CC BY
96
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ЧАСТИЧНАЯ РЕДИФФЕРЕНЦИРОВКА И... 17
УДК 616.37-006.66-07:575.117.2 М.С. Чесноков, И.Ф. Кустова, Д.А. Шавочкина, А.Г. Кузнецова и Н.Л. Лазаревич ЧАСТИЧНАЯ РЕДИФФЕРЕНЦИРОВКА И ПОНИЖЕНИЕ ВЫРАЖЕННОСТИ ЧЕРТ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОГО ФЕНОТИПА КЛЕТОК
ПРОТОКОВОЙ АДЕНОКАРЦИНОМЫ ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА ПРИ ЭКСПРЕССИИ ЯДЕРНОГО РЕЦЕПТОРА HNF4a
ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва
Контактная информация
Чесноков Михаил Сергеевич, аспирант лаборатории механизмов прогрессии эпителиальных опухолей НИИ Канцерогенеза
адрес: 115478, Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(499)323-53-22 e-mail: [email protected]
Статья поступила 11.07.2012, принята к печати 31.08.2012
Резюме
Ядерный рецептор HNF4a - важный регулятор дифференцировки печени и ряда других органов пищеварительного тракта. Нарушение его экспрессии ассоциировано с прогрессией опухолей печени, почки, желудка и кишечника. Однако значение нарушений его экспрессии в опухолях поджелудочной железы и потенциальные возможности использования модификаций его экспрессии для ингибирования опухолевой прогрессии на сегодняшний день не исследованы. В настоящей работе впервые исследовано влияние экзогенной экспрессии двух групп изоформ HNF4a, P1 и Р2, в дедифференцированных клетках протоковой аденокарциномы поджелудочной железы человека Panc1. Показана HNF4a-зависимая активация экспрессии основных регуляторов дифференцировки панкреатических клеток PDX1 и PTF1a. Экзогенная экспрессия HNF4a сопровождается ослаблением колониеобразующей и усилением миграционной способности клеток Panc1 и приближением клеточного фенотипа к характерному для частично дифференцированных панкреатических клеток-предшественников. Полученные данные дают возможность рассматривать HNF4a как возможную мишень для разработки новых способов диагностики и терапии этого вида опухолей.
Ключевые слова: протоковая аденокарцинома поджелудочной железы, HNF4a, изоформы, экзогенная экспрессия, уровень дифференцировки.
M.S. Chesnokov, I.F. Kustova, D.A. Shavochkina, A.G. Kuznetzova, N.L. Lazarevich
PARTIAL REDIFFERENTIATION
AND DECREASE IN MALIGNANT PROPERTIES
OF HUMAN PANCREATIC DUCTAL ADENOCARCINOMA CELLS
EXPRESSING NUCLEAR RECEPTOR HNF4a
FSBI «N. N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow
Abstract
Nuclear receptor HNF4a is a crucial regulator of differentiation in the liver and several other organs of digestive system. Impairment of its expression is associated with progression of liver, kidney, gastric and colorectal tumors. However the significance of its deregulation in pancreatic tumors and possibility to use the modifications of its expression for inhibition of tumor progression are yet not investigated. In present study the effect of exogenous expression of two groups of HNF4a isoforms, P1 and P2, in dedifferentiated human pancreatic ductal adenocarcinoma cell line Pancl was investigated for the first time. HNF4a-dependent activation of the key regulators of pancreatic differentiation PDX1 and PTFla expression was shown. HNF4a re-expression was associated with a decrease in colony formation and increase in migration ability of Pancl cells and phenotypic switch towards partially differentiated pancreatic precursor cells. Obtained data offer a possibility to consider HNF4a as a possible target for the development of new diagnostic and treatment approaches for pancreatic tumors.
Key words: pancreatic ductal adenocarcinoma, HNF4a, isoforms, exogenous expression, differentiation level.
Введение
Опухоли поджелудочной железы отличаются чрезвычайно высокой агрессивностью и крайне неблагоприятным прогнозом. 5-летняя выживаемость пациентов с такими опухолями не превышает 6 % [16]. Наиболее злокачественной формой является протоковая аденокарцинома, самый распространенный тип опухолей поджелудочной железы. Высокая смертность при протоковой аденокарциноме обусловлена трудностью ее ранней диагностики, низкой эффективностью существующих методов терапии и очень высокой скоростью прогрессии. У многих пациентов с опухолями поджелу-
дочной железы на момент постановки диагноза уже существуют удаленные метастазы.
