CC BY
127
УДК 616.36-006.6:576.385.5
М.В. Макарова, Н.Е. Доннер, Д.И. Флейшман, О.В. Морозова, Н.Л. Лазаревич
ЧАСТИЧНАЯ РЕВЕРСИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО ФЕНОТИПА ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК
ИНАКТИВАЦИЕЙ ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО ФАКТОРА РОСТА 02
РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Контактная информация:
Макарова Мария Викторовна, научный сотрудник лаборатории механизмов прогрессии эпителиальных опухолей НИИ канцерогенеза.
Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(495)324-14-10 e-mail: marivamakarova@inbox.ru
Статья поступила: 27.05.2009 г., принята к печати: 23.09.2009 г.
Резюме
Трансформирующие факторы роста (TGF в) являются важными цитокинами, участвующими в развитии гепатоцеллюлярных карцином. Повышенный уровень TGF в в плазме крови и моче пациентов свидетельствует
о прогрессии заболевания. В то время как влияние TGF в1 на процессы пролиферации, апоптоза и дифференци-ровки гепатоцитов активно исследуется, возможная роль TGF в2 в гепатоканцерогенезе практически не изучена. Для того чтобы исследовать роль гиперэкспрессии TGF в2 в развитии злокачественного фенотипа ГК, мы использовали экспериментальную модель одноступенчатой прогрессии ГК мышей, которая состоит из медленнорастущей дифференцированной ГК и выщепившегося из нее in vivo при подкожной перевивке быстрорастущего дедифференцированного варианта. Это модель характеризуется тем, что прогрессия ГК сопровождалась повышением экспрессии гена TGF в2. Подавляя синтез TGF в2 в культуре клеток, полученной из быстрорастущей ГК, с помощью малых интерферирующих РНК, мы предполагали оценить вклад TGF в2 в развитие злокачественного фенотипа. Снижение продукции TGF в2 привело к реактивации утраченной в бГК экспрессии транскрипционных факторов HNF4 и С/ЕВР , которые играют важную роль в установлении и поддержании дифференцированного фенотипа гепатоцитов. Более того, при подавлении синтеза TGF в2 произошло снижение скорости пролиферации и подвижности клеток линии дедифференцированной ГК.
Ключевые слова: гепатоцеллюлярная карцинома, дифференцировка, трансформирующий фактор роста (TGF в).
M.V. Makarova, N.E. Donner, D.I. Fleishman, O.V. Morozova, N.L. Lazarevich THE PARTIAL REVERSION OF HEPATOCYTES’ MALIGNANT PHENOTYPE BY INACTIVATION OF TRANSFORMING GROWTH FACTOR 02
N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow
Abstract
Transforming Growth Factors p (TGF p) are the main cytokines participating at the development of hepatocellular carcinoma. The high level of TGF p plasma and urine is the first sign of the disease. The involvement of tGfpi cell proliferation, apoptosis and differentiation is well documented. Here we focused on the possible role of TGF p2 hepato-cancerogenesis. To study the role of TGF p2 overexpression on the development of malignant hepatocarcinoma, we used the experimental one-step animal model. This model is characterized by high expression of TGF p2 experimental tumor. Using si-RNA technology to reduce the expression of TGF p2 hepatocytes derived from fast growing hepatocellular carcinomas. The reducing of TGF p2 expression results in reaction of transcriptional factor such as HNF4 and C/EBP participating at the differentiation of hepatocytes. Moreover, the blockade of TGF p2 expression reduces the proliferative rate and migration of cells.
Key words: hepatocellular carcinoma, differentiation, TGF p.
Введение
Гепатокарцинома является пятой по распространенности и третьей по уровню смертности опухолью в мире [21]. Интенсивные эпидемиологические исследования последних лет позволили идентифицировать множество факторов риска возникновения ГК. Однако ключевые молекулярные механизмы, лежащие в основе гепатоканцерогенеза, остаются недостаточно изученными.
В ходе прогрессии ГК происходят изменения активности внутриклеточных сигнальных каскадов и нарушения программы экспрессии гепатоспеци-фических генов.
Одними из основных молекулярных изменений сигнальных путей, идентифицированных для ГК человека, являются нарушения активности Wnt/p-ка-
тенин сигнального пути, р53, МАРК, ЛАК/ЗТЛТ, Ras и TGF в2-сигнального каскада [6]. TGFр является плейо-тропным цитокином, контролирующим различные свойства клеток организма, такие как пролиферация, подвижность, адгезия и дифференцировка опухолевых клеток. Генетические изменения компонентов TGF в-сиг-нального каскада описаны для опухолей различного происхождения, но его роль в канцерогенезе противоречива, так как TGF в в зависимости от клеточного контекста может проявлять либо свойства опухолевого супрессора, либо онкогенные черты.
