CC BY
37
УДК 577.112
ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА рН-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫХ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ МИКРОЧАСТИЦ С ИНСУЛИНОМ
Н.Г. Балабушевич1, Г.А. Вихорева2, Е.В. Михальчик3, Н.И. Ларионова1
(кафедра химической этимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (e-mail: nbalab@enzyme.chem.msu.ru); Московский государственный текстильный университет имени А.Н. Косыгина; Научно-исследовательский институт физико-химической медицины)
Исследованы и сопоставлены свойства инсулинсодержащих микрочастиц, полученных чередующейся адсорбцией полианионов (декстрансульфата, хитозансульфата) и поликатионов (хитозана, протамина) на микроагрегатах белка. Продемонстрирована возможность регулирования высвобождения инсулина из микрочастиц путем варьирования пар полиэлектролитов, изменения числа циклов их адсорбции и pH среды. Во всех случаях показано защитное действие микрочастиц по отношению к инактивации инсулина при кислых значениях рН и высвобождение белка при рН > 5, т.е. в условиях, моделирующих желудочно-кишечный тракт человека.
Ключевые слова: инсулин, биополиэлектролиты, постадийная адсорбция полиэлектролитов, полиэлектролитные микрочастицы.
Сахарный диабет - одно из главных социально значимых заболеваний XXI в. Больные диабетом, в особенности диабетом первого типа, вынуждены строго контролировать уровень глюкозы в крови путем регулярных инъекций инсулина (Инс). Среди возможных альтернативных способов доставки пе-роральный метод введения инсулина является наиболее естественным.
В настоящее время на рынке готовых лекарственных форм нет ни одного зарегистрированного перорального препарата инсулина. Для успешного создания пероральной формы необходимо решить основные проблемы, связанные с низкой биодоступностью инсулина, вызванной его гидролизом при низких значениях рН желудочного сока, расщеплением протеиназами желудка и тонкого кишечника и слабым проникновением через мембраны эпителиальных клеток кишечника [1].
Включение белков в полиэлектролитные микрочастицы, получаемые ступенчатым нанесением противоположно заряженных полиэлектролитов, является перспективным методом иммобилизации белков [2-16]. При этом возможны два основных пути иммобилизации: включение белков в готовые полиэлектролитные микрочастицы [3, 5, 8, 10-12, 14-16] и формирование микрочастиц на матрице, содержащей белок [2, 4, 6, 7, 9, 13]. Предложенный нами ранее [2, 9, 13] метод микро- и нанокапсулирования белков путем последо-
вательной адсорбции противоположно заряженных полиэлектролитов на микроматрице, содержащей белок, представляется более простым и перспективным для создания систем пероральной доставки белков, поэтому он активно развивается в настоящее время [15, 17]. Способ отличается простотой методики и аппаратурного оформления, проведением процесса в мягких водных условиях при комнатной температуре. Полученные таким образом белоксодержащие полиэлектролитные частицы оказываются чувствительными к изменению рН [2, 4, 6, 7, 9, 13, 15, 17].
В настоящей работе продемонстрированы возможности метода постадийной адсорбции противоположно заряженных биополиэлектролитов - декстран-сульфата (ДС)/хитозансульфата (ХС) и хитозана (Хит)/протамина (Пр) на белоксодержащей матрице, как простого и эффективного способа получения ин-сулинсодержащих микрочастиц. Особое внимание уделено изучению свойств инсулинсодержащих полиэлектролитных микрочастиц, пригодных для решения задачи повышения биодоступности белка при перо-ральном применении.
Методы исследования
Материалы. В работе использованы декстран-сульфат натрия М№ 500 кДа, протамин, образцы хитозана 150, 400, 600 кДа, имеющие соответственно степень дезацетилирования 87, 85 и 84% ("Пика",
Швейцария); сефадекс G-50f («LKB-Pharmacia», Швеция); инсулин свиной в виде цинковой соли (ГУ "ГИКиМП", Россия). Сульфат хитозана Mw 120— 150 кДа, степень сульфатирования 1,45, получали сульфатированием хитозана панцирей крабов олеумом в среде диметилформамида, как описано в [18]. Остальные реактивы были марки "х.ч." и "ос.ч."