Прогрессия опухолевых клеток выражается в ослаблении контроля пролиферации, приобретении способности к инвазии, утрате дифференцировки и других нарушениях. Изменение экспрессии генов, ответственных за эти проявления злокачественного фенотипа опухолевых клеток, в значительной мере определяется изменением активности множества ТФ. В разных типах клеток определяющее действие на транскрипцию генов оказывают различные системы ТФ. Одной из наиболее полно исследованных систем тканеспецифической регуляции транскрипции является сеть ГЯФ.
Эта система включает пять неродственных семейств ТФ, которые регулируют развитие и функции печени, поджелудочной железы, кишечника и ряда других органов [1]. Многочисленные исследования показали, что чрезвычайно важную роль в этой системе играет фактор HNF4a [9; 15]. Его экспрессия обнаружена в печени, поджелудочной железе, желудке, кишечнике и ряде других органов [18]. Показано, что HNF4a является регулятором дифференцировки и функциональной активности клеток печени, поджелудочной железы и тонкой кишки [3; 5; 9].
На сегодняшний день описано 12 изоформ фактора HNF4a, транскрибирующихся с двух независимо регулируемых промоторов, Р1 (a1-a6) и Р2 (a7-a12) [13]. Изоформы, транскрибирующиеся с разных промоторов (HNF4aP1 и HNF4aP2, соответственно), обладают различными транс-активационными свойствами [19]. Для различных тканей характерна экспрессия разных групп изоформ HNF4a: например, в нормальных гепатоцитах экспрессируются только изоформы группы HNF4aP1, а во взрослой поджелудочной железе - группы HNF4aP2 [18].
Нарушение нормальной экспрессии изоформ HNF4a в гепатоцитах коррелирует с возникновением и прогрессией гепатоцеллюлярной карциномы. Восстановление экспрессии изоформы HNF4a1 в клетках дедифференцированной гепатоцеллюляр-ной карциномы мыши H33 приводит к частичной реверсии их злокачественного фенотипа [12]. HNF4a играет роль опухолевого супрессора в клетках кишечника и почки [5; 7]. Описано антипроли-феративное влияние HNF4a на р-клетки поджелудочной железы [6], однако нарушения экспрессии и функций HNF4a, сопровождающие возникновение и прогрессию опухолей поджелудочной железы и, в частности, протоковой аденокарциномы, практически не исследованы. Дополнительным стимулом к исследованиям этой области стало выявление экспрессии HNF4a в протоковых клетках. Опухоли, образующиеся из них, отличаются крайне агрессивным фенотипом в силу повышенного пролиферативного потенциала и способности к дедиффе-ренцировке с последующей редифференцировкой в другие типы клеток поджелудочной железы [14]. Таким образом, HNF4a может оказаться потенциальной мишенью для терапии и профилактики опухолей поджелудочной железы, а исследование изменений его экспрессии в клетках протоковой аденокарциномы является актуальным и перспективным направлением молекулярной онкологии.
В настоящей работе показано, что опухолевую трансформацию протоковых клеток поджелудочной железы часто сопровождают нарушения экспрессии изоформ HNF4a. Впервые описано ослабление злокачественного фенотипа и повышение уровня дифференцировки дедифференцированных клеток протоковой аденокарциномы поджелудочной железы при экзогенной экспрессии в них изоформ HNF4aP1 и HNF4aP2.
Материалы и методы
Клеточные линии
В работе использованы линии клеток протоковой аденокарциномы поджелудочной железы человека CaPan2, AsPC1, Panc1 и MiaPaCa2 из банка клеточных культур Института цитологии РАН. Для получения лентивирусных частиц использовали линию эмбриональных клеток почки человека HEK293T (Invitrogen, США).
Клетки линий HEK293T, Panc1 и MiaPaCa2 культивировали в среде DMEM (Sigma-Aldrich, США), клетки линий CaPan2 и AsPC1 - в среде RPMI-1640 (ПанЭко, Россия). Среды содержали 10% фетальной телячьей сыворотки (Gibco, США), 300 мг/л глутамина (ПанЭко, Россия) и 10 мг/л антибиотика ципрофлоксацина. Культивирование проводили в атмосфере 5% СО2 при температуре +37 °С. Приблизительно раз в 5-7 дней клетки обрабатывали трипсином и пересевали.
Плазмидные векторы
В работе использовали:
1. Лентивирусные векторы для упаковки вирусных частиц pLP1, pLP2 и pCMV-VSVg (Invitrogen, США).
2. Лентивирусный вектор pLenti6/V5-D-TOPO, содержащий ген устойчивости к бластицидину (Invitrogen, США).