Считается, что в нормальных клетках и на ранних этапах развития эпителиальных опухолей TGF в подавляет пролиферацию и индуцирует апоптоз, однако на более поздних стадиях прогрессии он индуцирует эпителиально-мезенхимальный переход, усиливает инвазию и метастазирование [20].
Роль TGF в в возникновении и развитии ГК также неоднозначна и недостаточно изучена. TGF в1 является значимым ингибитором пролиферации нормальных гепатоцитов. При повреждении печени TGF в1 сигнальный каскад активируется, останавливая рост регенерирующих гепатоцитов [7]. С другой стороны, у пациентов с ГК уровень TGF в1 в плазме крови и моче повышен [25; 11]. Иммуно-гистохимическими методами было показано, что TGF в1 продуцируется в более чем 40 % исследованных образцов ГК [5].
У млекопитающих выявлены три белка семейства TGF в (Р1; Р2 и Р3), которые высоко гомологичны по аминокислотной последовательности. Однако при инактивации генов TGF в наблюдаются непохожие эффекты, что, по-видимому, свидетельствует о функциональном различии изоформ TGF в [19]. Большинство исследований, проводимых на гепатоцитах, посвящено изучению роли TGF в1 , однако наши результаты свидетельствуют о том, что активация TGF в-сигнального пути при прогрессии гепатокарцином может происходить за счет усиления транскрипции гена TGF в2.
Ранее нами была получена и охарактеризована модель одноступенчатой прогрессии ГК, которая состоит из медленнорастущей высокодифференцированной ГК мыши и одномоментно выще-пившегося из нее in vivo при подкожной перевивке быстрорастущего дедифференцированного варианта. В ходе прогрессии бГк приобрела ряд свойств, отличающих ее от мГК: резкое увеличение скорости роста in vivo, способность расти in vitro, снижение экспрессии дифференцировочных маркеров и изменение морфологических характеристик [18].
При прогрессии от мГК к бГК произошло координированное падение уровней экспрессии целого блока транскрипционных факторов, влияющих на установление и поддержание гепатоцитарного фенотипа. Самой вероятной причиной по крайней мере некоторых фенотипических изменений, произошедших в ходе прогрессии, является нарушение функции гепатоцитарного ядерного фактора HNF4a, снижение экспрессии которого по сравнению с нормальной печенью было описано ранее в ГК мыши [17] и крысы [13], а также в культурах дедифферен-цированных гепатом [24]. Экзогенная экспрессия HNF4 1 в культуре клеток бГК привела к частичной реверсии злокачественного фенотипа и снижению скорости пролиферации опухолевых клеток [18]. При сравнении спектров экспрессии генов в мГК, бГК, культуре бГК и нормальной печени мыши методом гибридизации с микрочипами, содержащими кДНК 9000 генов, было показано, что существенная часть генов, активировавшихся в ходе прогрессии от мГК к бГК, оказались TGF в - индуцируемыми, что указывает на вовлеченность этого сигнального пути в прогрессию опухолей печени [2]. Анализ экспрессии двух изоформ TGF в (Р1 и Р2) в панели химически индуцированных ГК мыши независимого происхождения и разного уровня дифференцировки показал, что дедифференцировка сопровождается гиперэкспрессией именно TGF в2, уровень экспрессии TGF в1 повышен по сравнению с нормальной печенью в образцах ГК различного уровня дифференци-ровки [4]. Основывая на этих данных, мы решили проверить, изменилась ли экспрессия TGF в2 при одноступенчатой прогрессии ГК мыши, и оценить вклад этого фактора в развитие злокачественного фенотипа дедифференцированной ГК с помощью подавления продукции TGF в2 в культуре клеток Н33, которая была получена из бГК.
Материалы и методы
Культивирование клеточных линий
Культуру клеток быстрорастущей низко -дифференцированной ГК, Н33 [1] и линию пакующих клеток HEK293T культивировали в среде DMEM (HyClone) с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone), глютамина (300 мкг/мл, ПанЭко) и антибиотика ципрофлокса-цина (10 мкг/мл) в атмосфере 5 %-ного СО2 при постоянно поддерживаемой в термостате температуре 37 °С.
Получение лентивирусов
Клетки HEK293T рассевали в количестве 1 106 на 6 сантиметровые чашки и через 6 часов проводили трансфекцию смесью из четырех векторов, три из которых кодировали структурные и функциональные белки лентивируса (pLP1, pLP2, pLP/VSVG, Invitrogen), а четвертый экспрессировал миРНК к TGF в2.
