CC BY
27
УДК 577.181+577.114
ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ МИКРО- И НАНОЧАСТИЦЫ С ДОКСОРУБИЦИНОМ
П.С. Аверин, А.В. Лопес де Гереню, Н.Г. Балабушевич
(кафедра химической энзимологии химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова; e-mail: nbalab2008@gmail.com)
Исследованы микро- и наночастицы с доксорубицином, полученные путем послойной адсорбции декстрансульфата и хитозана на нерастворимом комплексе антибиотик-полианион с последующей обработкой ультразвуком. Изучено влияние молекулярной массы биополимеров, числа полиэлектролитных слоев, рН формирования на состав, физико-химические свойства частиц и эффективность включения доксорубицина. Проанализированы высвобождение доксорубицина и мукоадгезивные свойства полиэлектролитных частиц, определяющие возможность их использования.
Ключевые слова: доксорубицин, микрокапсулирование, послойная адсорбция биополи-электролитов, хитозан, декстрансульфат.
На протяжении 30 лет антрациклиновый антибиотик доксорубицин (Докс) остается одним из наиболее часто применяемых противоопухолевых лекарственных средств [1]. Докс состоит из полициклического антрациклинового ядра и углеводного остатка даунозамина (рис. 1), а его противоопухолевый эффект обусловлен встраиванием в двойную спираль ДНК, что приводит к репликации и транскрипции, образованию одно- и двухце-почечных разрывов молекул ДНК, мутагенному и канцерогенному действию на клетки. Докс способен накапливаться как в пораженных, так и в здоровых клетках организма, поэтому многочисленные исследования направлены на разработку подходов, позволяющих увеличить избирательность его действия и время циркуляции в кровотоке [2]. Наряду с включением Докс в липосомы, мицеллы и гидрогели, ковалентной и нековалентной иммобилизацией на полимерах и т.д. в последние годы активно исследуют комлексобразование антибио-
Рис. 1. Структурная формула доксорубицина
тика с полиакриловой, полиглутаминовой и поли-аспарагиновой кислотами, декстрансульфатом, а также микро- и нанокапсулирование с использованием хитозана и его производных (гликоль, гекса-ноил, олеоил, сукциноил и т.д.) [1, 3-5].
Метод послойной адсорбции разноименно заряженных полиэлектролитов на коллоидных частицах разного состава и строения широко используют для капсулирования биологически активных веществ (БАВ) [6-9]. Основные достоинства этой иммобилизации - осуществление процесса в мягких условиях в водной среде и возможность создания препаратов, имеющих различное строение, соответствующее их назначению. Известны три основных подхода послойного микрокапсулирования [6]:
1) включение БАВ в готовые полиэлектролитные микрочастицы путем изменения проницаемости их стенок;
2) введение БАВ в коллоидную матрицу с последующей адсорбцией полиэлектролитов;
3) использование БАВ в качестве полиэлектролитов при построении мультислоев.
В настоящее время продемонстрировано эффективное противоопухолевое действие Докс, капсулированного в сферические микрочастицы, полученные с помощью первого подхода [10-12] и второго подхода с использованием биоразлага-емых матриц [13]. При отсутствии строгих требований целевой доставки к форме и размеру полиэлектролитных микрочастиц нерастворимые комплексы БАВ (преимущественно белков) с декстрансульфатом признаны универсальными матрицами для адсорбции полиэлектролитов [14-
18]. Полиэлектролитные частицы такого строения для Докс не описаны, но декстрансульфат в паре с противоположно заряженным хитозаном был успешно использован при капсулировании Докс методом комплексной коацервации [19-21].
В настоящей работе исследовано микрокап-сулирование Докс послойной адсорбцией хито-зана и декстрансульфата на нерастворимых комплексах Докс с декстрансульфатом.
Цель работы - изучение влияния молекулярной массы биополимеров и рН среды на физико-химические свойства и поведение полиэлектролитных микрочастиц с Докс, определяющие возможность их использования.