3. Лентивирусные вектора рLenti-HNF4a1-FLAG и рLenti-HNF4a7-FLAG, экспрессирующие кДНК изоформ HNF4a1 и HNF4a7, соответственно, и несущие ген устойчивости к бластицидину, полученные ранее в нашей лаборатории на основе вектора pLenti6/V5-D-T0P0.
Получение культур,
экспрессирующих изоформы HNF4a
Клетки линии HEK293T трансфицировали плазмидными векторами, используя метод кальций-фосфатной трансфекции. Три вектора (pLP1, pLP2, pCMV-VSVg) кодировали структурные белки вирусной частицы, четвертый вектор кодировал изоформу HNF4a1 или HNF4a7, либо нес только ген устойчивости к бластицидину. Культуральную среду, собранную с чашек с трансфицированными клетками HEK293T и содержащую лентивирусные частицы, фильтровали через фильтр с размером пор
0,45 мкм и вносили в чашки с клетками Panc1. Заражение проводили в течение 3 суток, ежедневно добавляя среду с лентивирусными частицами, после чего проводили селекцию клеток в среде, содержащей 3 мкг/мл бластицидина, в течение 14 суток. После селекции отбирали отдельные клоны, остальные клетки объединяли в смешанные культуры.
ОТ-ПЦР анализ экспрессии генов
Из клеток исследуемых культур получали образцы тотальной РНК с помощью набора «SV Total RNA Isolation System» (Promega, США) в соответствии с протоколом, предложенным производителем. Концентрацию РНК определяли по оптической плотности раствора, измеренной на спектрофотометре «NanoDrop-1000» (Thermo Scientific, США) при Х260 нм. Образцы кДНК получали с помощью метода обратной транскрипции, используя M-MLV-обратную транскриптазу, как описано ранее [2]. В реакцию обратной транскрипции брали по 2,5 мкг суммарной РНК.
Для определения уровней экспрессии генов применяли метод ПЦР с праймерами к генам циклофилина А (PPIA), PDX1, PTF1a и различным участкам гена HNF4a.
Реакцию с праймерами к PPIA использовали для контроля равенства количества кДНК, взятой в реакцию. Последовательности праймеров, использованных в работе, доступны по запросу.
Подбор праймеров осуществляли в программе Primer3, синтез осуществляла фирма «Синтол», Москва. ПЦР проводили в амплификаторе «Biometra T3
Thermocycler» (Biometra, Германия). Использовали ранее описанную схему постановки ПЦР [2]. В реакцию вносили по 0,1-0,2 мкг кДНК. Температура отжига и число циклов амплификации были подобраны экспериментально для каждой пары праймеров так, чтобы реакция останавливалась в логарифмической фазе. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 2,0 %-ном агарозном геле, документировали с помощью системы «UVP Doc-It LS Image Analysis Software» (UVP, США).
Анализ колониеобразующих свойств В чашки Петри 03 см (Greiner Bio One, Германия) вносили по 1000 клеток и культивировали 14 сут. Образовавшиеся колонии клеток фиксировали метанолом при -20°С и окрашивали гематоксилином Майера (BioVitrum, Россия). Для документации и анализа результатов использовали пакет программ «Total Lab 2.01».
Анализ активности синтеза ДНК Относительную активность синтеза ДНК в исследуемых клетках определяли по включению 5'-бромдезоксиуридина (5'-BrdU), включающегося в синтезируемую ДНК вместо тимина. На чашки Петри высевали по 100000 клеток. Через 1-2 дня после рассева (в логарифмической фазе роста) клетки инкубировали 2 ч в среде, содержащей 10 мМ 5’-BrdU. После инкубации клетки фиксировали метанолом при -20 °С 20 минут, обрабатывали 1 %-ным раствором Triton X-100 (Хеликон, Россия) 3 минуты и 4 Н раствором HCl 10 мин при комнатной температуре. Неспецифическое связывание блокировали 3%-ным р-ром BSA (Sigma-Aldrich, США) на PBS. Препараты последовательно окрашивали антителами мыши к 5’-BrdU (1 : 100, Zymo Research, США) и антителами козы к у-глобулинам мыши, конъюгированными с флюоресцентной меткой Alexa 488 (1 : 200, Invitrogen, США). Долю клеток, меченых 5'-BrdU, подсчитывали с помощью флюоресцентного микроскопа Axioplan 2 (Carl Zeiss, США).