Лентивирусный вектор pLSL-puro, содержащий ген устойчивости к пуромицину, в который были клонированы последовательности, кодирующие малые интерферирующие РНК (миРНК) к гену TGF Р2, был любезно предоставлен проф. П.М. Чумаковым (ИМБ РАН). Последовательности миРНК 5'-TTATAGTTTTCTGATCACC-3' (ми TGF в2-1) и 5' -ATTAGCAGGAGATGTGGGG-3' (ми TGF в2-2), кодирующие миРНК к гену TGF в2, были синтезированы и клонированы в вектор pLSL-puro, полученные конструкции были проверены секвенирова-нием. В качестве контрольной культуры были использованы клетки Н33, инфицированные тем же вектором, не содержащим миРНК (H33-pLSL-puro).
Трансфекцию проводили стандартным кальций-фосфатным методом. Собранную с клеток HEK293T культуральную среду, содержащую вирусные частицы, центрифугировали, фильтровали и использовали для инфекции клеток Н33 в течение 3 дней. Через 24 ч после последнего добавления вируса в культуральную среду добавляли антибиотик пуромицин (в концентрации 3 мкг/мл) и проводили селекцию в течение 5 дней. Контрольные нетрансфицированные клетки Н33 погибали в течение 3-4 дней.
Выделение РНК
Суммарную клеточную РНК из образцов тканей и опухолей мышей или из культур клеток выделяли с помощью набора для выделения РНК «Wizard SV Total RNA Isolation System» (Promega) в соответствии с рекомендациями производителя. Ткани предварительно измельчали в парах жидкого азота в охлажденном гомогенизаторе Поттера. Качество полученной РНК определяли с помощью электрофореза в агарозном геле, концентрацию измеряли спектрофотометрически.
Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ)
С полученных препаратов РНК ставили реакцию ОТ: 3 мкг РНК смешивали с 0,1 мкг случайных гексамерных олигонуклеотидов (Синтол), денатурировали при 65 С и охлаждали на льду, затем добавляли ОТ-смесь (2 ед. обратной транскриптазы MMLV (Promega), соответствующий буфер, 2 мМ дитиотри-тола, 0,5 ед. ингибитора рибонуклеаз и смесь дезок-синуклеотид-трифосфатов, по 0,5 мМ каждого) и проводили реакцию ОТ при 42 °С 30 мин.
Реакцию останавливали инактивацией ревертазы при 94 °С 5 мин и доводили объем смеси до 100 мкл.
В состав ПЦР смеси входили: 1 мкл рабочего раствора специфических праймеров (0,5 мкМ) к соответствующим генам [18], 2,5 ед. Tag-полимеразы (Биомастер, 10000 ед/мкл), 2,5 мкл 10Х Tag-буфера без MgCl2 (Биомастер), 2,5 мМ MgCl2, 250 мкг/мкл каждого из ДНФ, 5 мкл смеси, полученной после ОТ, Н2О до конечного объема 25 мкл. Для проведения ОТ-ПЦР использовали амплификатор T3 Thermocycler (Biometra). Проводили первичную полную денатурацию (94 °С, 3 мин), каждый из ПЦР циклов включал этапы денатурации (94 °С, 50 сек), отжига праймеров (1 мин) и элонгации (72 °С,
1 мин); по окончании реакции проводили полное достраивание продукта (72 °С, 10 мин). Последовательности и температуры отжига праймеров доступны по запросу. Далее продукты ПЦР подвергали электрофоретическому разделению в 1,5 % агарозном геле, результаты документировали с помощью фотодокументирующей системы гелей DIGI DOC-IT (UVP). Для контроля равенства количества РНК, взятой в реакцию, проводили ОТ-ПЦР с праймерами к GAPDH (глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназе). Для проверки достоверности результатов ОТ-ПЦР повторяли трижды.
Определение количества TGFр2
Для определения концентрации TGF р2 в кондиционированной среде использовали набор для иммуноферментного анализа (ИФА) - DuoSet ELISA Development kit TGF[62 (R&D Systems, USA).
Не менее 2 106 клеток культуры Н33 высевали на 6 см чашку и культивировали в течение 48 часов, среду собирали, центрифугировали 10 мин при 5 000 об/мин, измеряли объем и фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм. Количество клеток подсчитывали в камере Горяева.
Количество активного и общего TGF р2 в пробах измеряли в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем. Оптическую плотность при длине волны 450 нм измеряли с помощью планшетного ридера «Униплан» (Пикон, Россия). Полученные значения нормализовывали по количеству клеток в 1 мл среды.
