tetradecapeptide TEKKRRETVEREKE (healing therapeutics Gepon) is a homologue of the hinge region of ezrin protein. In clinical practice, Gepon is successfully used for treatment of non-healing erosions and ulcers [1—3]. However, this peptide mechanism of action as well as the cell type targeted are mostly unknown. Here we investigated an influence of Gepon on the differentiation of 3T3/NIH fibroblasts and their ability in healing of damaged monolayer in «scratch-test». TGF-P1 cytokine was used as a control inducer of the fibroblast differentiation. It was shown that both Gepon and TGF-P1 induce fibroblast to myofibroblast differentiation, which is accompanied by the cell size increase, and triggering of the alpha smooth muscle actin (a-SMA) synthesis, and inclusion of this protein in the reorganized cytoskeleton. In a control non-activated 3T3/NIH cell cultures, there were 2,0 ± 0,5% of cells containing a-SMA-microfilaments, while after activation with TGF-P1 or Gepon counts of such a-SMA-positive cells reached 34,3 ± 3,6% and 14,6 ± 2,1%, respectively. Gepon, but not TGF-P1 increased by 34% NIH/3T3 cells' motility in a scratch-test of in vitro cell monolayer «wound» healing.
Our results show that healing properties of Gepon drug may be based on its activating influence on fibroblasts, induction of their differentiation into myofibroblasts and increase of these cells motility in a wound zone.
Keyword: fibroblasts, wound healing, myofibroblasts, differentiation, a-SMA, TGF-01, cell motility. For citation: Chulkina M.M., Lebedeva E.S., Holmuhamedov E.L., Ataullakhanov R.I. Ezrin hinge region peptide TEKKRRETVEREKE activates NIH/3T3 fibroblasts to myofibroblasts differentiation. Immunologiya.2017; 38(1): 4-11. DOI: 10.18821/0206-4952-2017-38-1-4-11
Для корреспонденции: Атауллаханов Равшан Иноятович, д-р мед. наук, профессор, руководитель отдела иммунной биотехнологии ГНЦ «Институт иммунологии» ФМБА России, E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com
ORIGINAL ARTICLE
For correspondence: Ravshan I. Ataullakhanov, MD, PhD, Prof., Head of the Department of Immune Biotechnology, NRC Institute of Immunology FMBA, Russia, E-mail: ravshan.ataullakhanov@gmail.com
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgments. The study had no sponsorship.
Received 03.10.16 Accepted 03.11.16
введение
Лекарственные пептиды—перспективный объект научных разработок и внедрения в клиническую практику. Актуальность и высокий интерес к данному направлению создания терапевтических препаратов отражаются в количестве зарегистрированных лекарственных форм в исследованиях, направленных на изучение активности и потенциальных терапевтических свойств пептидов [4, 5]. В одной из сводных баз данных лекарственных пептидов (SATPdb) в настоящее время находятся 19 192 уникальных, экспериментально подтвержденных лекарственных пептида размером от 2 до 50 аминокислотных остатков. По функциональной активности наибольшие по численности группы пептидов относят к противоопухолевым (1099), антимикробным (10 585) и противовирусным (3459) [5].
В Российской Федерации в клинической практике успешно применяют лекарственный препарат Гепон — тетрадекапептид ТЕККЯЯЕТУЕЯЕКЕ, копирующий фрагмент шарнирной области эзрина. Показана высокая эффективность местного применения этого пептида для лечения незаживающих эрозий и язв. При лечении трофических язв мягких тканей наблюдали рост грануляционной ткани и ускоренное заживление [1, 2]. Применение гепона для лечения язв желудка и двенадцатиперстной кишки позволило добиться заживления язв у всех больных, даже тех, кому не помогала стандартная противоязвенная терапия [3]. При лечении Гепоном дистальных форм неспецифического язвенного колита, устойчивого к стандартному лечению противовоспалительными препаратами, наблюдали существенное улучшение клинической картины у 70% больных [6]. Несмотря на успешное применение в клинической практике, механизмы заживляющего действия препарата Гепон остаются неясными.
Регенерация повреждений мягких тканей — сложный многоступенчатый процесс, каждый этап жестко контролируют различные факторы, и их включение строго последовательно. Важным клеточным звеном этих процессов служат фибробласты. В процессах регенерации и заживления фибробласты выполняют ряд ключевых функций. Во-первых, это реорганизация внеклеточного матрикса, включающая как синтез коллагена для восстановления межклеточного пространства, так и утилизацию временного фибронектинового каркаса и поврежденного коллагенового матрикса при помощи металлопротеиназ (ММР). Во-вторых, при активации цитокинами и ростовыми факторами, выделяемыми клетками грануляционной ткани, фибробласты активно мигрируют из прилежащих тканей, пролиферируют и дифференцируются в миофибробласты — специфичные клетки поздней стадии регенерации. Миофибробласты отвечают за синтез внеклеточного матрикса, а также за механическое стягивание области повреждения за счет внутренней сократимости клеток, реализуемой через особую архитектуру цитоскелета, в частности форми-
рование особых микрофиламент, в структуру которых включен белок alpha smooth muscle actin (a-SMA). Кроме этого, миофибробласты активно синтезируют ряд биологически активных молекул — цитокинов, ростовых факторов, регулирующих как собственные функции по пути обратной связи, так и активность и функции других участников регенеративных процессов [7]. В ответ на стимуляцию цитокином TGFpi пролиферирующие фибробласты дифференцируются в миофибробласты, активно экспрессирующие a-SMA и встраивающие его в микрофиламенты. Эти клетки обладают внутренней сократительной способностью за счет встраивания но-восинтезированного мономерного a-SMA G-актина в F-актиновые стресс-волокна, которые при помощи мио-зиновых нитей образуют толстые волокна для создания сократительной силы, необходимой для стягивания раны. Эффективное сокращение и замена грануляционной ткани рубцом, состоящим из коллагена, характеризуют окончание нормального заживления ран [8]. В настоящее время активно рассматривают роль фибро-бластов не только как покоящихся клеток, отвечающих за синтез внеклеточного матрикса, но и как активных участников иммунных реакций организма, способных регулировать функции собственного клеточного окружения [9, 10]. Более того, фибробласты рассматривают как одну из важных мишеней при терапии хронического воспаления, а гетерогенность и пластичность клеток данного типа, а также их органоспецифичность — как один из ключевых факторов в подходах для изучения патологий, связанных с воспалением в конкретных органах [11, 12]. При нарушении координированной работы клеточного и гуморального окружения поврежденной ткани происходит развитие патологических изменений, связанных как с дисфункцией фибробластов, так и с их гиперактивностью, приводящей к развитию фиброзов.