Методы исследования
Материалы. В работе использовали субстанцию гидрохлорида Докс («Dian Jiang Chong», Китай), хитозан со средней молекулярной массой 22, 150, 400, 600 кДа (Хит22, Хит150, Хит400, Хит600 со степенью дезацетилирования 98, 87, 85, 84% соответственно) и декстрансульфат натрия со средней молекулярной массой 5, 100 и 500 кДа (ДС5, ДС100, ДС500). Хит22 предоставлен центром «Биоинженерия» РАН, остальные полимеры производства фирмы «Fluka» (Швейцария). Муцин из свиного желудка, тип III («Sigma», США), содержащий 0,5-1,5% сиаловых кислот.
Получение частиц, содержащих доксоруби-цин. Процесс получения вели в растворе 0,15 М NaCl с pH 3,0 или 5,0. Для получения нерастворимого комплекса (Докс-ДС) смешивали 0,75 мл раствора 0,28 мг/мл Докс и 0,75 мл раствора декстрансульфата (0,04-3,2 мг/мл). Смесь перемешивали 10 мин, центрифугировали 2 мин при 5000 g, надосадочный раствор отделяли и анализировали. К осадку (Докс-ДС) постадийно добавляли по 1,5 мл растворов 0,32 мг/мл хитозана или 0,32 мг/мл декстрансульфата. На каждой стадии адсорбции смесь перемешивали 10 мин с раствором полиэлектролита, центрифугировали 2 мин при 5000 g. Осадок дважды промывали раствором без полиэлектролита. По достижении необходимого числа стадий сорбции полиэлектролитов микрочастицы суспендировали в растворе 0,15 М NaCl и хранили в таком виде при 4°С или промывали дважды водой и высушивали лиофильно. При необходимости суспензию микрочастиц подвергали воздействию ультразвука в течение 10 мин с использованием гомогенизатора «Sonopuls HD 2070» («Bandelin», Германия).
Характеристика частиц, содержащих док-сорубицин. Морфологию и размер микрочастиц изучали с помощью световой оптической микро-
скопии («Opton III», «Carl Zeiss», Германия), конфокальной лазерной сканирующей микроскопии («Nikon Eclipse E800», Япония) и сканирующей электронной микроскопии («Hitachi S-520», Япония). Размер и Z-потенциал частиц после обработки ультразвуком анализировали на установке «Zetasizer Nano ZS» («Malvern Instrument», Великобритания).
Концентрацию Докс в растворах определяли спектрофотометрически при длине волны 480 нм (е = 12500 М^см-1). При определении эффективности включения вычитали из количества Докс, взятого для капсулирования, количество Докс, содержащееся во всех надосадочных и промывных растворах, а полученную величину относили к исходному количеству антибиотика. При изучении состава полиэлектролитные частицы разрушали в растворе 1,5 М NaCl и определяли содержание Докс. При необходимости в разрушенных частицах анализировали с использованием метода Дюбуа [22] содержание декстрансульфата, а содержание хитозана рассчитывали с учетом содержания Докс и полианиона.
Изучение высвобождения доксорубицина из полиэлектролитных частиц. Для изучения стабильности к отцентрифугированному осадку полиэлектролитных частиц добавляли раствор 0,5; 1,0; 1,5 или 2,5 М NaCl, а для изучения кинетики высвобождения - 0,1 М фосфатный буферный раствор (pH 7,4), содержащий
0.0027 М KCl и 0,137 М NaCl. При изучении стабильности смесь перемешивали 10 мин и определяли содержание Докс.
При анализе высвобождения суспензию перемешивали (100 об/мин, 37°С), отбирали через
1, 3, 6 и 24 ч аликвоты, которые центрифугировали (2 мин, 10000 g) и анализировали. Высвобождение Докс оценивали по отношению концентрации микрочастиц в супернатанте и суспензии.
Адсорбция муцина на микрочастицах. К высушенному осадку микрочастиц добавляли 1,5 мл раствора 0,25 мг/мл муцина. Суспензию инкубировали 1 ч (37°С, 100 об/мин). Отделяли суперна-тант центрифугированием (5 мин, 1500 g) и анализировали содержание муцина с помощью реагента Шиффа [15]. Адсорбцию муцина рассчитывали по разнице значений количества добавленного и оставшегося в супернатанте муцина.