Микроагрегаты комплекса инсулин-полианион
получали, смешивая равные объемы растворов белка и полианиона в 0,15 M NaCl (рН 3,0) [13].
Высоленные микроагрегаты инсулина получали, добавляя при рН 3,0 к раствору белка NaCl до концентрации 0,5 M [9] .
Полиэлектролитные микрочастицы получали в 0,15 M NaCl (рН 3,0) [13]. К осадку микроагрегатов или микрочастиц добавляли раствор полиэлектролита (2,5 мг/мл), перемешивали в течение 20 мин, центрифугировали (3 мин, 200 g) и дважды суспендировали, удаляя избыток полиэлектролита. По достижении необходимого числа стадий сорбции полиэлектролитов микрочастицы суспендировали и хранили при 4°С или после промывания 1 мМ соляной кислотой лиофильно высушивали. При необходимости суспензию микрочастиц подвергали ультразвуковой обработке (2 мин, 5°С) на установке "ИЛ 100-6/1" (ультразвуковая техника) при рабочей частоте 22 кГц.
Характеристика микрочастиц. Морфологию микрочастиц определяли с помощью сканирующей электронной микроскопии (Gimini Leo, «Zeiss», Германия; 0,5 кВ). Средний размер микрочастиц определяли оптической микроскопией (Opton III, "Carl Zeiss", Германия) по результатам измерения размеров 100 частиц.
Состав микрочастиц. Лиофилизованные препараты микрочастиц суспендировали в 0,1 М NaOH и определяли содержание белка (инсулин, протамин) по методу Лоури [19], используя калибровочную кривую для каждого белка, или содержание инсулина по A^0. Содержание декстрансульфата оценивали по методу Дюбуа [20]. Содержание белка и декстрансульфата в препаратах выражали в процентах как отношение их массы к массе высушенного препарата. Содержание Хит находили как отношение разности масс высушенного препарата (влажность 5-6%) и масс белка и декстрансульфата к массе высушенного препарата.
Изучение высвобождения инсулина из микрочастиц. Суспензии микрочастиц инкубировали в универсальном буфере (0,02 M H3PO4, 0,02 M
СН3СООН, 0,02 М Н3В03 и 0,1 М ШОН, рН 2-8) при перемешивании (100 об/мин) и комнатной температуре. Через определенное время отбирали аликво-ты суспензии, центрифугировали (5 мин, 10000 g) и определяли концентрацию белка в супернатанте. Отобранные объемы аликвот восполняли буфером. Об эффективности высвобождения инсулина из микрочастиц судили по отношению содержания белка в су-пернатанте и в суспензии микрочастиц.
Супернатанты, полученные после инкубирования частиц в течение 1 ч в универсальном буфере (рН 7,4), подвергали хроматографическому анализу на колонке с сефадексом 0-50£ (элюент - универсальный буфер, рН 7,4). Во фракциях анализировали белок по А280 и Лоури, декстрансульфат - по Дюбуа.
Результаты и обсуждение
Процесс инкапсулирования инсулина в микрочастицы включает получение нерастворимых агрегатов белка и последующую адсорбцию полиэлектролитов при рН 3,0 (рис. 1). Для положительно заряженного в этих условиях инсулина (М№ 5,8 кДа, р1 5,5) микроагрегаты получали формированием нерастворимого полиэлектролитного комплекса с полианионами (ПА) -декстран сульфатом и хитозансульфатом (Инс-ПА) или высаливанием инсулина с последующей адсорбцией полианионов Инс-ПА.