Определение скорости пролиферации
Для определения скорости пролиферации использовали метод определения включения модифицированного нуклеотида - 5-бромдезоксиуридина (5-BrdU) в ДНК, с последующей иммунофлуоресцент-ной окраской специфическими моноклональными антителами к модифицированному нуклеотиду.
1,5 105 клеток высевали на 3 см чашку, на следующий день добавляли 10 мкМ 5-BrdU (Sigma) на 2 часа и инкубировали при 5% СО 2 и 37 °С. Препараты промывали 3-4 раза забуференным физиологическим раствором и фиксировали холодным метанолом при -20°С в течение 20 мин. После фиксации клетки отмывали ЗФР в течение 10 мин, инкубировали в 4Н соляной кислоте в течение 10 мин и промывали ЗФР 3 раза по 5 мин. Затем проводили иммунофлуоресцентное окрашивание по стандартной методике. Моноклональные антитела мыши к 5-BrdU (ZymoResearch) использовали в разведении 1:200; антитела козы к IgG мыши с флуоресцентной меткой Alexa-Fluor 488 (Invitrogen) - в разведении 1/200.
Для подсчета окрашенных клеток использовали флуоресцентный микроскоп Axioplan 2 (Carl Zeiss). Уровень пролиферации определяли как отношение количества окрашенных клеток к общему количеству клеток в поле зрения. Для каждого препарата было подсчитано не менее 1000 клеток.
Определение подвижности клеток
В 24-луночную плашку помещали инвазионные камеры с порами размером 8 мкм (BD Biosciences). В лунку плашки добавляли 500 мкл среды с 5 %-ным содержанием сыворотки. В камеру добавляли суспензию, содержащую 1*105 клеток в бессывороточной среде и культивировали в течение 24 ч. Затем клетки, которые остались в верхней части камеры, тщательно удаляли с помощью ватных палочек, а клетки, проползшие через поры, окрашивали витальным красителем Cell Stain 20294 (Chemicon International). Общее количество мигрировавших клеток определяли как сумму клеток, которые проползли через поры и остались прикрепленными к нижней части камеры, и клеток, которые проползли и попали в лунку плашки. Подвижность клеток определяли как процентную долю общего количества мигрировавших клеток экспериментальной культуры по отношению к общему количеству таких клеток в контрольной культуре.
Результаты
Одноступенчатая прогрессия ГК сопровождается активацией экспрессии гена TGFр2
Для проверки предположения об активации экспрессии генов TGF р1 и TGF р2 в ходе прогрессии ГК уровни транскрипции этих генов были проанализированы в ряду нормальная печень, мГК, бГК и Н33 методом ОТ-ПЦР (рис. 1). Уровень экспрессии гена TGF pi во всех опухолях превышал детектируемый в нормальной печени, однако в бГК и Н33 по сравнению с мГК он практически не изменился. В то же время, в ходе прогрессии ГК была обнаружена значительная индукция транскрипции гена TGF р2.
В соответствии с полученными ранее результатами [18], параллельно с активацией экспрессии гена TGf р2, в бГК и Н33 было выявлено значительное снижение уровня транскрипции гена HNF4 (см. рис. 1), который играет ключевую роль в дифференцировке нормальных гепатоцитов в процессе эмбриогенеза и в поддержании гомеостаза нормальной печени во взрослом организме [3].
мГК__________6ГК п нзз
GAPDH
HNF4CX
TGF|)2
Рис. 1. Изменение экспрессии HNF4 , TGF pi и TGF р2 при одноступенчатой прогрессии ГК: ОТ-ПЦР анализ уровней экспрессии мРНК в мГК, бГК, нормальной печени (П), культуре Н33. Для контроля равенства количества РНК, взятой в реакцию, приведены результаты ОТ-ПЦР с праймерами к кДНК глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH).
Таким образом, наблюдающаяся в ходе одноступенчатой прогрессии ГК активация TGF р-сигналь-ного пути могла быть вызвана активацией экспрессии TGF р2. Более того, снижение уровня дифференциров-ки ГК, обусловленное падением экспрессии ключевого регулятора этого процесса для гепатоцитов - HNF4a, могло быть связано с гиперэкспрессией TGF р2. На следующем этапе работы мы решили проверить, какое влияние будет оказывать инактивация синтеза TGF р2 на пролиферацию, подвижность и экспрессию TGF р-зависимых генов в культуре клеток Н33.
Подавление продукции TGF р2 в культуре дедифференцированной гепатокарциномы НЗЗ
Для выяснения возможной роли TGF в2 в качестве фактора, индуцирующего прогрессию ГК, мы разработали систему для специфического подавления продукции TGF в2 в культуре Н33, полученной из дедифференцированной ГК.