Результаты и обсуждение
Основные стадии исследования и получения полиэлектролитных частиц (рис. 2):
1) образование нерастворимых микрокомплексов Докс и декстрансульфата (Докс-ДС);
Рис. 2. Схема получения полиэлектролитных микрочастиц на комплексе (Докс-ДС) путем послойной адсорбции хитозана (Хит) и декстрансульфата (ДС) и воздействия ультразвука
(УЗ)
2) постадийная адсорбция на микрокомплексах противоположно заряженных хитозана и декстрансульфата;
3) ультразвуковая обработка частиц в целях измельчения.
При исследовании комплексообразования варьировали рН среды от 3,0 до 5,0 и соотношение ДС:Докс, учитывая, что каждый гликозидный остаток полианиона содержит 2,3 сульфатные группы (6,410 [803]/г), а молекула антибиотика содержит одну аминогруппу (рКа = 8,6), имеющую в выбранных условиях положительный заряд. Для отрицательно заряженных нерастворимых комплексов (Докс-ДС) наиболее высокая эффективность включения Докс (рис. 3) наблюдалась при соотношении [803]:[ЫН3+], равном 4:1 и 8:1, возрастая в ряду ДС5 < ДС100 ~ ДС500 (табл. 1, № 1, № 3, № 7) и при понижении рН среды (табл. 1, № 7, № 9).
При получении микрочастиц наибольшие потери Докс наблюдались на стадии сорбции хито-зана на (Докс-ДС), что связано с вытеснением антибиотика поликатионом (табл. 1, № 2, № 4, № 8 и № 9). Увеличение на этой стадии сорбции концентрации хитозана до достижения массового отношения [ДС]:[Хит] от 1:0,25 до 1:2 приводит к уменьшению эффективности включения Докс от 74 до 47%, а также к уменьшению размера частиц, вероятно, за счет возрастания их ^-потенциала (табл. 2). При оптимизации этой стадии сорбции было выбрано массовое соотношение [ ДС]:[Хит] = 1:1, при котором эффективность включения Докс составляет 55%, а ^-потенциал частиц равен +15±1 мВ, что необходимо для последующей адсорбции полианиона. Влияние молекулярных масс полиэлектролитов на включение Докс при сорбции хитозана показано на рис. 4. Эффективность включения Докс увеличивается с ростом молекулярной массы декстрансульфата и при использовании хитозана средней молекулярной массы (Хит150, Хит400), что показано в табл. 1 (№ 2, № 4 и № 8).
В результате послойной адсорбции полиэлектролитов происходит перезарядка поверхности с отрицательной (при адсорбции декстрансульфа-
та) на положительную (при адсорбции хитозана) (табл. 1, № 3-6). Эффективность включения Докс с увеличением числа слоев полиэлектролитов уменьшается при рН 5,0 более интенсивно, чем при рН 3,0 (табл. 1, № 3-6 и № 9-12). С увеличением числа слоев полиэлектролитов содержание Докс в частицах уменьшается, а содержание декстрансульфата и хитозана зависит от строения частиц (табл. 3).