Для целенаправленного влияния на функции фибро-бластов активно изучают компоненты внеклеточного матрикса и другие молекулы, взаимодействующие с поверхностными рецепторами [13]. Взаимодействие клеток с внеклеточным матриксом играет ключевую роль в важных биологических процессах, включая подвижность клеток, пролиферацию, дифференцировку, регуляцию экспрессии генов и защиту от апоптоза. Клетка взаимодействует с внеклеточным матриксом с помощью рецепторов клеточной поверхности, в частности с помощью интегринов, сосредоточенных в местах фокальной адгезии. Через интегриновые рецепторы в клетке активируются сигнальные пути, приводящие к реорганизации актинового цитоскелета, изменению формы клетки и ее подвижности, а также экспрессии ряда генов. Схожие изменения в морфологии клеток и экспрессии ключевых генов могут происходить под воздействием ростовых факторов, в частности цитокина TGFP1, что отражает важную взаимосвязь и перекрест сигнальных путей опосредованных адгезией клетки к субстрату и действием цитокинов. Исследования функций фибро-бластов в ответ на синтетические молекулы внеклеточ-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ного матрикса составляют большой кластер научных работ, имеющих клинические перспективы [13]. Механизм действия таких молекул заключен в запуске сигнальных механизмов, ключевых для клеточных процессов заживления ран. Кроме того, показано, что биологическая активность таких молекул сохраняется в минимальных концентрациях. Особое практическое значение имеет тот факт, что определенные короткие полипептидные последовательности могут выполнять в таких взаимодействиях функцию целых белков. Для влияния на функции фибробластов описан целый ряд таких коротких (3—5 аминокислотных остатка) полипептидных последовательностей, которые гомологичны небольшим фрагментам следующих белков. К таким биологически активным пептидам относят: а) гомологи белков внеклеточного матрикса (фибронектин, коллаген, ламинин, эластин), взаимодействие которых с интегринами клеточной поверхности приводит как к активации и диф-ференцировке фибробластов [14—16], так и, напротив, к поддержанию фибробластов в неактивированном состоянии через имитацию контактов с матриксом [17, 18]; б) гомологи активационных и ростовых факторов, в частности пептидные гомологи FGF-2, стимулирующие пролиферацию и ангиогенез [19], и гомологи BMP-2 — активирующие Smad-сигнальный путь [15]; в) пептидные гомологи белков плотных клеточных контактов (connexin 43), которые усиливают миграцию фибробластов в модели заживления [20]. Синтетические пептиды, гомологичные компонентам соединительной ткани, показывают высокий потенциал терапевтического действия в моделях нарушений заживления [21, 22].
Таким образом, поиск новых соединений, регулирующих процессы активации и дифференцировки фибробластов, позволяет разрабатывать новые лекарственные соединения известного состава и механизма действия. В свете этого поиск клеточных мишеней и механизмов действия лекарственного препарата Гепон, имеющего зарегистрированные клинические заживляющие эффекты, представляет несомненный интерес.
Материал и методы
Клеточные культуры, описание экспериментов. Фибробласты линии NIH/3T3 получены из Российской коллекции клеточных культур (Санкт-Петербург, Россия). Клетки культивировали в среде DMEM с содержанием глюкозы 4 мг/мл, 4 мМ L-глютамина, 1 мМ пиру-вата, 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС) и 0,1% гентамицина (ПанЭко, Россия). После наращивания культуры клетки были помещены в глубокую заморозку в аликвотах 1 млн/мл в суспензии, в ФБС с содержанием DMSO 10%. Во всех описанных экспериментах использовали клетки из разморозки, не выше 3—5 пассажей. Клетки размораживали на водяной бане при 37 °C, отмывали в 10 мл фосфатно-солевого буфера, содержащем 0,5% BSA и глюкозу (PBS/BSA), осаждали при 1300 об/ мин на центрифуге. Убирали супернатант, осадок клеток ресуспендировали в 1 мл буфера. К 20 мкл суспензии добавляли 100 мкл PBS буфера с DAPI (1 мкг/мл) и цитометрическими бусами 10,15 мкм (Epics Division of Coulter Corp, США) и проводили подсчет живых клеток в проточном цитометре FACS ARIA II. Концентрацию живых клеток (с) вычисляли по формуле:
n (количество живых клеток в пробе)
с =-.
r (количество буфк (концентрация бус)
Дифференцировка фибробластов. Для исследования влияния препарата Гепон и цитокина TGFßl на дифференцировку фибробластов клетки NIH/3T3 высеивали на слайд-камеры со стеклянной поверхностью (SPL Life Sciences Co., Корея), обработанной коллагеном 1-го типа (rat tail collagen, Sigma № С3867, США) (10 мкг/см2), в плотности 3000 клеток/см2 в среде DMEM с содержанием глюкозы 4 мг/мл, 10% ФБС. Через 18 ч, после адгезии клеток, среду убирали, клетки промывали теплым буфером PBS/BSA и проводили старвинг 24 ч в среде DMEM с 2% ФБС. После старвинга среду отбирали, добавляли свежую среду с активаторами Гепон (10 мкг/мл) (ООО «Иммафарма», Россия) или TGFß1 (5 нг/мл) (Sigma № T7039, США), в контрольные лунки активатор не добавляли. Дифференцировку проводили 48 ч, через каждые 24 ч меняли среду.