Для этого были созданы лентивирусные экспрессирующие вектора, кодирующие малые интерферирующие РНК к гену TGF в2.
С помощью программы siRNA Scales (http://gesteland.genetics.utah.edu/siRNA scales) нами были подобраны две последовательности, которые предположительно должны были эффективно подавлять продукцию TGF в2 и не имели гомологии с кодирующими последовательностями других генов этого семейства. Эти последовательности были синтезированы и клонированы в лентивирусный вектор pLSL-puro, содержащий ген устойчивости к пуромицину (pLSL-puro-ми TGF в2-1 и pLSL-puro-ми TGF в2-2). Клетки Н33 заражали лентивирусами, кодирующими последовательности миРНК к гену TGF в2, и проводили селекцию трансдуцированных клеток на пуромицине. В качестве контрольной культуры были использованы клетки Н33, инфицированные тем же вектором, не содержащим миРНК (Н3 3-pLSL-puro).
Уровни секреции белка TGF в2 в клетках Н33, трансформированных pLSL-puro-ми TGF в2-1 (Н33-ми TGF в2-1), pLSL-puro-ми TGF в2-2 (Н33-ми TGFв2-2), и в контрольной культуре ffi3-pLSL-puro определяли методом ИФА. Большая часть TGF в2, секретируемого клетками Н33, связана с LAP-пептидом и не определяется методом ИФА. Однако при воздействии экстремальных значений рН связь между процессированным цитокином и LAP-пептидом разрушается, что позволяет определить общее содержание TGF в2 в кондиционированной среде. На рис. 2 представлена диаграмма, которая отражает падение уровня продукции TGF в2 в культурах, экспрессирующих миРНК TGF в2, в процентном отношении по сравнению с контрольной культурой H33-pLSL-puro.
ioo
go
НЭЭ-pLSL-puro
НЭЭ-ми TGF 02-1
Н33-миTGFp2-2
Рис. 2. Снижение количества TGF 2 в кондиционированной среде Н33-ми TGF 2-1 и Н33-ми TGF 2-2: Результаты определения общего количества TGF 2 методом ИФА представлены в виде процентного соотношения между количеством TGF 2, секретируемого контрольной культурой, и количеством TGF 2 в кондиционированной среде линий Н33-ми TGF 2-1 и Н33-ми TGF 2-2.
Оказалось, что две последовательности миРНК в разной степени подавляют экспрессию TGF @2: в культуре Н33-ми TGF в2-1 регистрировалось примерно трехкратное снижение продукции по сравне-
нию с контролем, в то время как в культуре Н33-ми TGF в2-2 произошло подавление лишь в 1,5 раза. Эти данные согласуются с результатами ОТ-ПЦР со специфическими праймерами к гену TGF в2 (рис. 3), демонстрирующими значительное снижение количества мРНК TGFв2 в культурах Н33-ми TGFв2-1 и в-2 по сравнению с контрольными клетками. Необходимо отметить, что последовательности миРНК TGF в2 были специфичны и не повлияли на уровень транскрипции гена TGF в1 (см. рис. 3).
Рис. 3. Влияние подавления продукции TGF в2 на экспрессию генов, регулирующих дифференциров-ку гепатоцитов, в клеточной линии Н33:
Результаты ОТ-ПЦР: дорожка 1 - H33-pLSL-puro, дорожка 2, 3 - Н33-ми TGF в2-1 и Н33-ми TGF Р2-2, экспрессирующие миРНК к TGF в2. Для контроля равенства количества РНК, взятой в реакцию, приведены результаты ОТ-ПЦР с праймерами к GAPDH.
Таким образом, нам удалось разработать систему специфического подавления экспрессии TGF в2 в клеточной линии дедифференцированной ГК Н33.
Влияние снижения продукции TGF р2 на экспрессию гепатоспецифических транскрипционных факторов
Как уже было отмечено выше, в ходе прогрессии в бГК произошло снижение экспрессии целого блока транскрипционных факторов, влияющих на установление и поддержание дифференцированного фенотипа гепатоцитов. Экзогенная реэкспрессия одного из них - HNF4a, привела к частичному восстановлению дифференцированного фенотипа клеточной линии Н33 и повышению экспрессии других гепато-цитарных ядерных факторов и маркеров дифферен-цировки. Таким образом, нам представилось важным оценить возможное влияние снижения продукции TGF в2 на экспрессию гена HNF4 в культуре Н33.