С использованием световой, конфокальной, сканирующей электронной микроскопии (рис. 5) и динамического лазерного светорассеяния (табл. 1) изучено влияние ультразвукового воздействия на частицы разного строения, имеющие неправильную форму и размер от 500 нм до 40 мкм. Микрочастицы, сформированные при более низком значении рН имели больший размер. При воздействии ультразвука не изменялся размер комплексов (Докс-ДС), составляющий около 1000 нм, мало изменялся размер частиц, сформированных при рН 3,0, а размер микрочастиц, сформированных при рН 5,0, уменьшался до 3000-4000 и 2000-2500 нм при использовании на последней стадии адсорбции декстрансульфата и хитозана соответственно (табл. 1). При воздействии ультразвука практически не изменялся ^-потенциал
Рис. 3. Влияние молекулярной массы полианона и зарядового соотношения ДС:Докс на включение Докс в нерастворимые комплексы с декстрансульфатом (Докс-ДС) при рН 5,0
Т а б л и ц а 1
Характеристика микрочастиц, полученных на комплексе (Докс-ДС) путем послойной адсорбции
полиэлектролитов и воздействия ультразвука
Номер Частица рН Эффективность включения Докс, % ^-потенциал, мВ Средний размер, нм
1 (Докс-ДС5) 5 81±3 -19±5 1000±400
2 (Докс-ДС5)-Хит400 5 26±2 +6±2 1200±100
3 (Докс-ДС^ 5 92±5 -35±3 1300±400
4 (Докс-ДС100)-Хит400 5 55±3 +11±1 2200±600
5 (Докс ДС100)—Хит400 ДС100 5 48±3 -24±2 3500±900*
6 (Докс-ДС100)-Хит400-ДС100-Хит400 5 36±4 +7±2 2000±200
7 (Докс—ДС500) 5 87±5 -34±2 1100±400
8 (Докс- ДС500)-ХШ400 5 65±5 +5±2 1300±400
9 (Докс-ДС500) 3 99±5 - 800±100
10 (Докс- ДС500)-ХШ400 3 92±5 - 32000±3000*
11 (Докс-ДС500)-Хит400-ДС500 3 92±4 - 9000±2000*
12 (Докс-ДС500)-Хит400-ДС500-Хит400 3 91±3 - 10000±2000*
* Данные световой микроскопии.
Т а б л и ц а 2
Влияние массового соотношения полиэлектролитов при получении частиц (Докс-ДС100)- Хит400
на включение антибиотика и свойства частиц
ДС:Хит, г/г Эффективность включения Докс, % ^-потенциал частиц, мВ
0,5 47 17±1
1 55 15±1
2 62 9±2
4 74 -1,3±0,5
частиц. Частицы, полученные при рН 5,0 и обработанные ультразвуком, не изменяли своего размера в течение 3 месяцев наблюдения.
Анализ мукоадгезивных свойств и стабильности микрочастиц важен для прогнозирования путей их возможного использования. Для оценки мукоадгезивных свойств микрочастиц мы использовали хорошо зарекомендовавший себя метод инкубации частиц в растворах муцина [15, 16, 23]. Как известно, муцин является основным компонентом слизистых поверхностей и при физиологических значениях рН обладает отри-
цательным зарядом вследствие наличия фуко-зы и сиаловой кислоты на концах углеводных цепей [24]. Хитозан способен к образованию электростатических и водородных связей с муцином, поэтому микрочастицы, покрытые хи-тозаном с положительным поверхностным зарядом, обладают лучшими мукоадгезивными свойствами, чем частицы, имеющие на поверхности декстрансульфат (табл. 3).
Кинетика высвобождения Докс при физиологических значениях рН из микрочастиц, покрытых хитозаном, показана на рис. 6. Докс не выделялся
V Q J ^ ^ ^ ^
^ 0 100 200 300 400 500 600
Mw Хит, кДа
Рис. 4. Влияние молекулярных масс полиэлектролитов на включение Докс при адсорбции хитозана на комплекс (Докс-ДС) (ДС:Хит = 1:1(г/г), pH 5,0)
а
m
ЩГ
Г • .
Ю M км
Г *
ff
е8Э515 геку xè!èèriî!èù
Рис. 5. Конфокальная лазерная сканирующая (а) и сканирующая электронная (б, в) микрофотографии частиц (ДС100-Докс)-Хит400 до (а, б) и после (в) воздействия ультразвука
Т а б л и ц а 3
Влияние строения полиэлектролитных частиц с Докс на связывание муцина
Частицы Содержание, % Адсорбция муцина, мкг/мг частиц
Докс Декстран-сульфат Хитозан
(Докс-ДСюо)-Хит4оо 42±3 30±3 28 66±10
(Докс-ДС100)-Хит400-ДС100 40±2 43±6 17 18±6
( Докс ДС100) Хит400 ДС100 Хит400 35±3 40±5 25 72±8
из частиц, полученных при рН 3,0, до 21 сут наблюдения. Из микрочастиц с двумя и четырьмя стадиями адсорбции, сформированных при рН 5,0, высвобождалось соответственно 9 и 12% Докс в течение 1 ч, 12 и 18% Докс в течение 24 ч. Полного высвобождение Докс из частиц удалось достичь
при увеличении концентрации NaCl выше 1,5 М (рис. 7), что было использовано для разрушения частиц при анализе их состава.