Скратч-тест. Для исследования влияния препарата Гепон на подвижность клеток в скратч-тесте в 96-луночный плейт, обработанный коллагеном, клетки высеивали в плотности 100 клеток/см2 в среду DMEM с 2% ФБС, после 18 ч культивирования среду убирали, клетки промывали теплым PBS/BSA, на монослой клеток носиком для пипетки на 200 мкл наносили царапину по центру лунки, располагая носик строго перпендикулярно дну лунки. Лунки промывали дважды 200 мкл теплым PBS/BSA, для того чтобы убрать поврежденные и открепившиеся от подложки клетки из области царапины, добавляли 100 мкл свежей среды DMEM с 2% ФБС и проводили фотографирование каждой лунки с использованием микроскопа Opton ICM 405 (Carl Zeiss, Германия) и камеры Levenhuk C800 (Китай). Затем плейт помещали в культуральный термостат на 30 мин. После этого добавляли 100 мкл среды с активаторами, в контрольные лунки активаторы не добавляли. После 6 ч инкубации проводили повторную съемку лунок в том же самом поле обзора. Для каждого экспериментального варианта было исследовано 6 лунок. Анализировали данные 3 независимых экспериментов. На дно лунки с внешней стороны плейта наносили царапину острием иголки, что позволяло с высокой точностью сопоставлять изображения лунки в нулевой точке эксперимента и по завершении эксперимента. Количественный анализ полученных изображений проводили в программе ImageJ 1.48v (National Institutes of Health, США). Два изображения одной лунки накладывали одно на другое, сопоставляя заранее нанесенный маркер, выделяли область, свободную от клеток в точке 0 ч и в точке 6 ч, после чего вычисляли площадь этой области. Скорость клеток за единицу времени рассчитывали по формуле
si — s2
v =-,
2*l*h
где s1 — площадь области, свободной от клеток, в начале эксперимента;
s2 — площадь области, свободной от клеток, по завершению эксперимента; l — длина царапины; h — время эксперимента.
Для определения количества клеток, вышедших в зону нанесения царапины, в программе ImageJ 1.48v наносили маркеры на клетки, находящиеся в границах области повреждения, далее в автоматическом режиме подсчитывали количество этих маркеров. Плотность клеток в области повреждения рассчитывали как отно-
шение полученного значения (количества клеток) к разнице площадей si - s2.
Проведено 3 независимых эксперимента, в каждом эксперименте исследовано по 6 лунок каждого варианта. Приводится среднее по трем экспериментам.
Микроскопия. Для исследования дифференцировки фибробластов под влиянием Гепон и TGFßi проводили окрашивание специфичного маркера дифференцированных миофибробластов — alpha smooth muscle actin (a-SMA) и визуализацию окрашенных клеток на конфокальном микроскопе Carl Zeiss AxioObserver Z.i. Для этого после проведения эксперимента клетки промывали теплым PBS/BSA, фиксировали 4% PFA 37 °C 20 мин, промывали DPBS двукратно 500 мкл, премеабилизиро-вали раствором сапонина в PBS (BD kit №) и окрашивали моноклональными антителами, конъюгированными с флуоресцентной меткой FITC (Cat № ab8211, Abcam, США), в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем отмывали от избытка антител трехкратно 500 мкл DPBS. Для окрашивания F-актина использовали краситель phalloidin, конъюгированный с флуоресцентной меткой Alexa Fluor 647 (CST, Cat № 8940, США) в разведении 1:300, инкубировали 20 мин при комнатной температуре и однократно промывали 500 мкл раствором DPBS. К окрашенным образцам добавляли протектор окрашивания Prolong Gold Anti-Fade Reagent (CST, Cat № 8961, США), содержащий краситель DAPI для окрашивания ядер, закрывали препарат покровным стеклом и проводили визуализацию окрашенных структур цитоскелета.
Количественный анализ изображений. Для анализа степени дифференцировки культуры для каждого экспериментального варианта проводили съемку 10—15 полей при х 20. Изображения сохраняли в формате tiff и использовали для анализа в программе ImageJ 1.48v. В канале Dapi определяли маску для ядер клеток и, используя макро Analyze Particles, подсчитывали количество клеток. Затем в канале FITC в мануальном режиме считали количество клеток, содержащих a-SMA-позитивные волокна в структуре цитоскелета. В поле просчитывалось 60—90 клеток. Вычисляли процентное содержание дифференцированных клеток в поле как отношение клеток, содержащих a-SMA-филаменты, к общему количеству клеток.