Определение кинетики роста клеточных культур
В лунки 96-луночного планшета вносили по 2000 клеток, инкубировали планшеты при 37°С в атмосфере 5 %-ного СО2 в течение 3; 24; 72 и 96 ч. После инкубации определяли количество клеток в лунках планшета с помощью набора для определения клеточной пролиферации «CyQUANT NF Cell Proliferation Assay Kit» (Invitrogen, США) согласно протоколу, предлагаемому изготовителем. Интенсивность флюоресценции определяли с помощью плашечного считывателя «Plate CHAMELEON V» (Hidex Ltd., Финляндия). Для возбуждения флюоресценции использовали свет с Х495 нм, регистрировали излучение с Х535 нм.
Анализ способности к направленной миграции В лунки 24-луночного планшета устанавливали вставки для определения направленной миграции в камере Бойдена «BD Falcon Cell Culture Insert» (BD Biosciences, США) с размером пор 8,0 мкм. В верхнюю камеру вносили 10000 клеток в среде, не содержащей сыворотки. В нижнюю камеру вносили среду, содержащую 5% фетальную телячью сыворотку в качестве хемоаттрактанта. Планшет с камерами инкубировали при 37 °С в атмосфере 5% СО2 в течение 16 ч. После инкубации
удаляли клетки из верхней камеры ватной палочкой, клетки на нижней стороне мембраны окрашивали 2% раствором кристаллвиолета и подсчитывали при помощи микроскопа.
Статистическая обработка данных
Все эксперименты выполняли не менее, чем в трех повторностях. Данные обрабатывали в программном пакете «Microsoft Office Excel 2003». Для определения достоверности отличий использовали двухвыборочный t-тест с различными дисперсиями.
Результаты и обсуждение
Изменения экспрессии изоформ HNF4a были исследованы в линиях протоковой аденокарциномы поджелудочной железы человека с различным уровнем дифференцировки: CaPan2, AsPc1, Panc1, MiaPaCa2. Линия CaPan2 состоит из высокодифференцированных клеток, сохраняющих эпителиальную морфологию; линия AsPC1 характеризуется умеренно-дифференцированным фенотипом; для линий Panc1 и MiaPaCa2 характерен крайне низкий уровень дифференцировки и фибробластоподобная морфология [17]. Методом ОТ-ПЦр со специфическими праймерами к группам изоформ HNF40P1 и HNF4aP2 (рис. 1) было установлено, что в высокодифференцированной линии CaPan2 экспрессируются изоформы HNF4aP2, характерные для нормальной поджелудочной железы. В клетках умереннодифференцированной линии AsPC1 активируется экспрессия несвойственной для поджелудочной железы группы изоформ HNF4aP1. Для низкодифференцированных линий Panc1 и MiaPaCa2 характерно подавление экспрессии обеих групп изоформ HNF4a (рис. 2). Эти данные указывают на то, что, как и в ряде других эпителиальных тканей, дедифференцировка клеток протоковой аденокарциномы поджелудочной железы ассоциирована с нарушением нормальной экспрессии изоформ HNF4a.
Для исследования влияния экзогенной экспрессии HNF4a на уровень дифференцировки и биологические характеристики клеток протоковой аденокарциномы поджелудочной железы человека была использована дедифференцированная линия Panc1, в которой экспрессия изоформ HNF4a не выявляется. Поскольку изоформы групп HNF4aP1 и HNF4aP2 обладают разными транс-активационными свойствами, были отдельно исследованы эффекты, вызываемые экспрессией как HNF4aP1, так и HNF4aP2 изоформ. С помощью лентивирусной инфекции с последующей селекцией на антибиотике бластицидине нами были получены отдельные клоны и смешанные культуры линии Panc1, экзогенно экспрессирующие изоформы HNF4a1 (группа изоформ Р1) и HNF4a7 (группа изоформ Р2). Из всех полученных культур была выделена РНК и методом ОТ-ПЦР проведено сравнение уровней экспрессии гена HNF4a (результаты не представлены). В качестве контрольной культуры использовали клетки линии Panc1, не экспрессирующие экзогенный HNF4a (далее «Panc1-K»). Для дальнейших исследований из каждого варианта были выбраны клоны (далее обозначены «cl») и смешанные линии (далее обозначены «mix») с наиболее высокими уровнями экспрессии соответствующего трансгена (далее «Panc1-HNF4a1», «Panc1-HNF4a7»). Повышение синтеза HNF4a в полученных культурах было подтверждено методом иммуноблоттинга с антителами к белку HNF4a, специфическими к консервативной последовательности всех изоформ (результаты не представлены).