Эффективность включения инсулина в микроагрегаты при использовании декстрансульфата выше, чем при использовании хитозансульфата (табл. 1). Микроскопическое изучение показало, что микроагрегаты инсулина, полученные двумя способами, представляют собой замкнутые частицы неправильной формы. Высоленные микроагрегаты инсулина имеют размер 4-12 мкм. Размер микроагрегатов полиэлектролитного комплекса Инс-ДС (3-15 мкм) примерно в два раза меньше, чем комплекса Инс-ХС (9-27 мкм).
Устойчивость микроагрегатов инсулина при разных значениях рН зависит от природы полианиона (рис. 2, а). Комплексы инсулина с хитозансульфатом, являющимся полиамфолитом и содержащим в среднем 1,45 сульфогрупп на звено [18], менее стабильны, чем комплексы с высокозаряженным полианионом декстрансульфатом, имеющим в среднем 2,3 сульфо-групп на звено. Наиболее устойчивым к воздействию рН оказался полиэлектролитный комплекс Инс-ДС, стабильный при рН 2-5.
Последующее попеременное нанесение на микроагрегаты полиэлектролитов, противоположно заряженных по отношению к заряду поверхности, проводили
Рис. 1. Схема получения инсулинсодержащих полиэлектролитных микрочастиц с использованием комплекса белок-полиэлектролит и высоленных агрегатов белка. ПА -полианион, ПК -поликатион, Инс - инсулин
до достижения необходимого числа стадий сорбций (N) c использованием в качестве поликатиона (ПК) -полисахарида хитозана (Хит, pKa 6,5) с тремя разными значениями молекулярной массы (Mw), равными 150, 400 и 600 кДа или основного белка протамина (Mw = 6,5 кДа, р1 = 10,5). Эффективность включения инсулина в микрочастицы уменьшается с увеличением числа стадий сорбции (табл. 1, 2). Потери инсулина обусловлены потерями при центрифугировании на всех стадиях получения, но в значительной степени -потерями на стадии сорбции поликатиона, который частично вытесняет белок из комплекса с полианионами. Причем высокомолекулярный поликатион хито-зан вытесняет инсулин в большей степени, чем низкомолекулярный основной белок протамин (табл. 2, № 1-3, 7). Эффективность включения инсулина и размер образующихся микрочастиц практически не зависели от молекулярной массы хитозана (табл. 2, № 1-3). Содержание белка в микрочастицах при увеличении Mw хитозана со 150 до 400 кДа возрастает от 36 до 52%, однако при дальнейшем наращивании цепи до 600 кДа - снижается до 41%. Соответственно при увеличении молекулярной массы хитоза-на (табл. 2, № 1-3) наблюдается снижение, а затем возрастание содержания декстрансульфата. Содержание хитозана, рассчитанное по разнице значений массы высушенного препарата, белка и полианиона, было
наиболее высоким при Mw = 150 кДа, что связано с наименьшей вязкостью этого препарата. Результаты расчета содержания хитозана в полиэлектролитных микрочастицах хорошо согласуются с экспериментальными данными, полученными с использованием разработанного нами метода прямого определения хитозана в присутствии белков с помощью о-фтале-вого альдегида [21].