Вестерн-блоттинг. Для анализа экспрессии белка a-SMA в дифференцированных культурах фибробластов NIH/3T3 клетки были посажены в плотности 3000 клеток/см2 в 6-луночный плейт (LUX tissue culture), обработанный коллагеном, после 48 ч активации (как описано ранее) культуральную среду удаляли, промывали клетки на льду холодным раствором DPBS 3 раза, убирали остатки буфера и лизировали клетки в 100 мкл буфера (Invitrogen, Cell Extraction Buffer, FNN0011) в присутствии ингибиторов протеаз (Sigma, P2714-1BTL) 30 мин при 4 °C. Клеточные экстракты осаждали на центрифуге (Eppendorf 5424R, Germany) (14,000 rpm, 10 мин, 4 °C), отбирали супернатанты и измеряли в них концентрацию белка с использованием коммерческого набора (Pierce, Protein Assay Reagent, 23225). Полученную смесь клеточных белков (10 мкг) разделяли в 8% SDS-PAGE и переносили на PVDF-мембрану (Amersham Hybond-P). Для детекции целевых белков мембрану последовательно в течение 1 ч инкубировали с первичными антителами к a-SMA (Cat № ab5694, Abcam, USA) в разведении 1:1000 и GAPDH (Abcam, ab8245) — в 1:2000, а затем со вторичными антителами, конъюгированными
ORIGINAL ARTICLE
с пероксидазой хрена, в разведении 1:1 000 000 (Sigma, A0545-1ML). Визуализацию результатов осуществляли методом хемилюминесценции (Pierce, SuperSignal West Femto Maximum sensitivity, 34095). Анализ интенсивности белковых полос проводили с помощью программы ImageJ 1.48v. Для этого в полученных изображениях в формате tiff (разрешение 8-bit) выделяли анализируемые белковые полосы, затем, используя макро Analase Gels, получали пики интенсивности для каждой белковой полосы и вычисляли площади пиков. Полученные значения для целевого белка приводили в отношении к значениям нормировочного белка GAPDH. Для каждого экспериментального варианта было исследовано 2 лунки, всего проведено 3 независимых эксперимента — приведено среднее по экспериментам.
результаты
Гепон индуцирует дифференцировку фибробластов. Мы изучили влияние препарата Гепон на диф-ференцировку фибробластов в миофибробласты. В качестве контрольного индуктора дифференцировки фибробластов использовали цитокин TGF-ß1.
Для исследования дифференцировки фибробластов использованы специальные экспериментальные условия поддержания NIH/3T3 в неактивном состоянии в контроле. Культуральную посуду обработали коллагеном. До воздействия активаторами клетки культивировали в присутствии 2% ФБС, чтобы снизить фоновую активацию ростовыми факторами сыворотки. После добавления активатора клетки культивировали 48 ч, а затем анализировали размер, морфологию клеток и структуру микрофиламент. На рис. 1, а (см. на 2-й пол. обл.) представлены микрофотографии культур клеток NIH/3T3 после 48 ч активации. Видно, что в контрольном образце фибробласты имеют преимущественно округлую форму, а при культивировании с активаторами (Гепон или TGF-ß1) клетки меняют морфологию — распластываются, удлиняются, увеличиваются в размерах.
Для визуализации актинового цитоскелета использован краситель phalloidin, окрашивающий F-актин в структуре цитоскелета (рис. 1, б см. на 2-й пол. обл.). Каждый пик на гистограмме показывает пересечение линии с актиновым волокном цитоскелета. Показано, что и в активированных образцах, и в контроле цитоскелет состоит из волокон F-актина. При окрашивании образцов специфичными антителами к a-SMA детектируются только волокна, содержащие этот белок (рис. 1, в см. на 2-й пол. обл.). Как следует из гистограмм, в контрольных не активированных фибробластах микрофиламен-ты, содержащие a-SMA, не детектируются. В клетках, активированных Гепоном или TGFß1, содержится значительное количество a-SMA-микрофиламент.
Количественная оценка дифференцировки NIH/3T3 фибробластов под действием активаторов показала, что количество клеток, содержащих a-SMA-положительные филаменты, при действии Гепона составляет 14,6 ± 2,1%, а при действии TGFß1 — 34,3 ± 3,6%. По данным вестерн-блота, синтез белка a-SMA под влиянием Гепона усиливался в 2,6 ± 0,5 раза, а под действием TGFß1 — в 13,8 ± 4,5 раза (рис. 2, а, б, в, г (см. на 3-й пол. обл.).
Таким образом, наши данные свидетельствуют, что препарат Гепон вызывает дифференцировку фибробластов в миофибробласты, при этом происходит de novo синтез специфичного для миофибробластов белка a-SMA и встраивание его в структуру актиновых
Иммунология. 2017; 38(1)
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2017-38-1-4-11 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Рис. 3. Скратч-тест монослоя фибробластов сразу после нанесения повреждения (верхний ряд) и через 6 ч в присутствии активаторов Гепон (10 мкг/мл) и TGF-P1 (5 нг/мл) для фибробластов ШН/3Т3 (нижний ряд); красной рамкой обозначено поле, свободное от клеток в начале эксперимента (а); количественный анализ скорости движения клеток в «скратч-тесте» (п = 3, п = 6; р < 0,05) (б); влияние содержания фетальной сыворотки (FBS) в культуральной среде на скорость движения фибробластов при активации Гепоном (10 мкг/мл) (п = 2, п = 6; р < 0,05) (в); микрофотографии монослоя фибробластов через 6 ч действия Гепоном (10 мкг/мл); красная линия — поле, свободное от клеток в начале эксперимента, красные точки соответствуют отдельным клеткам в наблюдаемом поле (г); количественный анализ плотности клеток на единицу площади в области повреждения в контрольных и активированных Гепоном культурах фибробластов (п = 2, п = 6) (д).
микрофиламент. При дифференцировке фибробластов меняется морфология клетки, эти изменения мы показали как при действии естественного активатора диффе-ренцировки фибробластов — цитокина TGF-P1, так и в присутствии препарата Гепон. По сравнению с Гепоном TGF-P1 вызывал значительно более интенсивное нарастание синтеза белка а-8МА в существенно большем проценте фибробластов.
Гепон активирует подвижность фибробластов в тесте «заживления» повреждения монослоя ^т^-тест). В тесте «заживления» повреждения монослоя показано, что препарат Гепон активирует подвижность клеток. На рис. 3, а показаны изображения в момент повреждения монослоя и через 6 ч культивирования в присутствии активаторов — Гепона или TGF-P1. Красные линии ограничивают поле, свободное от клеток, сразу после повреждения монослоя.