Методом ОТ-ПЦР в полученных культурах были проанализированы уровни экспрессии отдельных изоформ HNF4a, а также уровни экспрессии двух ключевых факторов дифференцировки клеток поджелудочной железы, PDX1 и PTF1a.
Экспрессию отдельных изоформ HNF4a определяли, используя праймеры, фланкирующие вариабельные участки гена. Праймеры нNF4aP1, фланкирующие участок, содержащий вставку длиной 90 п. н., характерную для изоформ a4-a6, были использованы для определения суммарной экспрессии изоформ HNF4a1-a3 (продукт длиной 139 п. н.) и HNF4a4-a6 (229 п. н.). Праймеры HNF4aP2 использовали для определения суммарного уровня экспрессии группы изоформ HNF4a7-a12. Для определения уровней экспрессии изоформ HNF4a2, HNF4a5, HNF4a8 и HNF4a11 внутри групп использовали праймеры HNF4a2, позволяющие по размеру ПЦР-продуктов определить наличие вставки длиной 30 п. н., отличающей изоформы a2, a5, a8 и a11 от a1, a4, a7 и a10, соответственно. Праймеры HNF4a3 использовали для выявления изоформ HNF4a3, HNF4a6, HNF4a9 и HNF4a12, отличающихся альтернативной последовательностью 3'-конца мРНК (рис. 1).
Результаты ОТ-ПЦР приведены на рис. 3. Как видно из рисунка, экзогенная экспрессия изоформы HNF4a1 в клетках Panc1 не вызывает активации экспрессии изоформ группы HNF4aP2, характерных для нормальных протоковых клеток поджелудочной железы [14]. Экспрессии изоформ HNF4a2-a6 в исследованных культурах HNF4a1 обнаружено не было (результаты для HNF4a3 и HNF4a6 не представлены).
Реэкспрессия изоформы HNF4a7 в клетках Panc1 не сопровождается активацией транскрипции изоформ группы HNF4aP1. В культурах Panc1-HNF4a7 обнаружена активация эндогенной экспрессии изоформы HNF4a8, описанной в нормальной ткани поджелудочной железы [8]. Восстановление эндогенной экспрессии с промотора Р2 свидетельствует о том, что подавление активности гена HNF4a, наблюдаемое в линии Panc1, не связано с нарушением последовательности гена или его промотора Р2 и, по всей видимости, осуществляется на уровне транскрипции. Это указывает на возможность реактивации этого гена в опухолевых клетках.
Во всех исследованных культурах, экспрессирующих изоформы HNF4a1 или HNF4a7, нами была обнаружена активация экспрессии генов PDX1 и PTFla, кодирующих два основных регулятора дифференцировки панкреатических клеток [4]. Исчезновение экспрессии этих генов характерно для низкодифференцированных клеток протоковой аденокарциномы поджелудочной железы, их реактивация указывает на повышение уровня диффе-ренцировки клеток линий Panc1-HNF4a1 и Panc1-HNF4a7 по сравнению с контрольной линией, не экспрессирующей HNF4a. HNF4 a-зависимая активация PDX1 и PTF1a описана нами впервые, идентификация молекулярных механизмов этого процесса требуют дальнейших исследований.
Повышение уровня дифференцировки культур Panc1, экспрессирующих изоформы HNF4a, сопровождается изменением транскрипционной программы, выполняющейся в клетке. Такие изменения могут приводить к значительным изменениям биологических характеристик клеток, таких как колониеобразующая способность, пролиферативная активность и подвижность. Анализ этих клеточных
свойств позволяет оценить возможные изменения злокачественного фенотипа исследуемых клеток и таким образом установить онкогенное или опухолесупрессорное влияние исследуемого фактора.
Для определения устойчивости опухолевых клеток к аноикису, их способности к адгезии на субстрате и образованию очага пролиферации в условиях in vitro был использован клоногенный тест, основанный на подсчете количества колоний, образуемых исследуемыми клетками в условиях высокого разведения. Как показано на рис. 4, клетки культур Panc1, экзогенно экспрессирующих изоформы HNF4a, обладают пониженной способностью к образованию колоний из одиночных клеток. Принципиальных различий между эффектами, оказываемыми на исследованные линии экзогенными изоформами HNF4a1 и HNF4a7, выявлено не было.