Следует отметить, что для микрочастиц, полученных с использованием высоленных агрегатов инсулина, эффективность включения белка с хитозансульфа-том (табл. 2, № 6) меньше, чем с декстрансульфа-том (табл. 2, № 4). Для микрочастиц, полученных с
Т а б л и ц а 1
Свойства полиэлектролитных комплексов, полученных при взаимодействии инсулина с полианионом в растворе Инс-ПА и при адсорбции полианиона на высоленных микроагрегатах инсулина Инс-ПА
Комплексы Эффективность включения белка, % Содержание белка, % Размер, мкм
(Инс-ДС) 88±8 91±7 9±6
(Инс-ХС) 74±6 95±4 18±9
(Инс) -ДС 90±5 82±5 8±4
(Инс) -ХС 72±4 80±8 8±4
Рис. 2. Влияние рН на высвобождение инсулина: а - из полиэлектролитных микроагрегатов; б - из полиэлектролитных микрочастиц с тремя стадиями сорбции хитозансульфата и хитозана различных молекулярных масс, полученных на высоленных микроагрегатах инсулина; в - из полиэлектролитных микрочастиц с различным числом стадий сорбции декстрансульфата и хитозана 400 кДа, полученных на микроагрегатах комплекса (Инс-ДС); г - из полиэлектролитных микрочастиц с тремя стадиями сорбции различных полиэлектролитов - декстрансульфата, хитозансульфата и хитозана 400 кДа, протамина, полученных на микроагрегатах комплекса Инс-ПА. Время инкубации 1 ч
Т а б л и ц а 2
Свойства инсулинсодержащих микрочастиц с тремя стадиями сорбции полиэлектролитов
Номер образца Микрочастицы Эффективность включения белка, % Содержание, % Размер, мкм
белок ПА ПК
№ 1 (Инс-ДС)-Хит150-ДС 67±4 36±2 42±3 12±2 10±5
№ 2 (Инс-ДС)-Хит400-ДС 72±5 52±4 34±6 9±2 9±5
№ 3 (Инс-ДС)-Хитб00-ДС 74±5 41±4 38±3 9±3 11±5
№ 4 (Инс)-ДС-Хит400-ДС 73±5 53±4 35±5 10±2 12±10
№ 5 (Инс-ХС)-Хит400-ХС 75±5 55±1 - - 23±13
№ 6 (Инс)-ХС-Хит400-ХС 43±3 58±3 - - 13±7
№ 7 (Инс-ДС)-Пр-ДС 86±6 80±3 15±2 1±0,1 10±0,5
использованием комплексов Инс-ПА, эффективность включения для двух полианионов примерно одинакова (табл. 2, № 2, 5).
По данным оптической микроскопии микрочастицы повторяют форму исходных белковых агрегатов-матриц, на которых они формировались (табл. 1, 2). Размер микрочастиц, полученных с использованием хи-тозансульфата из высоленных агрегатов инсулина Инс-ХС-Хит-ХС, меньше размера микрочастиц, полученных из комплекса (Инс-ХС)-Хит-ХС (табл. 2, № 5, 6). При хранении в растворе при рН 3,0 микрочастицы сохраняли стабильность в течение трех лет наблюдения.
Результаты сканирующей электронной микроскопии показали схожесть структур полиэлектролитных микрочастиц (рис. 3). Однако для микрочастиц, полученных на высоленных агрегатах инсулина, наличие в структуре повторяющихся мелких образований со средним размером 100-200 нм более выраженное. Различие ярко проявилось при обработке микрочастиц
ультразвуком. Для микрочастиц, полученных с использованием высоленных агрегатов белка, процесс измельчения более выражен, а измельченные микрочастицы - более однородны по размеру (2±1 мкм для (Инс)-ДС-Хит-ДС), 3±2 для (Инс-ДС)-Хит-ДС)). Поразительные результаты обработки ультразвуком наблюдались для микрочастиц, полученных на высоленных агрегатах инсулина с использованием в качестве поликатиона протамина (Инс)-ДС-Пр-ДС, когда удалось получить наночастицы с размером 100-200 нм [9].
рН-чувствительность является важной характеристикой полиэлектролитных белковых микрочастиц [2, 4, 6, 7, 9, 13, 15, 17], так как для перорального применения необходимо обеспечить стабильность микрочастиц в кислых средах и постепенное высвобождение белка из микрочастиц в нейтральных средах [22].