По данным ОТ-ПЦР, в линии Ю3-ми TGF в2-1, где продукция TGF в2 максимально снижена по сравнению с контрольными клетками и клетками Н33-ми TGF в2-2, произошла активация подавленной в исходной культуре транскрипции HNF4a. Кроме того, было выявлено повышение уровня экспрессии транскрипционного фактора C/EBPa и бетагликана (см. рис. 3). Бетагликан или рецептор TGF fiIII типа (T pRIII) не имеет внутриклеточного киназного домена и, соответственно, не способен участвовать во внутриклеточной передаче сигнала, но принимает участие в активации и накоплении TGF в на поверхности клеток и модулирует его связывание с сигнальными рецепторами T вШ и T eRII.
bo
7o
6o
5o
4o
3o
2o
io
o
Сниженная по сравнению с нормальными тканями экспрессия T вКШ или отсутствие таковой обнаружены в опухолях молочной железы, яичников, легких и поджелудочной железы, более того, это снижение коррелирует с гиперэкспрессией TGF в и со стадией прогрессии опухоли [10; 12; 16]. Обработка цитокином TGF в1 клеточных линий, полученных из карцином молочной железы, яичников и поджелудочной железы приводит к падению экспрессии T вМИ [14]. Ряд авторов предполагают возможную противоопухолевую роль этого белка, так как он способен блокировать действие цитокинов семейства TGFв [10; 12; 16].
Невысокое, но достоверное восстановление экспрессии гена HNF4 при подавлении продукции TGF в2 в клетках дедифференцированной гепатомы Н33, является важным результатом, указывающем на возможную роль активации гена TGF в2 в прогрессии ГК. В предыдущих работах нашей лаборатории на различных системах, в том числе при анализе изменения уровней транскрипции генов опухолевых образцах ГК человека, было показано, что снижение экспрессии HNF4a определяет уровень дифференцировки опухолей и коррелирует со стадией прогрессии ГК [4]. Также было продемонстрировано, что в культуре Н33 ген HNF4a инактивирован не за счет мутации или делеции, а за счет транскрипционной регуляции, предположительно -репрессором, который связывается с определенным районом в промоторе Р1 этого гена.
В настоящей работе нами впервые показана возможность реактивации транскрипции эндогенного гена Н^4а, которая была вызвана подавлением продукции TGF в2. Вероятно, TGF в2 активирует возможный репрессор, который и подавляет транскрипцию HNF4a.
Важно заметить, что в образцах ГК мыши описано также снижение экспрессии гена C/EBPa, вовлеченного в контроль дифференцировки и пролиферации гепатоцитов [15]. Реэкспрессия этого гена в клетках Н33 при подавлении функции TGF в2 также свидетельствует в пользу гипотезы о роли TGF в2 как фактора, способствующего прогрессии ГК.
Подавление продукции TGF в2 приводит к снижению скорости пролиферации клеток линии Н33
На различных модельных системах, в том числе в культурах клеток гепатоцитарного происхождения (НиН7 и HepG2) было показано, что HNF4a может активировать транскрипцию р21, подавляя, таким образом, пролиферацию этих клеток [8]. Для фактора С/ЕВРа также предложено несколько возможных механизмов участия в контроле пролиферации в различных типах клеток [23].
Для оценки скорости пролиферации клеток Н33 с подавленным синтезом TGF в2 был использован метод включения 5-ВМи в ДНК. В контрольной культуре НЗЗ-рЬ^Ь-рито примерно 70 % клеток были окрашены, при подавлении синтеза TGF в2 процент пролиферирующих клеток снизился до 55% в культуре Ю3-ми TGF в2-1 и 60% в культуре Н33-ми TGFв2-2 (рис. 4).
Таким образом, подавление продукции TGF в2 в культуре Н33 привело к снижению скорости пролиферации клеток. Более того, уровень такого снижения коррелировал со степенью подавления продукции TGF в2, то есть в культуре, где миРНК TGF в2 более эффективно подавили синтез TGF в2, замедление пролиферации оказалась более значительным по сравнению с линией Н33-ми TGF в2-2, где экспрессировалась менее эффективная последовательность миРНК TGF в2.
Рис. 4. Подавление продукции TGF р2 в культуре Н33 приводит к снижению скорости пролиферации клеток: Скорость пролиферации клеточных линий
H33-pLSL-puro, Н33-ми TGF в2-1 и Н33-ми TGF @2-2, определенная по включению модифицированного нуклеотида 5-BrdU в ДНК.
Вероятно, эффект подавления пролиферации может быть обусловлен как реэкспрессией HNF4 и C/EBP , так и непосредственно подавлением продукции TGF @2, так как цитокины семейства TGF в, как было отмечено ранее, могут индуцировать клеточный цикл посредством различных механизмов [9; 22].