Пролиферативные свойства клеток культур Panc1-HNF4a были исследованы с помощью двух методов: определения количества клеток культур на стадии логарифмического роста и подсчета доли клеток, находящихся в S-фазе клеточного цикла, по включению в синтезируемую ДНК 5'-BrdU. Полученные результаты приведены на рис. 5. Ни в скорости роста клеточных культур, ни в доле клеток, активно синтезирующих ДНК, значительных изменений для клеток Panc1, экспрессирующих изоформы HNF4a, по сравнению с культурой Panc1-K, обнаружено не было. Слабое повышение ДНК-синтетической активности в клетках Panc1-HNF4a1 не приводит к значимым изменениям кинетики роста этих культур относительно линии Pand-К, что говорит о независимости пролиферативных свойств этих клеток от уровня экспрессии изоформ HNF4a.
Эксперименты, проведенные ранее на различных линиях опухолевых клеток, продемонстрировали, что экзогенная экспрессия изоформ HNF4a приводит к замедлению пролиферации клеток линий Н33 (гепатокарцинома мыши), HEK293 (эмбриональный эпителий почки человека) и INS-1 (трансформированные р-клетки поджелудочной железы крысы) [6; 7; 12]. Возможно, отсутствие влияния экспрессии HNF4a на пролиферацию в исследуемой системе обусловлено дополнительными нарушениями HNF4a-зависимых путей регуляции клеточного цикла в линии Panc1.
Для сравнения миграционных свойств HNF4a-экспрессирующих и контрольных культур Panc1 был проведен тест на способность к направленной миграции в модифицированных камерах Бойдена под действием аттрактанта. Результаты, полученные в процессе определения миграционного потенциала исследуемых культур, приведены на рис. 6. Экзогенная экспрессия обеих изоформ HNF4a в клетках Panc1 сопровождается значительным повышением их способности к направленной миграции по градиенту аттрактанта по сравнению с клетками, не экспрессирующими HNF4a. Этот неожиданный результат плохо сочетается с приведенными выше данными о частичной редифферен-цировке клеток культур Panc1-HNF4a и ослаблении их колониеобразующего потенциала, которые давали повод предполагать, что реэкспрессия HNF4a приведет к ослаблению миграционного потенциала. Однако полученные данные согласуются с информацией о значительном повышении способности клеток Panc1 к направленной миграции при экзогенной экспрессии в них фактора PDX1 [11], активирующегося также в HNF4a-экспрессирующих культурах Panc1.
Рапс1-НМР4а1-сІ5 Рапс1-НМР4а1-тіх
Рис. 1. Схема строения гена Н№4а. Указаны вариабельные участки и места связывания праймеров для определения экспрессии различных изоформ.
Рис. 2. Изменения уровней экспрессии изоформ Н№4а и регуляторов дифференцировки поджелудочной железы в линиях протоковой аденокарциномы поджелудочной железы человека разной степени дифференцировки. Экспрессия групп изоформ Н№4а и факторов РБХ1 и РТШа в клеточных линиях Сарап2, ЛбРО, Рапс1, М1аРаСа2 и в ткани нормальной поджелудочной железы человека (Подж.) Электрофорез продуктов ПЦР в 2,0% агарозном геле. Экспрессия гена РР1А приведена для контроля количества кДНК, взятой в реакцию
Рис. 3. Экзогенная экспрессия изоформ Н№4а в клетках линии Рапс1 приводит к активации экспрессии регуляторов дифференцировки РБХ1 и РТШа. ОТ-ПЦР анализ уровней экспрессии групп изоформ Н№4а и генов РбХ1 и РТШа в НЫШа-экспрессирующих клетках Рапс1-НОТ4а1 и Рапс1-Н№4а7 и контрольной линии Рапс1-К. Электрофорез продуктов ПЦР в 2,0% агарозном геле. Экспрессия гена РР1А приведена для контроля количества кДНК, взятой в реакцию.
Предполагаемый механизм активации миграционной активности через РБХ1, однако, может быть не единственным, так как четкой корреляции между уровнями экспрессии РБХ1 и относительным повышением количества мигрировавших в камере Бойдена клеток не наблюдается.
5- 0
а) 5 о. * О
200
150
100
50
67,: + * * * 118.0 117.7 112.7
* 63,0 + 4- +
I 1
I
Рапс1-К Рапсі- Рапсі- Рапсі- Рапс1-
НМР4а1- НМР4а1- НМР4а7- НМР4а7-
сІ5 тіх сіб тіх
Рис. 4. Экзогенная экспрессия Н№4а сопровождается снижением колониеобразующей активности клеток Рапс1.