Сравнение рН-профилей высвобождения инсулина в раствор из исходных микроагрегатов (рис. 2, а) и полиэлектролитных микрочастиц (рис. 2, б-г) показы-
Рис. 3. Сканирующие электронные микрофографии инсулинсодержащих микрочастиц с тремя стадиями сорбции декстрансульфата и хитозана 400 кДа, полученные на комплексе Инс-ДС (а, б) и высоленных агрегатах инсулина (в, г)
вает, что микрочастицы прочнее удерживают белок. Независимо от способа получения и состава микрочастиц интенсивность процесса высвобождения белка уменьшается с увеличением числа стадий сорбции полиэлектролитов за счет диффузионных затруднений, создаваемых полиэлектролитной сеткой (рис. 2, а-б). Так, микрочастицы (Инс)-ХС-Хит-ХС теряют не более 15-20% инсулина при рН 2,0, в то время как в комплексе (Инс)-ХС потери составляют около 80%. С увеличением молекулярной массы хитозана стабильность микрочастиц изменяется незначительно (рис. 2, б). Высвобождение инсулина из всех микрочастиц с N > 3, полученных на полиэлектролитном комплексе Инс-ПА, происходит при рН > 5 (рис. 2, г) с заметным возрастанием скорости выделения при рН 8,0. При рН 6,0 микрочастицы на основе декст-рансульфата и хитозана (Инс-ДС)-Хит-ДС устойчивее аналогичных микрочастиц (Инс-ДС)-Пр-ДС, содержащих протамин, и микрочастиц (Инс-ХС)-Хит-ХС, содержащих хитозансульфат.
По данным гель-проникающей хроматографии при рН 7,4 инсулин из микроагрегатов и микрочастиц выделяется в не связанном с полиэлектролитом виде, о чем свидетельствует совпадение времени удержания в колонне гексамера инсулина в виде цинковой соли и белка после разрушения микрочастиц. В то же время основной протамин высвобождается из
микрочастиц (Инс-ДС)-Пр-ДС в виде полиэлектролитного комплекса, так как совпадает время удержания протамина и декстрансульфата.
Таким образом, методом постадийной адсорбции биополиэлектролитов на микроагрегатах белка получены и охарактеризованы инсулинсодержащие полиэлектролитные микрочастицы. Проведено сравнение свойств микрочастиц, изготовленных на полиэлектролитном комплексе Инс-ПА или высоленных агрегатах инсулина с использованием различных биосовместимых полиэлектролитов. Установлено, что микрочастицы с числом стадий сорбции полиэлектролитов больше двух стабильны в кислых средах и являются рН-чувствительными. Это означает, что микрочастицы способны защищать инсулин в агрессивной среде желудка и высвобождать в тонком кишечнике (при рН > 6). Выявленные свойства белковых микрочастиц свидетельствуют о перспективности их использования для перорального применения. Но, безусловно, вывод о пригодности инсулинсодержащих полиэлектролитных микрочастиц для перорального применения может быть сделан только после их исследования in vivo, которое проводится в настоящее время.
Авторы выражают благодарность сотруднику Института исследования полимеров Макса Планка (Майнс, Германия) О.И. Лебедевой за предоставление микрофотографий.
Работа выполнена при поддержке РФФИ (проект № 09-04-12149а).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Hamman J.H., Enslin G.M., Kotze A.F. // Bio Drugs. 2005. 1. N 3. P. 165.
2. Balabushevitch N.G., Sukhorukov G.B., Moroz N.A., Larionova N.I. et al. // Biotechnol. Bioeng. 2001. 76. N 3. P. 207.
3. Tiourina O.P., Antipov A.A., Sukhorukov G.B., Larionova N.I. et al. // Macromol. Biosci. 2001. 1. P. 209.
4. Larionova N.I., Volodkin D.V., Balabushevitch N.G., Sukhorukov G.B. et al. // Sci. Pharm. 2001. 69. N 3. P. 175.
5. Балабушееич H.Г., Сухорукое Г.В., Ларионова Н.И. // Вести. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2002. 43. № 6. C. 370.
6. Володькин Д.В., Балабушееич Н.Г., Сухорукое Г.Б., Ларионова НИ. // Биохимия. 2003. 68. № 2. C. 283.
7. Volodkin D.V., Balabushevitch N.G., Sukhorukov G.B., Larionova N.I. // STP Pharm. Sci. 2003. 13. N 3. P. 163.
8. Balabushevitch N.G., Tiourina O.P., Volodkin D.V., Larionova N.I. et al. // Biomacromolecules. 2003. 4. N 5. P. 1191.
9. Балабушееич Н.Г., Ларионова Н.И. // Биохимия. 2004. 69. № 7. C. 930.
10. Балабушееич Н.Г., Зимина Е.П., Ларионова Н.И. // Биохимия. 2004. 69. № 7. C. 937.
11. Volodkin D.V., Larionova N.I., Sukhorukov G.B. II Biomacromolecules. 2004. 5. N 5. P. 1962.
12. Balabushevich N.G., Sukhorukov G.B., Larionova N.I. II Macromol. Rapid Commun. 2005. 26. N 14. P. 1168.
13. Balabushevich N.G., Lebedeva O.V., Vinogradova O.I., Larionova N.I. II J. Drug Del. Sci. Tech. 2006. 16. N 4. P. 315.
14. Balabushevich N.G., Larionova N.I. II J. Microencapsulation. 2008 (DOI: 10.1080I02652040802518145).
15. Wang C., Ye S., Sun Q., He C. et al. II J. Experim. Nanoscience. 2008. 3. N 2. P. 133.
16. Tong M. W., Gao C. II J. Mater. Chem. 2008. 18. P. 3799.
17. Zheng J., Yue X., Dai Z., Wang J. et al. II Acta Biomater. 2009. 5. N 5. 1499.
18. Vikhoreva G., Stolbushkina P., Bannikova G., Panov A. et al. II Carbohydrate Polymers 2005. 62. N 4. P. 327.
19. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. II J. Biol. Chem. 1951. 193. N 1. P. 265.
20. Dubois M., Gilse A., Hamilton S.K., Robers P.A., Smith F. II Anal. Chem. 1956. 28. P. 350.
21. Larionova N.I., Zubaerova D.K., Guranda D.T., Pechyon-kinM.A. et al. II Carbohydrate Polymers. 2009. 75. N 4. P. 724.
22. Avdeef A. II Current Topics in Med. Chem. 2001. 1. N 4. P. 277.
Поступила в редакцию 20.01.10
FABRICATION AND PROPERTIES OF pH-SENSITIVE NANOSTRUCTURED POLYELECTROLYTE MICROPARTICLES LOADED WITH INSULIN
N.G. Balabushevich, G.A. Viêhoreva, Ye.V. Mikhalchik, N.I. Larionova
(Chemistry Department, Lomonosov Moscow State University, Division of Chemical Enzymology; Moscow State Textile University, Scientific Research Institue of Physico-Chemical Medicine)
Thorough investigation and comparative study was conducted for insulin-loaded microparticles fabricated by consecutive adsorption of polyanions (dextran sulfate, chitosan sulfate) and polycations (chitosan, protamine) onto the protein microaggregates. The possible regulation of insulin release from the particles by variation in polyelectrolytes pairs, in the number of their adsorption cycles and in pH of media was demonstrated. For all studied cases the microparticles showed protective action towards insulin inactivation at acid pH values and protein release at pH > 5 corresponding to the human gastro-intestinal conditions.
Key words: insulin, biopolyelectrolyte, layer-by-layer polyelectrolyte adsorption, polyelectrolyte microparticles.
Сведения об авторах: Балабушееич Надежда Георгиевна - ст. научн. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, канд. хим. наук (nbalab@enzyme.chem.msu.ru); Вихорееа Галина Александровна -профессор кафедры технологии химических волокон и наноматериалов Московского государственного текстильного университета имени А.Н. Косыгина, докт. хим. наук (vihoreva@mail.ru); Михалъчик Елена Владимировна - вед. научн. сотр. лаборатории биофизических методов диагностики Научно-исследовательского института физико-химической медицины, докт. биол. наук (lemik2007@yandex.ru); Ларионова Наталъя Ивановна -вед. научн. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, докт. хим. наук (nilar@enzyme.chem.msu.ru).