Подавление продукции TGF р2 приводит к повышению подвижности клеток линии Н33
Поскольку известно, что TGF в1 участвует в регуляции инвазии и подвижности различных типов эпителиальных клеток [16], мы решили исследовать, влияет ли подавление продукции TGF в2 на подвижность клеток дедифференцированной гепа-томы H33. При постановке теста на определение клеточной подвижности мы использовали инвазионные камеры с мембранами, содержащими поры. В верхнюю часть камеры наливали среду без сыворотки с клетками, в лунку плашки помещали среду с 5%-ным содержанием сыворотки. Таким образом, клетки по градиенту концентрации сыворотки проползали через мембрану с порами 8 мкм. Через сутки клетки, которые остались на верхней стороне мембраны, удаляли, а клетки, которые проползли сквозь поры, окрашивали и подсчитывали. Мы обнаружили, что в культуре Н33-ми TGF в2-1, где подавление TGF в2 было наиболее значительным, произошло резкое снижение подвижности клеток: количество клеток, которое прошло через мембрану, было в 7 раз меньше аналогичного показателя для контрольной культуры H33 puro. Подвижность клеток культуры Н33-ми TGF в2-2 снизилась в 3 раза по сравнению с контролем (рис. 5).
H33-pLSL-puro Н33-миTGFp2-1 Н33-миTGFp2-2
Рис. 5. Подавление продукции TGF[32 в культуре Н33 вызывает снижение подвижности клеток: Результаты представлены в виде процентного отношения количества клеток Н33-ми TGF Р2-1 и Н33-ми TGF Р2-2 к количеству контрольных клеток Н33-рЬ8Ь-рмго, которые проползли через мембрану (8 мкм) по градиенту сыворотки в среде. Результаты получены в трех независимых экспериментах.
Активность TGF [31 в качестве индуктора клеточной подвижности была продемонстрирована ранее на культурах клеток карцином яичников и поджелудочной железы [16]. Более того, при воздействии TGF в1 в этих культурах наблюдалось подавление экспрессии бетагликана, а реэкспрессия этого гена приводила к снижению клеточной подвижности. Так как в исследуемой системе наблюдается снижение подвижности клеток и повышение экспрессии бетагликана, можно предположить, что бетагликан также вносит вклад в изменение клеточной подвижности в этой системе.
Заключение
Итак, мы показали, что при подавлении продукции TGF /32 в культуре дедифференцированной гепа-томы Н33 произошла реактивация транскрипции двух генов, экспрессия которых критична для поддержания дифференцировки гепатоцитов, и нарушение функции которых описано для ГК - HNF4a и С/ЕВРа. Более того, снижение синтеза TGF [32 привело к снижению таких ключевых для опухолевых клеток характеристик, как скорость пролиферации и подвижность.
Литература
1. Кудрявцева Е.И., Морозова О.В., Рудинская Т.Д., Энгельгардт Н.В. Нарушение межклеточных контактов и взаимодействия клеток с внеклеточным матриксом в быстрорастущей гепатокарциноме мышей // Архив патологии. - 2001. - Т. 4. - С. 33-7.
2. Лазаревич Н.Л. Изменения спектров экспрессии генов при гепатоканцерогенезе и прогрессии опухолей печени. - Ав-тореф. дисс. ... д-ра биол. наук, М., МГУ - 2003.
3. Лазаревич Н.Л., Флейшман Д.И. Ткане-специфические транскрипционные факторы в прогрессии эпителиальных опухолей // Биохимия. - 2008. - Т. 73. - С. 713-734.
4. Флейшман Д.И., Морозова О.В., Лазаревич Н.Л. Сравнительная характеристика гепатокарцином мыши с различной степенью дифференцировки // Вестник Российского онкологического научного центра им. НН. Блохина РАМН. -2008. - Т. 2. - С. 19-23.
5. Abou-ShadyM., BaerH.U., FriessH. et al. Transforming growth factor betas and their signaling receptors in human hepatocellular carcinoma // Am. J. Surg. - 1999. - Vol. 177 - P. 209-15.
6. Aravalli R.N., Steer C.J., Cressman E.N. Molecular mechanisms of hepatocellular carcinoma //Hepatology. - 2008. - Vol. 49 -P. 2047-63.
7. Bissell D.M., Wang S.S., Jarnagin W.R., Roll F.J. Cell-specific expression of transforming growth factor-beta in rat liver // J. Clin. Invest. - 1995. - Vol. 96 - P. 447-55.
8. Chiba H., Itoh T., Satohisa S. et al. Activation of p21CIP1/WAF1 gene expression and inhibition of cell proliferation by overex-
pression of hepatocyte nuclear factor-4alpha // Exp. Cell. Res. - 2005. - Vol. 302. - P. 11-21.