Таким образом, метод послойной адсорбции хитозана и декстрансульфата на нерастворимых агрегатах с полианионом, разработанный для
Рис. 6. Влияние рН формирования и строения частиц на кинетику высвобождения Докс при рН 7,4. При получении частиц использованы ДС100 и Хит400
белков, показал пригодность для капсулирования Докс. Включение Докс зависит от рН формирования и строения частиц. Ультразвуковая обработка позволила измельчить частицы неправильной формы, сформированные при рН 5,0, до размера 2-3 мкм, что меньше размера частиц Докс, полученных из декстрансульфата и хитозана методом коацервации [19-21]. Мукоадгезивные свойства микрочастиц с Докс, покрытых хитозаном, лучше, чем свойства микрочастиц, покрытых дек-странсульфатом, и сравнимы с аналогичными свойствами микрочастиц, полученных с использованием распылительной сушки и состоящих только из хитозана (50 мкг/мг) [25]. Вы-
Рис. 7. Влияние ионной силы на высвобождение Докс из частиц (Докс-ДС100)-Хит400 (время инкубации 10 мин)
свобождение Докс из частиц увеличивается как с ростом рН их формирования (что связано с образованием более прочного подиэлектролитно-го комплекса при низких значениях рН), так и с ростом числа слоев полимеров. Физико-химические свойства полиэлектролитных микрочастиц состава (Докс-ДС100)-Хит400 позволяют сделать предположение об их пригодности для доставки Докс в опухоли различной локализации (местно/ регионально), например опухоли мочевого пузыря, стенки которого покрыты слоем муцина [26, 27], или простаты [28]. Однако лишь дальнейшие исследования in vitro и in vivo могут подтвердить или опровергнуть это предположение.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Tacar O., Sriamornsak P., Crispin R., Dass C.R. // Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2013. Vol. 65. P. 157.
2. Carvalho С., Santos R.Х., Cardoso S, Correia S., Oliveira P.J., Santos M.S., Moreira P.I. // Curr. Med. Chem. 2009. Vol. 16. N 25. P. 3267.
3. Yousefpour P., Atyabi F., Farahani E.V., Sakhtianchi R., Dinarvand R. // Int. J. Nanomedicine. 2011. Vol. 6. P. 1487.
4. Tan M.L., Choong P.F.M., Dass C.R. // Journal of Pharmacy and Pharmacology. 2009. Vol. 61. P. 131.
5. Sanyakamdhorn S., Agudelo D., Tajmir-Riahi H.A.// Bio-macromol. 2013. Vol. 14. P. 557.
6. Балабушевич Н.Г., Изумрудов В.А., Ларионова Н.И. // Высокомол. соединения. Сер. А. 2012. Vol. 54. N 7. P. 1116.
7. Балабушевич Н.Г., Печенкин М.А., Лопес де Гере-ню А.В., Зоров И.Н., Михальчик Е.В., Ларионова Н.И. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2014. Т. 55. № 3. С. 158.
8. Balabushevich N.G., Larionova N.I. // J. Microencap. 2009. Vol. 26. N 7. P. 571.
9. Balabushevich N.G., Lebedeva O.V., Vinogradova O.I.,
Larionova N.I. // J. Drug Del. Scien. Techn. 2006. Vol. 16. N 4. P. 315.
10. TaoX., Chen H., SunX.-J., Chen J.-F., Roa W.H. // Int. J. Pharm. 2007. Vol. 336. P. 376.
11. Zhao Q., Han B., Wang Z., Gao C., Peng C., Shen J. // Nanomedicine. 2007. Vol. 3. N 1. P. 63.
12. Gupta G.K., Kansal S., Misra P., Dube A., Mishra P.R. // PRAAPS Pharm. Sci. Tech. 2009. Vol. 10. N 4. P. 1343.
13. Deng Z.J., Morton S.W., Ben-Akiva E., Dreaden E.C., Shopsowitz K.E., Hammond P.T. // ACS Nano. 2013. Vol. 7. N 11. P. 9571.