А: внешний вид чашек Петри с колониями клеток;
Б: количество колоний, формируемых клетками Н№4а-экспрессирующих культур и контрольной культуры в условиях высокого разведения (1000 клеток на чашку диаметром 3 см). * - Р<0,05.
Для адекватного истолкования обнаруженных изменений следует обратиться к гипотезе о том, что протоковые клетки поджелудочной железы могут играть роль мультипотентных клеток-предшествен-ников. Усиление миграции панкреатических клеток-предшественников описано, например, при диффе-ренцировке клеток островков Лангерганса [10]. Для подвижных панкреатических клеток-предшествен-ников, находящихся в фазе частичной дифференци-ровки, характерна одновременная экспрессия факторов РБХ1 и РТШа [20]. Сходный спектр экспрессии этих транскрипционных факторов наблюдается в культурах Рапс1, экспрессирующих изоформы НМР4а. Ввиду этого наблюдаемое увеличение миграционного потенциала может быть истолковано как приближение свойств клеток к присущим панкреатическим клеткам-предшественникам.
Заключение
Полученные результаты указывают на существенную роль транскрипционного фактора НЫБ4а в регуляции биологических свойств и экспрессии генов в клетках протоковой аденокарциномы поджелудочной железы человека. Экзогенная экспрессия изоформ Н№4а в клетках линии Рапс1 сопровождается активацией генов РБХ1 и РТШа, кодирующих основные регуляторы дифференцировки панкреатических клеток.
0,70
А
а>
Panc1-K Рапсі- Рапсі- Рапсі- Рапсі-HNF4a1- HNF4a1- HNF4a7- HNF4a7-cl5 mix c!6 mix
Время инкубации, сут.
Рис. 5. Экзогенная экспрессия Н№4а не оказывает существенного влияния на пролиферативные свойства клеток Рапс 1.
А: интенсивность синтеза ДНК, определенная по включению 5'-Вп1и в синтезирующуюся ДНК;
Б: кинетика роста исследованных культур. Количество клеток нормализовано относительно количества клеток, прикрепившихся через 3 часа после посева.
Н№4а-экспрессирующие культуры клеток Рапс1 обладают пониженной способностью к коло-ниеобразованию по сравнению с контрольной культурой. В то же время экзогенная экспрессия изоформ Н№4а приводит к усилению способности клеток Рапс1 к направленной миграции.
>ч
Рапс1-К Рапсі- Рапсі- Рапсі- Рапсі-
HNF4a1- HNF4a1- HNF4a7- HNF4a7-
cl5 mix c!6 mix
Рис. 6. НОТ4а-экспрессирующие клетки Рапсі обладают повышенной способностью к направленной миграции. Приведено среднее количество клеток, мигрировавших сквозь мембрану камеры Бойдена с размером пор 8,0 мкм. * - Р<0,05.
Описанные изменения характерны для панкреатических мультипотентных клеток-предшественников, находящихся на стадии частичной дифференцировки. Таким образом, экзогенная экспрессия Н№4а в де-дифференцированных клетках протоковой аденокарциномы поджелудочной железы человека приводит к их частичной редифференцировке и ослаблению злокачественного фенотипа. Это первое указание на то, что в клетках протоковой аденокарциномы поджелудочной железы восстановление экспрессии Н№4а или блокирование сигнальных путей, определяющих его транскрипционную репрессию, могут вызывать частичную редифференцировку и реверсию злокачественного фенотипа. Ранее на модели гепатоцеллюлярной карциномы нами было показано, что восстановление экспрессии Н№4а может быть достигнуто путем блокирования ряда внутриклеточных сигнальных путей, активированных в опухолевых клетках, например сигнального каскада, индуцируемого трансформирующим фактором роста в [2]. Дальнейшие исследования в этой области позволят детальнее понять ключевые механизмы развития этого типа опухолей, которые могут быть использованы для разработки новых походов к терапии и диагностике опухолевых заболеваний поджелудочной железы.
Работа поддержана грантами Министерства образования и науки (№ 12.740.11.0196, шифр 20121.1-12-000-1002-064), Российского фонда фундаментальных исследований 10-04-01504-а и благотворительного фонда «Протек»
Литература
1. Лазаревич Н.Л., Флейшман Д. И. Тканеспецифические транскрипционные факторы в прогрессии эпителиальных опухолей // Биохимия. - 2008. - 73. - C. 713-34.
2. Макарова М.В., Доннер Н.Е., Флейшман Д.И. и др. Частичная реверсия злокачественного фенотипа клеток дедифференцированной гепатокарциномы мыши инактивацией трансформирующего фактора роста Р2 // Российский биотерапевтический журнал. - 2009. -Т. 8, № 3. - С. 56-9.