9. Derynck R., Zhang Y.E. Smad-dependent and Smad-independent pathways in TGF-beta family signaling // Nature. - 2003. -Vol. 425. - P. 577-84.
10. DongM., How T., Kirkbride K.C. et al. The type III TGF-beta receptor suppresses breast cancer progression // J. Clin. Invest. -2007. - P. 206-17.
11. Dong Z.Z., Yao D.F., Yao M. et al. Clinical impact of plasma TGF-beta1 and circulating TGF-beta1 mRNA in diagnosis of
hepatocellular carcinoma // Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int. - 2008. - Vol. 7 - P. 288-95.
12. Finger E.C., Turley R.S., Dong M. et al. TbetaRIII suppresses non-small cell lung cancer invasiveness and tumorigenicity //
Carcinogenesis - 2008. - P. 528-35.
13. Flodby ^ P., Liao D. Z., Blanck A. et al. Expressionof the liverenriched transcription factors C/EBP alpha, C/EBP beta, HNF1, and HNF4 in preneoplastic nodules and hepatocellular carcinoma in rat liver // Mol. Carcinog. - 1995 - Vol. 12 - P. 103-9.
14. Gordon K.J., Dong M, ChislockE.M. et al. Loss of type Ш transforming growth factor beta receptor expression increases motility and invasiveness associated with epithelial to mesenchymal transition during pancreatic cancer progression//Carcinogenesis. -2007. - P. 252-62.
15. Greenbaum L.E., Cressman D.E., Haber BA., Taub R. Coexistence of C/EBP alpha, beta, growth-induced proteins and DNA synthesis in hepatocytes during liver regeneration. Implications for maintenance of the differentiated state during liver growth // J. Clin. Invest. - 1995. - Vol. 96. - P. 1351-65.
16. Hempel N., How T., Dong M. et al. Loss of betaglycan expression in ovarian cancer: role in motility and invasion // Cancer Res. - 2007. - P. 5231-8.
17. Kalkuhl A., Kaestner K., Buchmann A., Schwarz M. Expression of hepatocyte-enriched nuclear transcription factors in mouse liver tumours // Carcinogenesis. - 1996. - Vol. 17 - P. 609-12.
18. Lazarevich N.L., Cheremnova O.A., Varga E.V. et al. Progression of HCC in mice is associated with a downregulation in the expression of hepatocyte nuclear factors // Hepatology. - 2004. - Vol. 39. - P. 1038-47.
19. Massague J. TGF-beta signal transduction // Annu. Rev. Biochem. - 1998. -P. 753-91.
20. Pardali K., Moustakas A. Actions of TGF-P as tumor suppressor and pro-metastatic factor in human cancer // Biochimica et Biophysica Acta. - 2007 - Vol. 1775 - P. 21-62.
21. Parkin D.M., BrayF., Ferlay J., PisaniP. Global cancer statistics, 2002 // Cancer J. Clin. - 2005. - Vol. 55 - P. 74-108.
22. Sato S., Futakuchi M, Ogawa K. et al. Transforming growth factor beta derived from bone matrix promotes cell proliferation of prostate cancer and osteoclast activation-associated osteolysis in the bone microenvironment // Cancer Sci. - 2008. - Vol. 99. - P. 316-23.
23. Schuster M.B., Porse B.T. C/EBPalpha: a tumour suppressor in multiple tissues? // Biochim. Biophys. Acta - 2006. - Vol. 1766. - P. 88-103.
24. Spdth G.F., Weiss M.C. Hepatocyte nuclear factor 4 provokes expression of epithelial marker genes, acting as a morphogen in dedifferentiated hepatoma cells // J. Cell Biol. - 1998 - Vol. 140 - P. 935-46.
25. Tsai J.F., Chuang L.Y., Jeng J.E. et al. Clinical relevance of transforming growth factor-beta 1 in the urine of patients with hepatocellular carcinoma // Medicine (Baltimore). - 1997. - Vol. 76 - P. 213-26.
Все это свидетельствует в пользу того, что при подавлении продукции TGF в2 в культуре Н33 произошла частичная реверсия злокачественного фенотипа опухолевых клеток. Полученные результаты указывают на то, что разработка методов эффективного подавления продукции TGF в2 как in vitro, так и in vivo может оказаться перспективным направлением в развитии методов противоопухолевой терапии гепатоцеллюлярных карцином.
Благодарности
Авторы выражают благодарность проф. П.М. Чумакову за помощь в создании экспрессирующих векторов и Е.В. Сухаревой за техническое обеспечение работ.
Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований (07-04-01422) и грантом для поддержки ведущих научных школ РФ.