14. Балабушевич Н.Г., Ларионова Н.И. // Биохимия. 2004. Т. 69. № 7. С. 930.
15. Балабушевич Н.Г., Печенкин М.А., Зоров И.Н., Шибанова Е.Д., Ларионова Н.И. // Биохимия. 2011. Т. 76. № 3. С. 400.
16. Balabushevich N.G., Pechenkin M.A., Shibanova E.D., Volodkin D.V., MikhalchikE.V. // Macromol. Bioscience. 2013. Vol. 13. N 10. P. 1379.
17. Печенкин М.А., Балабушевич Н.Г., Зоров И.Н., Изумрудов В.А., Клячко Н.Л., Кабанов А. В.,
Ларионова Н.И. // Хим.-фарм. журнал. 2013. Т. 47. № 1. С. 49.
18. Балабушевич Н.Г., Борзенкова Н.В., Изумрудов В.А., Ларионова Н.И., Безбородова О.А., Немцова Е.Р., Якубовская Р. И. // Прикл. биохимия и микробиология. 2014. Т. 50. № 2. С. 232.
19. Tan M.L., Friedhuber A.M., Dunstan D.E., Choong P.F.M., Dass C.R. // Biomaterials. 2010. Vol. 31. P. 541.
20. Delair T.// Eur. J. Pharm. Biopharm. 2011. Vol. 78. P. 10.
21. Sijumon Kunjachan, Swati Gupta, Anil K. Dwivedil, Anuradha Dube, Manish K. // J. Microencaps. 2011. Vol. 28. N 4. P. 301.
22. DuboisM., Gilse A., Hamilton S.K., Robers P.A., Smith F. // Anal. Chem. 1956. Vol. 28. N 3. P. 350.
23. Киржанова Е.А., Хуторянский В.В., Балабушевич Н.Г., Харенко А.В., Демина Н.Б. // Разработка и регистрация лекарственных средств. 2014. № 3. С. 58.
24. BansilR., Turner B.S. // Current Opininon in Colloidal & Interface Science. 2006. Vol. 11. P. 164.
25. He P., Davis S.S., Illum L. // Int. J. Pharm.1998. Vol. 166. P. 75.
26. Treatment and management of bladder cancer. Ad. Lerner S.R., Schoenberg M.P., Sternberg C.N. Informa UK Ltd. 2008.
27. Gan Y., WientjesM.G., BadalamentR.A., Au J.L. // Clin. Cancer Res. 1996. Vol. 8. P. 1275.
28. Ortiz R., Au J.L., Lu Z., Gan Y., Wientjes M.G. // AAPS J. 2007. Vol. 9. N 2. P. 241.
Поступила в редакцию 01.12.15
POLYELECTROLYTE MICRO- AND NANOPARTICLES WITH DOXORUBICIN
P.S. Averin, A.V. Lopes de Gerenyu, N.G. Balabushevich
(Chemistry Department, Lomonosov Moscow State University, Division of Chemical Enzymology)
Doxorubicin-containing micro- and nanoparticles, obtained by layer-by-layer adsorption of dextran sulphate and chitosan on insoluble antibiotic-polyanion complex and further sonication, were studied. The effect of biopolymer's molecular mass, number of polyelectrolyte layers and reaction medium pH on the content and physico-chemical properties of particles and the efficiency of doxorubicin incorporation was studied. The release of doxorubicin and mucoadhesive properties of polyelectrolyte particles were analysed in order to determine the possibility of their potential applications.
Key words: doxorubicin, мicroencapsulation, layer-by-layer biopolyelectrolyte adsorption, chitosan, dextran sulfate.
Сведения об авторах: Аверин Петр Сергеевич - студент химического факультета МГУ (nbal-ab2008@gmail.com); Лопес де Гереню Анна Валентиновна - студентка химического факультета МГУ (alopes@mail.ru); Балабушевич Надежда Георгиевна - ст. науч. сотр. кафедры химической энзимологии химического факультета МГУ, канд. хим. наук, доцент, (nbalab2008@gmail.com).