3. Boj S.F., Parrizas M., Maestro M.A., Ferrer J. A transcription factor regulatory circuit in differentiated pancreatic cells // Prot. Natl. Acad. Sci. USA. - 2001. - 98. - Р. 14481-6.
4. Burlison J.S., Long Q., Fujitani Y. et al. Pdx-1 and Ptf1a concurrently determine fate specification of pancreatic multipotent progenitor cells // Dev. Biol. - 2008. - 316. - Р. 74-86.
5. Cattin A.L., Le Beyec J., Barreau F. et al. Hepatocyte nuclear factor 4alpha, a key factor for homeostasis, cell architecture, and barrier function of the adult intestinal epithelium // Mol. Cell. Biol. - 2009. - 29. - Р. 6294-308.
6. Erdmann S., Senkel S., Arndt T. et al. Tissue-specific transcription factor HNF4alpha inhibits cell proliferation and induces apoptosis in the pancreatic INS-1 beta-cell line // Biol. Chem. - 2007. - 388. - Р. 91-106.
7. Grigo K., Wirsing A., Lucas B. et al. HNF4 alpha orchestrates a set of 14 genes to down-regulate cell proliferation in kidney cells // Biol. Chem. - 2008. - 389. - Р. 179-87.
8. Hansen S.K., Parrizas M., Jensen M.L. et al. Genetic evidence that HNF-lalpha-dependent transcriptional control of HNF-4alpha is essential for human pancreatic beta cell function // J. Clin. Invest. - 2002. - 110. -P. 827-33.
9. Hayhurst G.P., Lee Y.H., Lambert G. et al. Hepatocyte nuclear factor 4alpha (nuclear receptor 2A1) is essential for maintenance of hepatic gene expression and lipid homeostasis // Mol. Cell Biol. - 2001. - 2l. - P. 1393-403.
10. Kim S.K., Hebrok M. Intercellular signals regulating pancreas development and function // Genes Dev. -2001. - 15. - P. 111-27.
11. Koizumi M., Doi R., Toyoda E. et al. Increased PDX-1 expression is associated with outcome in patients with pancreatic cancer // Surgery. - 2003. - 134. - P. 260-6.
12. Lazarevich N.L., Cheremnova O.A., Varga E.V. et al. Progression of HCC in Mice Is Associated With a Downregulation in the Expression of Hepatocyte Nuclear Factors // Hepatology. - 2004. - 39. - P. 1038-47.
13. Nakhei H., LingottA., Lemm I., Ryffel G.U. An alternative splice variant of the tissue specific transcription factor HNF4alpha predominates in undifferentiated murine cell types // Nucleic Acids Res. - 1998. - 26. -P. 497-504.
14. Nammo T., Yamagata K., Tanaka T. et al. Expression of HNF-4alpha (MODY1), HNF-1beta (MODY5), and HNF-1alpha (MODY3) proteins in the developing mouse pancreas // Gene Expr. Patterns. - 2008. - 8. -P. 96-106.
15. Parviz F., Matullo C., Garrison W.D. et al. Hepatocyte nuclear factor 4alpha controls the development of a hepatic epithelium and liver morphogenesis // Nat. Genet. - 2003. - 34. - P. 292-6.
16. Siegel R., Naishadham D., Jemal A. Cancer statistics, 2012 // CA Cancer J. Clin. - 2012. - 62. - P. 10-29.
17. Sipos B., Moser S., Kalthoff H. et al. A comprehensive characterization of pancreatic ductal carcinoma cell lines: towards the establishment of an in vitro research platform // Virchows Arch. - 2003. - 442. - P. 44452.
18. Tanaka T., Jiang S., Hotta H. et al. Dysregulated expression of P1 and P2 promoter-driven hepatocyte nuclear factor-4alpha in the pathogenesis of human cancer // J. Pathol. - 2006. - 208. - P. 662-72.
19. Torres-PadillaM.E., SladekF.M., WeissM.C. Developmentally Regulated N-Terminal Variants of the Nuclear Receptor Hepatocyte Nuclear Factor 4a Mediate Multiple Interactions through Coactivator and Corep-ressor-Histone Deacetylase Complexes // J. Biol. Chem. - 2002. - 277. - P. 44677-87.
20. Zhou Q., Law A.C., Rajagopal J. et al. A multipotent progenitor domain guides pancreatic organogenesis // Dev. Cell. - 2007. - 13. - P. 103-14.
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН
