CC BY
30
УДК 547.962
ВКЛЮЧЕНИЕ БЕЛКОВ В ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ МИКРОКАПСУЛЫ ИЗ ДЕКСТРАН СУЛЬФАТА, ПРОТАМИНА И МЕЛАМИН ФОРМАЛЬДЕГИДА
Н.Г. Балабушевич*, Г.Б. Сухоруков*, Н.И. Ларионова
(Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, кафедра химической энзимологии; e-mail: balab@enzyme.chem.msu.ru)
Микрокапсулы получены ступенчатой адсорбцией декстран сульфата и протамина на меламин формальдегидных ядрах с последующим растворением ядер при рН 1,7. Исследовано включение белков с различными общим зарядом и молекулярной массой в полученные полиэлектролитные микрокапсулы. Показано, что независимо от заряда белки способны быстро проходить через мембрану и накапливаться внутри микрокапсул, включаясь в рН-чувствительную, слабо сшитую гелеобразную структуру. Количество белка в микрокапсулах уменьшалось с увеличением молекулярной массы белка от 58,6х108 молекул на микрокапсулу для инсулина до 2,2х108 - для пе-роксидазы. Продемонстрировано, что удерживание белков матрицей, находящейся внутри микрокапсул, увеличивалось с возрастанием их молекулярной массы и может регулироваться путем биодеградации компонентов микрокапсулы. Полиэлектролитные микрокапсулы могут найти применение для концентрирования и фракционирования белков, а также для создания систем доставки белковых лекарственных средств.
Включение белков в полимерные сферы и капсулы представляет большой научный и практический интерес [1]. Внимание заслуживают публикации по капсулирова-нию белков в полиэлектролитные частицы. Ступенчатое нанесение противоположно заряженных полиэлектролитов на матрицу, в качестве которой могут выступать твердые частицы различного размера, позволяет проводить иммобилизацию в мягких условиях и в водных растворах [2]. В частности, микрокапсулирование белков может быть осуществлено последовательным нанесением нескольких слоев положительно заряженного поли-стиролсульфоната и отрицательно заряженного полиал-лиламина на агрегаты, полученные при высаливании белков [3]. Следует заметить, что не все белки высаливаются и, как правило, проведение этого процесса требует подбора индивидуальных условий для каждого протеина. Полученные микроагрегаты неоднородны по форме и размерам, но имеют высокую емкость по белку, зависящую от количества слоев полиэлектролитов: 70 и 30 мас.% для 3- и 11-слойных частиц соответственно [3]. При изменении рН среды происходит процесс высвобождения белка из микрочастиц, скорость которого определяется значением рН и количеством нанесенных слоев. Частицы с такими свойствами могут быть использованы для контролируемой доставки белков [4].
Альтернативным методом капсулирования белков является их включение в полые полиэлектролитные микрокапсулы [5, 6]. Такие микрокапсулы могут быть получены ступенчатым нанесением определенного числа слоев от 3 до 13 противоположно заряженных полиэлектролитов на твердые меламин формальдегидные (МФ) ядра [7]. Далее МФ-ядра растворяют в сильно кислых растворах (рН 1,0). Продукты, образующиеся при кислотном гидролизе меламин формальдегида, выходят через полиэлектролитную оболочку частиц. В результате получаются полые микрокапсулы строго определенного размера, имеющие тонкую полиэлектролитную оболочку и полую внутреннюю сферу. Емкость таких капсул по белку небольшая. Так при включении хи-мотрипсина (мол. масса 25 кД) из раствора 5 мг/мл в каждую 8-слойную микрокапсулу из полистиролсульфо-ната и полиаллиламина входит около 107 молекул белка [5]. При этом 90% белка сорбируется в стенках микрокапсул. При использовании 46%-го раствора этанола, содержащего 10 мг/мл уреазы (мол. масса 482 кД), в микрокапсулу входит 1,7х105 молекул белка [6]. Полые микрокапсулы из сильных синтетических полиэлектролитов с включенными ферментами могут найти применение в качестве биокатализаторов [5].
Можно предположить, что использование природных и биодеградируемых полиэлектролитов позволит создать
* Макс-Планк Институт коллоидов и поверхностей раздела фаз, Потсдам/Голм, 14476, Германия.
полые капсулы и частицы с новыми свойствами и расширить тем самым область их потенциального применения.
Цель данной работы состояла в получении микрокапсул на основе МФ-частиц с использованием природных полиэлектролитов и исследовании их взаимодействия с разными белками.
Методы исследования
В работе использованы декстран сульфат (500 кД), протамин (5 кД), инсулин быка, трипсин (ЕС 3.4.21.4), пероксидаза хрена (ЕС 1.11.1.7) и пероксидаза, меченная флюоресцеин изотиоцианатом ("Sigma", США); ме-ламин формальдегидные частицы ("Microparticles GmbH", Германия).
Получение микрокапсул. Капсулы получали на МФ-частицах с диаметром 5,12±0,15 мкм последовательной адсорбцией декстран сульфата (5 мг/мл) и протами-на (5 мг/мл) в 0,02 NaCl (рН 5,0). Нанесение каждого слоя полиэлектролитов проводили в течение 10 мин, затем частицы центрифугировали и дважды промывали в 0,02 NaCl (рН 5,0). После нанесения 4 слоев декстран сульфата и 4 слоев протамина МФ-частицы растворяли в НС1 (рН 1,7). Суспензию капсул с концентрацией (7±3)х107 частиц/мл хранили при рН 3,0 и T = 5°.
Характеристика микрокапсул. Морфологию микрокапсул изучали с помощью конфокальной лазерной микроскопии. Концентрацию микрокапсул определяли путем разбавления раствора и микроскопического подсчета количества частиц в фиксированном объеме.
Включение белков в микрокапсулы. К 0,05 мл суспензии микрокапсул добавляли 0,95 мл раствора белка (4 мг/мл) в универсальном буфере (0,02 М H3PO4, 0,02 М CH3COOH, 0,02 М H3BO3 + 0,1 М NaOH, с pH 8,0). Смесь выдерживали в течение 1 ч при 20°, центрифугировали (2000 об/мин, 2 мин), су-пернатант отделяли. Капсулы, содержащие белок, и су-пернатант анализировали.
Высвобождение белка из капсул. К капсулам с включенным белком (0,35х107 частиц) добавляли 1 мл универсального буфера. Через 10, 30 мин, 1, 3 и 7 ч отбирали аликвоты суспензии, центрифугировали и в су-пернатанте определяли белок (см. ниже). Количество высвободившегося белка относили к количеству закап-сулированного белка.
Определение концентрации белка. Содержание белка в микрокапсулах оценивали по разности концентраций белка (определенных методом Лоури) в растворе, использованном для капсулирования, и в супернатанте.
Количество молекул белка в единичной микрокапсуле рассчитывали по формуле: L = [c]NA/Mw[N], где [c] - концентрация белка в суспензии капсул (мг/мл), Na - константа Авогадро, Mw - молекулярная масса белка (г/моль), [N] - концентрация микрокапсул в суспензии (мл). Концентрацию белка в капсуле определяли
по формуле: Ск = 3Ь М^ / 4Кдпрг , где г - радиус капсулы, равный 5x10 6 м.
Результаты и их обсуждение
Полиэлектролитные микрокапсулы были получены по модифицированной нами методике [7] ступенчатой адсорбцией противоположно заряженных декстран сульфата и протамина на твердых МФ-частицах. Далее МФ-ядра растворяли в выбранных нами мягких условиях при рН 1,7. Меламин формальдегидная смола, входящая в состав ядер, представляет собой сложное соединение, содержащее эфирные связи, первичные, вторичные и третичные аминогруппы, метиленовые мостики, гидро-ксильные группы [8]. Как мы установили ранее [9], при рН 1,7 гидролиз С-К-С-групп в ядрах идет медленно, и вновь образующиеся положительно заряженные аминогруппы начинают взаимодействовать с сульфогруппами декстран сульфата, входящего в оболочку микрокапсул. Это вызывает перераспределение полиэлектролитов из оболочки с образованием внутри капсул однородной, слабо сшитой гелеобразной структуры.
Приготовленные полиэлектролитные микрокапсулы были однородны по размеру (рис. 1, а); их диаметр, зависящий от рН среды (8,0+0,2 мкм при рН 3-5, 910 мкм при рН 7-8), был больше диаметра исходных МФ-частиц (5,12±0,15 мкм). Микрокапсулы оказались стабильными в течение всего срока наблюдения за ними (9 мес).
10 мкм
б
Рис. 1. Микрофотографии полиэлектролитных капсул без включения (а) и с включением пероксидазы, меченной флюоресцеин изотиоционатом (б)
С помощью конфокальной микроскопии проведено исследование проницаемости микрокапсул. Низкомолекулярные флюоресцентные красители: отрицательно заряженный 6-карбоксифлюоресцеин (376 Д) и положительно заряженный родамин 60 (479 Д), как и высокомолекулярная пероксидаза (44 кД, р I 8,8), меченная флюоресцеин изотиоционатом (рис. 1, б) в течение нескольких секунд проникали через оболочку, равномерно распределялись внутри микрокапсул и удерживались в них при рН 8. Включение разноименно заряженных веществ с различной молекулярной массой, как и изменение диаметра капсул под действием рН свидетельствовали о наличии в
а
Включения белков с различными молекулярными массами
и изоэлектрическими точками в полиэлектролитные микрокапсулы из декстран сульфата, протамина и меламин формальдегида (рН 8,0)
60
a?
« ьи
ю 40
*
x
о ? 30
о
ю
о ш 20
и
л
ш 10
0
0 1 2 3 4 5 6 7
Время, ч
Рис. 2. Кинетические кривые высвобождения белков из полиэлектролитных капсул при рН 8,0: 1 - трипсин, 2 - инсулин, 3 - пероксидаза
микрокапсулах рН-чувствительной однородной геле-образной сетки, имеющей отрицательные и положительно заряженные группы и обладающей крупными порами.
С целью выявления закономерностей процесса включения белков в полиэлектролитные микрокапсулы из декстран сульфата, протамина и меламин формальдегида изучено влияние величины молекулярной массы и общего заряда белков на эффективность этого процесса. Результаты этого исследования представлены в таблице. Для этого при рН 8,0 капсулы помещали в растворы белков с концентрацией, достаточной для полного насыщения капсул. В этих условиях инсулин имел отрицательный заряд, а трипсин и пероксидаза - положительный. Как видно из таблицы, независимо от заряда белки входили в частицы. Коли-
чество молекул белка в микрокапсуле на один-два порядка превышало аналогичную величину для полых микрокапсул из сильных полиэлектролитов (107 молекул химотрипсина на частицу [5]), и уменьшалось с увеличением молекулярной массы белка. Следует заметить, что расчетная концентрация белка внутри капсулы оказалась во много раз больше концентрации в исходным растворе (4 мг/мл) и составляла 121, 46 и 31 (±40%) мг/мл соответственно для инсулина, трипсина и пероксидазы.
Далее нами была исследована прочность удерживания белков матрицей внутри микрокапсул. Белки высвобождались из микрокапсул при смене раствора, из которого они сорбировались, на буфер с тем же значением рН. Как видно из рис. 2, для инсулина (6,5 кД) и пероксидазы (44 кД) скорость выхода белка из капсул тем меньше, чем больше молекулярная масса. Для трипсина (24 кД) данная закономерность наблюдалась в течение 1 ч нахождения капсул в буфере, а затем скорость его высвобождения начинала превышать аналогичную величину для инсулина. Поскольку трипсин является протеиназой с рН-оптиму-мом действия, близким к 7-8, а входящий в состав капсул протамин - его прекрасным белковым субстратом [10], ферментативное разрушение одного из компонентов матрицы полиэлектролитных микрокапсул приводит к увеличению степени высвобождения белка в этом случае.
Выявленные закономерности поведения микрокапсул подобны свойствам сферических декстрановых гелей, поперечно сшитых эпихлоргидрином [11]. В зависимости от степени сшивки такие сефадексы различаются по степени набухания и размерам пор и широко используются для разделения белков по молекулярным массам.
Таким образом, полиэлектролитные капсулы на основе декстран сульфата, протамина и меламин формальдегида содержат гелеобразное содержимое, обладают порами достаточно большого размера и способны как к включению, так и к высвобождению белков. Можно предположить, что исследованные нами капсулы благодаря своим уникальным свойствам представляют собой исключительный интерес и могут найти применение для концентрирования и фракционирования белков, а также создания систем контролируемого высвобождения белковых лекарственных средств.
Белок Мол. масса, кД PI Количество молекул в микрокапсуле, + 40 %
Инсулин 6,5 5,5 58,6-108
Трипсин 24 10,5 6,1108
Пероксидаза 44 8,8 2,2-108
Работа выполнена при финансовой поддержке программы С. Ковалевской фонда А. Гумбольдта Министерства образования и исследований Германии, а также Министерства промышленности, науки и технологий РФ в
рамках российско-германского сотрудничества.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Arshady R. Microspheres. Microcapsules & Liposomes. London. 2. Sukhorukov G.B., Donath E., Lichtenfeld H. et al. // Colloids 1999. V. 1, 2. Surfaces, A. 1998. 137. P. 253.
3. Balabushevich N.G., Sukhorukov G.B., Moroz N.A. et al. // Biotech.
Bioeng. 2001. 76. P. 207.
4. Володькин Д.В., Балабушевич Н.Г., Сухоруков Г.В., Ларионо-
ва Н.И. // Биохимия. 2003 (в печати).
5. Tiourina O.P., Antipov A.A., Sukhorukov G.B. et al. // Macromol.
Biosci. 2001. 1. P. 209.
6. Lvov Y., Antipov A., Mamedov A. et al. // Nano Letters. 2001. 1. N 3.
P. 125.
7. Donath E., Sukhorukov G.B., Caruso F. et al. // Angew. Chem.
1998. 37. P. 2201.
8. Gao C., Moya S., Lichtenfeld H. et al. // Macromol. Mater. Eng.
2001. 286. P. 355.
9. Balabushevich N.G., Tiourina O.P., Larionova N.I., Sukhoru-
kov G.B. // Biomacromolecules. 2003 (in press).
10. Веремеенко К.Н. Ферменты протеолиза и их ингибиторы в ме-
дицинской практике. Киев, 1971.
11. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохи-
мика. М., 1991.
Поступила в редакцию 25.10.02