Показано, что скорость движения фибробластов в поврежденном монослое при действии TGF-P1 составляла 20,4 ± 4,8 мкм/ч, что не отличалось от контрольных образцов (21,1 ± 3,7 мкм/ч). В то же время Гепон достоверно увеличивал скорость движения фибробластов, при
действии этого активатора скорость составляла 29,3 ± 3,4 мкм/ч (рис. 3, б). Анализ числа клеток, мигрировавших в зону поврежденного монослоя, показал, что количество клеток на единицу площади поверхности в присутствии Гепона и без него достоверно не различалось (рис. 3, г, д).
Мы установили, что при снижении содержания сыворотки в культуральной среде контрольные фибробласты (без активатора) замедляют движение. Скорость движения клеток в scratch-тесте составляла 11,8 ± 2,3, 21,2 ± 3,7 или 34,3 ± 4,3 мкм/ч при содержании FBS 0,2, 2 или 10% соответственно. Активирующее влияние Гепона на подвижность фибробластов не зависело от содержания сыворотки. Гепон увеличивал скорость движения фи-бробластов в среднем в 1,34 раза независимо от содержания FBS (рис. 3, в).
Обсуждение
Изучению факторов, модулирующих дифференци-ровку фибробластов в норме и при патологии, посвящено большое количество исследований [23]. Hinz приводит 42 фактора, оказывающих положительное влияние
на индукцию миофибробластов [23], и в их числе TGF-ß1, который является мастер-цитокином, индуцирующим образование миофибробластов in vitro и in vivo [10, 24, 25].
В нашей работе впервые обнаружено активирующее действие синтетического пептида, гомологичного шарнирной области эзрина, на дифференцировку фибробластов NIH/3T3. Мы показали, что препарат Гепон индуцирует увеличение размера фибробластов и образование микрофиламентов, содержащих a-SMA, что служит маркером дифференцировки фибробластов в миофибробласты. При этом происходит небольшое усиление de novo синтеза a-SMA. Подобное действие цитокина TGF-ß1 в наших экспериментах было более интенсивным по сравнению с эффектами Гепона. TGF-ß1 оказывал значительно более выраженный эффект как на синтез белка a-SMA, так и на количество дифференцированных клеток.
TGFß1 — индуктор дифференцировки фибробластов в миофибробласты — служит также индуктором синтеза TGFß1, что создает петлю положительной обратной связи [26—28]. Можно предполагать, что более низкая активность Гепона в сравнении с TGF-ß1 вызвана различиями в механизмах действия активаторов, в частности в отсутствии синтеза TGF-ß1 в фибробластах, активированных Гепоном.
Существенные различия Гепона и TGF-ß1 по действию на фибробласты выявлены по их влиянию на подвижность этих клеток в scratch-тесте. Исследованию роли TGF-ß1 на подвижность фибробластов посвящено большое количество публикаций [10, 25, 29, 30]. В этих работах показано либо отсутствие эффекта на внесение TGF-ß1 [28, 29], либо описывается ингибирующая роль этого цитокина на подвижность клеток [25, 31]. В нашей работе показано отсутствие эффекта TGF-ß1 на движение фибробластов NIH/3T3 в scratch-тесте. Это согласуется с работами R. Poon и соавт. (2009) и J. Brenmoehl и соавт. (2009). В отличие от работ ряда других авторов [25, 31]мы не обнаружили достоверного ингибирующе-го действия этого цитокина. Можно предполагать, что наша методика проведения scratch-теста анализирует лишь ранние сроки после активации фибробластов, поскольку мы проводили наблюдения в первые 6 ч после внесения активаторов. При более длительных экспозициях происходят изменения в клетках, связанные с дифференцировкой в миофибробласты, — увеличение клеточных контактов с субстратом, перестройка цито-скелета, синтез новых белков цитоскелета и замедление движения. Физиологическую роль действия TGF-ß1 на подвижность фибробластов предлагает J. Brenmoehl (2009). На ранних этапах регенерации происходит направленная миграция тканевых фибробластов в грануляционную ткань по градиенту TGF-ß1. В самой зоне повреждения необходимы другие функции фибробла-стов — синтез и перестройка внеклеточного матрикса. Эти функции выполняют миофибробласты, в которые дифференцируются фибробласты при длительной экспозиции TGF-ß1.
Представляется важным, что Гепон оказывает влияние на подвижность фибробластов вне зависимости от содержания фетальной сыворотки в культуре. Хорошо известно, что в составе сыворотки находятся ростовые факторы, которые оказывают влияние на подвижность фибробластов, — это PDGF, FGS, EGF, IGF-1 [9, 11, 32, 33]. Наши данные показывают, что содержание сыворотки в среде дозозави-симым образом влияет на движение клеток в scratch-тесте
ORIGINAL ARTICLE
в контрольных образцах. Тем не менее на фоне изменения содержания сыворотки Гепон оказывал положительное влияние на подвижность фибробластов.
Хорошо известно, что компоненты внеклеточного матрикса влияют на подвижность клеток. Показано, что подвижность клеток увеличивается под действием коллагена [15, 17, 20], фибронектина [32, 34], ламинина [35], тромбоспондина-1 [36], гиалуроновой кислоты [37]. Напротив, такие элементы внеклеточного матрикса, как тенасцин (tenascin), остенектин (osteonectin/SPARC), аг-грекан (aggrecan) и версикан (versican) [14, 18, 38, 39], замедляют движение клеток. Более того, хорошо известно участие компонентов внеклеточного матрикса или пептидных последовательностей, гомологичных функциональным частям матрикса, на судьбу фибробластов и участие этих компонентов в дифференцировке фибробла-стов. Так, коллаген в нативной форме препятствует диф-ференцировке [40, 41], в то время как фрагменты коллагена или денатурированный коллаген (желатин) вызывают образование миофибробластов, а направленная активация интегрина a11ß1 — рецептора коллагена — приводит к дифференцировке миофибробластов [42]. Фибронектин влияет на дифференцировку фибробластов, связываясь с интегринами a4ß7, a4ß1 и a9ß1. Показано что специфичные полипептидные последовательности фибронектина EDGIHEL и KLDAPT обладают сродством к интегринам и вызывают усиление синтеза a-SMA через активацию ERK1/2 и фосфорилирование FAK киназы [43].
Большинство описанных естественных активаторов фибробластов, гомологичных элементам внеклеточного матрикса либо копирующих функциональные части внеклеточного матрикса (связывающиеся с рецепторами на поверхности клеток), могут тормозить движение фибро-бластов и их дифференцировку или влияют только на подвижность, не вызывая дифференцировки. Некоторые компоненты внеклеточного матрикса, например фибро-нектин и гиалуроновая кислота, наоборот, увеличивают скорость движения клеток и индуцируют дифференци-ровку фибробластов.
Синтетические пептиды, подобно Гепону влияющие на подвижность и способность к дифференцировке, описаны в ряде работ. Влияние на скорость движения клеток при повреждении монослоя описано для пептида, гомологичного фрагменту белка MARCKS, который является универсальным субстратом протеинкиназы C. Пептид из этого белка влияет на реорганизацию актинового цитоскелета, подвижность клеток, фосфорилирование AKT-киназы [44]. Другой синтетический пептид, состоящий из 11 аминокислот, Tiger17 (c[WCKPKPKPRCH-NH2]), ускорял движение фибробластов и кератиноци-тов в scratch-тесте, усиливал заживление кожной раны в эксперименте in vivo с увеличением количества a-SMA положительных клеток в зоне рубцевания, а также вызывал активацию внутриклеточных сигнальных путей SMAD2/3 и Raf/MEK/ERK [45]. В работе A.R. Sheets и соавт. исследован пептид экстрацеллюлярного матрикса, показавший положительный эффект в моделях нарушенного заживления при диабете [21].
Предполагаемое участие Гепона в процессах взаимодействия клетки с внеклеточным матриксом может служить гипотезой механизма заживляющего действия препарата. Изучение влияния препарата на взаимодействие клетки с внеклеточным матриксом в системе живого организма представляется перспективным и очень актуальным направлением для дальнейших исследований.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Заключение
В данной работе мы впервые показали активирующее действие тетрадекапептида TEKKRRETVEREKE (лекарственный препарат Гепон) на фибробласты. В течение нескольких минут после воздействия препаратом в фибробластах регистрируют значительную активацию MAPK-киназного сигнального пути, в частности ERKl/2-киназ. В течение первых часов после активации Гепоном фибробласты имеют повышенную подвижность в тесте репарации поврежденного монослоя (scratch-тест). В более поздние сроки (через 48 ч) после активации можно наблюдать превращение активированных Гепоном фибробластов в миофибробласты, содержащие особые aSMA-микрофиламенты. Действие Гепона на фибробласты подобно, но не идентично влиянию цитокина TGFpi. Отличие состоит в том, что Гепон не индуцирует продукцию TGFP1 активированными фибробластами и, напротив, стимулирует подвижность этих клеток.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
литература
1. Бардычев М.С. Лечение местных лучевых повреждений. Лечащий врач. 2003; 5: 78—9.
2. Дудченко М.А., Лысенко Б.Ф., Челишвили А.Л., Катлинский А.В., Атауллаханов Р.Р. Комплксное лечение трофических язв. Лечащий врач. 2002; 10: 72—5.
3. Лазебник Л.Б., Звенигородская Л.А., Атауллаханов Р.И., Пичу-гин А.В., Чикунова Б.З., Фирсакова В.Ю. Иммуномодулятор Гепон у болных пожилого возраста с эрозивно-язвеннми поражениями гастродуоденальной зоны. Русский медицинский журнал. 2004; 12(23): 1349—52.
6. Малахова Н.С., Пичугин А.В., Халиф И.Л., Атауллаханов Р.И. Применение иммуномодулятора Гепон для лечения неспецифического язвенного колита. Фарматека. 2005; 6(101): 105—8.
references
1. Bardychev M.S. The treatment of local radiation injury. Lechashchiy vrach. 2003; 5: 78—9. (in Russian)
2. Dudchenko M.A., Lysenko B.F., Chelishvili A.L., Katlinskij A.V., Ataullahanov R.R. Complex treatment of venous ulcers. Lechashchiy vrach. 2002; 10: 72—5. (in Russian)
3. Lazebnik L.B., Zvenigorodskaja L.A., Ataullahanov R.I., Pichugin A.V., Chikunova B.Z., Firsakova V.Yu. Application Gepon elderly patients with erosive lesions of gastroduodenal zone yazvennmi. Russkiy meditsinskiy zhurnal. 2004; 12(23): 1349—52. (in Russian)
4. Kaspar A.A., Reichert J.M. Future directions for peptide therapeutics development. Drug Discovery Today. 2013; 18(17—18): 807—17.
5. Singh S., Chaudhary K., Dhanda S.K., Bhalla S., Usmani S.S., Gautam A., Raghava G.P. SATPdb: a database of structurally annotated therapeutic peptides. Nucleic Acids research. 2016; 44(D1): 1119—26.
6. Malahova N.S., Pichugin A.V., Halif I.L., Ataullahanov R.I. Use of the Gepon immunomodulator for ulcerative colitis treatment. Farmateka. 2005; 6(101): 105—8. (in Russian)
7. Gabbiani G. The myofibroblast in wound healing and fibrocontractive disease. J. Pathol. 2003; 200: 500—3.
8. Singer Aj., Clark R. Cutaneous Wound Healing. The New England Journal of Medicina, 1999; 341(10): 738—46.
9. Bornfeldt K.E., Raines E.W., NakanoT., Graves L.M., Krebs E.G., Ross R. Insulin-like growth factor-1 and platelet-derived growth factor-BB induce directed migration of human arterial smooth
muscle cells via signalling pathways that are distinct from those of proliferation. J. Clin. Invest. 1994; 93: 1266—74.
10. Brenmoehl J., Miller S.N., Hofmann C., Vogl D., Falk W., Scholmerich J., Rogler G. Transforming growth factor-beta 1 induces intestinal myofibroblasts differentiation and modulates their migration. World J. Gastroenterol. 2009; 15(12): 1431—42.
11. Chen P., Gupta K., Wells A. Cell movement elicited by epidermal growth factor receptor requires kinase and autophosphorylation but is separable from mitogenesis. J. Cell Biol. 1994; 124: 547—55.
12. Hinz B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. J. Invest. Dermatol. 2007; 127(3): 526—37.
13. Agren M.S., Werthén M. The extracellular matrix in wound healing: a closer look at therapeutics for chronic wounds. Int. J. Low Extrem. Wounds. 2007; 6(2): 82—97.
14. Landolt R.M., Vaughan L., Winterhalter K.H., Zimmermann D.R. Versican is selectively expressed in embryonic tissues that act as barriers to neural crest cell migration and axon outgrowth. Development. 1995; 121: 2303—12.
15. Li W., Fan J., Chen M. Mechanism of Human Dermal Fibroblast Migration Driven by Type I Collagen and Platelet-derived Growth Factor. Molecular Biology of the Cell. 2004; 15(1): 294—309.
16. Webb K., Hlady V., Tresco P.A. Relative importance of surface wettability and charged functional groups on NIH 3T3 fibroblast attachment, spreading, and cytoskeletal organization. J. Biomed. Mater. Res. 1998; 41(3): 422—30.
17. Perris R., Krotoski D., Bronner-Fraser M. Collagens in avian neural crest development: distribution in vivo and migration-promoting ability in vitro. Development. 1991; 113: 969—84.
18. Perris R., Perissinotto D., Pettway Z., Bronner-Fraser M., Morgelin M., Kimata K. Inhibitory effects of PG-H/aggrecan and PG-M/versican on avian neural crest cell migration. FASEB J. 1996; 10: 293—301.
19. Lin X., Takahashi K., Campion S.L., Liu Y., Gustavsen G.G., Peña L.A., Zamora P.O. Synthetic peptide F2A4-K-NS mimics fibroblast growth factor-2 in vitro and is angiogenic in vivo. Int. J. Mol. Med. 2006; 17(5): 833—9.
20. Olivero D.K., Furcht L.T. Type IV collagen, laminin, and fibronectin promote the adhesion and migration of rabbit lens epithelial cells in vitro. Invest. Ophthalmol. vis. Sci., 1993; 34: 2825—34.
21. Sheets A.R., Massey C.J., Cronk S.M., Iafrati M.D., Herman I.M. Matrix- and plasma-derived peptides promote tissue-specific injury responses and wound healing in diabetic swine. J. Transl. Med. 2016; 14(1): 197—210.
22. Livant D.L. The PHSRN sequence induces extracellular matrix invasion and accelerates wound healing in obese diabetic mice. J. Clin. Invest. 2000; 105: 1537—45.
23. Hinz B., Phan S.H., Thannickal V.J., Prunotto M., Desmouliere A., Varga J., De Wever O., Mareel M., Gabbiani G. Recent developments in myofibroblast biology: paradigms for connective tissue remodeling. Am. J. Pathol. 2012; 80(4): 1340—55.
24. Hinz B., Celetta G., Tomasek J.J., Gabbiani G., Chaponnier C. Alpha-smooth muscle actin expression upregulates fibroblast contractile activity. Mol. Biol. Cell. 2001; 12: 2730—41.
25. Ellis I., Grey A.M., Schor A.M., Schor S.L. Antagonistic effects of TGF-beta1 and MSF on fibroblast migration and hyaluronic acid synthesis. Possible implications for dermal wound healing. J. Cell Sci. 1992; 102(3): 447—56.
26. Schmid P., Itin P., Cherry G., Bi C., Cox D.A. Enhanced expression of transforming growth factor-beta type I and type II receptors in wound granulation tissue and hypertrophic scar. Am. J. Pathol. 1998; 152: 485—93.
27. Shi Y., O'Brien J.E., Jr. Fard A., Zalewski A. Transforming growth factor-beta 1 expression and myofibroblast formation during arterial repair. Arterioscler. Thromb. vasc. Biol., 1996; 16: 1298—305.
28. Poon R., Li C., Alman B.A. Beta-catenin mediates soft tissue contracture in clubfoot. Clin. Orthop. relat. res. 2009; 467(5): 1180—5.
29. Poon R., Nik S.A., Ahn J., Slade L., Alman B.A. Beta-catenin and transforming growth factor beta have distinct roles regulating fibroblast cell motility and the induction of collagen lattice contraction. BMC Cell Biol. 2009; 11: 10—38.
30. Sullivan K.M., Lorenz H.P., Meuli M., Lin R.Y., Adzick N.S. A model
of scarless human fetal wound repair is deficient in transforming growth factor beta. J. Pediatr. Surg. 1995; 30: 198—203.
31. Thampatty B.P., Wang J.H. A new approach to study fibroblast migration. CellMotilCytoskeleton. 2007; 64(1): 1—5.
32. van Horssen R., Galjart N., Rens J.A., Eggermont A.M., ten Hagen T.L. Differential effects of matrix and growth factors on endothelial and fibroblast motility: application of a modified cell migration assay. J. CellBiochem. 2006; 99(6): 1536—52.
33. Kundra V., Escobedo J.A., Kazlauskas A., Kim H.K., Rhee S.G., Williams L.T., Zetter B.R. Regulation of chemotaxis by the platelet-derived growth factor receptor-ß. Nature. 1994; 367: 474—6.
34. Duband J.L., Dufour S., Thiery J.P. The instructive role of fibronectins in cell migrations during embryonic development. Ann. New York Acad. Sci. 1990; 588: 273—80.
35. Davis L.A., Ogle R.C., Little C.D. Embryonic heart mesenchymal cell migration in laminin. Dev. Biol. 1989; 133: 37—43.
36. Taraboletti G., Roberts D.D., Liotta L.A. Thrombospondininduced tumor cell migration: haptotaxis and chemotaxis are mediated by different molecular domains. J. Cell Biol. 1987; 105: 2409—15.
37. Maniwa S., Ochi M., Motomura T., Nishikori T., Chen J., Naora H. Effects of hyaluronic acid and basic fibroblast growth factor on motility of chondrocytes and synovial cells in culture. Acta Orthop. Scand. 2001; 72(3): 299—303.
38. Hasselaar P., Sage E.H. SPARC antagonizes the effect of basic fibroblast growth factor on the migration of bovine aortic endothelial cells. J. Cell. Biochem. 1992; 49: 272—83.
ORIGINAL ARTICLE
39. Spring J., Beck K. and Chiquet-Ehrismann R. Two contrary functions of tenascin: dissection of the active sites by recombinant tenascin fragments. Cell. 1989; 59: 325—34.
40. Ehrlich H.P., Rajaratnam J.B. Cell locomotion forces versus cell contraction forces for collagen lattice contraction: an in vitro model of wound contraction. Tissue Cell. 1990; 22: 407—17.
41. Ehrlich H.P., Allison G.M., Leggett M. The myofibroblast, cadherin, alpha smooth muscle actin and the collagen effect. Cell Biochem. Funct. 2006; 24(1): 63—70.
42. Carracedo S., Lu N., Popova S.N., Jonsson R., Eckes B., Gullberg D. The fibroblast integrin alpha11beta1 is induced in a mechanosensitive manner involving activin A and regulates myofibroblast differentiation. J. Biol. Chem. 2010; 285(14): 10434—45.
43. Kohan M., Muro A.F., White E.S., Berkman N. EDA-containing cellular fibronectin induces fibroblast differentiation through binding to alpha4beta7 integrin receptor and MAPK/Erk 1/2-dependent signaling. FASEB J. 2010; 24(11): 4503—12.
44. Ott L.E., Sung E.J., Melvin A.T., Sheats M.K., Haugh J.M., Adler K.B. Fibroblast Migration Is Regulated by Myristoylated Alanine-Rich C-Kinase Substrate (MARCKS) Protein. PLoS one. 2013; 8(6): e66512.
45. Tang J., Liu H., Gao C., Mu L., Yang S., Rong M. et al. A small peptide with potential ability to promote wound healing. PLoS One. 2014; 9(3): e92082.
Поступила 03.10.16 Принята в печать 03.11.16
ЦИТОКИНЫ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2017
УДК 616.153.45-008.61-092:612.017.1]-078.33-092.9
Ригер Н.А., Апрятин С.А., Евстратова В.С., Трусов Н.В., Балакина А.С., Мжельская К.В., Гмошинский И.В.
СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЦИТОКИНОВОГО ПРОФИЛЯ ПЛАЗМЫ КРОВИ КРЫС И МЫШЕЙ НА IN VIVO-МОДЕЛЯХ ГИПЕРЛИПИДЕМИИ
ФГБУН «Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи», 109240, г Москва
Иммунная система способна реагировать на изменение соотношения жиров, белков и углеводов в рационах. Эти иммунологические реакции могут иметь межвидовые различия. В работе выполнен сравнительный анализ профиля иммунорегуляторных цитокинов плазмы крови крыс и мышей на модели гиперлипидемии. Материал и методы. Самки 48 крыс Wistar (a) и 48 мышей C57Black/6 (b) были разделены на 6 групп. Животные 1a—b получали рацион AIN93, 2a—b — избыток жиров (30% сухой массы), 3a—b — 20% фруктозы с водой, 4a—b — избыток жиров и фруктозы, 5a—b — избыток холестерина (0,5% сухой массы), 6a—b — избыток холестерина и фруктозы. На 63-й день эксперимента собирали кровь и отделяли плазму. Уровни цитокинов и ростовых факторов в плазме определяли на анализаторе Luminex 200 с использованием наборов Bio-Plex. Статистическую обработку выполняли с помощью пакета SPSS 20.0.
Результаты. У крыс групп 2a—6a избыток жиров, фруктозы и холестерина вызвал снижение уровней GM-CSF, M-CSF и увеличение EPO в плазме. Мыши из групп 2b—6b реагировали повышением содержания G-CSF и IL-3. Уровень хемокинов при избытке холестерина и фруктозы в рационе у крыс возрастал, а у мышей — снижался (группы 6a и 6b). Однако уровень EOTAXIN у мышей увеличился, а IL-5 у крыс — снизился. Избыток жиров и углеводов в рационе у крыс (группа 4a) снижал уровень IFN-y, IL-17A, TNF-a, способствуя увеличению IL-18, IL-1a и IL-4. У мышей избыток фруктозы снижал уровень IL-12p40, а добавление избыточного количества жира в рацион вызывало обратный эффект.
Заключение. Таким образом, на фоне различных рационов (избыток углеводов, жиров и холестерина и их сочетания) изменяется уровень цитокинов и ростовых факторов в плазме лабораторных животных. При этом наблюдается существенная разница в цитокиновом профиле крыс и мышей, что обусловлено межвидовыми различиями в иммунологических реакциях.
Для корреспонденции: Ригер Николай Александрович, д-р мед. наук, ст. науч. сотр. лаборатории иммунологии ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», E-mail: rieger_63@mail.ru
