CC BY
44
ИММОБИЛИЗАЦИЯ ГЕМОГЛОБИНА В ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫЕ КАПСУЛЫ
М. В. Ковалькова, Э. Н. Пшеничная, О. В. Воробьева, С. С. Аванесян
IMMOBILIZATION OF HAEMOGLOBIN INTO POLYELECTROLITIC CAPSULES
Kovalkova M. V., Pshenichnaya E. N., Vorobyova O. V., Avanesyan S. S.
New methods of including haemoglobin into capsules have been developed, which are generated by the methods of sequential adsorption of polyelectrolytes upon calcium carbonate matrix and protein aggregates received in its isoelectric point, there by the haemoglobin immobilization (inclusion) equals 45,64 and 58,32.% consequently.
Key words: haemoglobin, immobilization, carageenan, polyelectrolytes, chitosan.
Разработаны способы включения гемоглобина в капсулы, сформированные методами последовательной адсорбции полиэлектролитов на кальций карбонатную матрицу и агрегаты белка, полученные в его изоэлектрической точке, при этом процент иммобилизации (включения) гемоглобина составил 45,64 и 58,32 % соответственно.
Ключевые слова: гемоглобин, иммобилизация, каррагинан, полиэлектролиты, хи-тозан.
УДК 577.112.7
В настоящее время в медицинской практике особый интерес вызывают препараты, представляющие собой активные вещества, заключенные в нано- и микрообъекты (микрокапсулы, микросферы, дендримеры, липо-сомы и др.). Этот интерес обусловлен рядом положительных свойств микроконтейнеров, которые способны решить проблему точечной доставки лекарства в проблемную зону. Разработка методов включения в такого рода системы позволит создать не только новые, но и совершенствовать уже имеющиеся формы лекарственных препаратов, а также регулировать их скорость и время действия. Кроме того, нанобарьер исключает возможность прямого воздействия на активное вещество внешних факторов, способных понизить активность препарата.
Традиционные методы включения в микрообъекты фиксированного размера и формы (сферы, капсулы) основываются на физико-химических процессах преципитации, полимеризации, коацервации и т. д. Эти методы предполагают использование органических растворителей, поперечно-сшивающих агентов, что может сказаться на снижении активности вещества, включаемого в микроконтейнеры (1).
Одним из путей создания препаратов на основе природных соединений гемоглобина по эффективности и безопасности, превосходящих лекарственные препараты железа, а также получения искусственных эритроцитов в виде микроконтейнеров с гемоглобином, способных выступать в качестве
74/2011
Вестник Ставропольского государственного университета
структурных единиц заменителя крови, является включение гемоглобина в капсулы на основе природных биополимеров.
Данная работа посвящена включению гемоглобина в полиэлектролитные капсулы на основе природных полисахаридов. Актуальность работы обусловлена возможностью создания капсулированных кислородтранс-портных и безопасных лекарственных препаратов на основе природного соединения гемоглобина.
Условия эксперимента. В работе использовали гемоглобин окисленный, окси-гемоглобин, лиофилизированный, ч., ТУ 10П-297-69. В качестве полиэлектролитов использовали каррагинан ТУ 88-64-001-91 и хитозан, ТУ 6-09-73-70. Для иммобилизации гемоглобина в капсулы использовали два метода.
1 метод. Для включения (иммобилизации) гемоглобина в микрочастицы методом совместного осаждения на СаС03 матрицу использовали методику, представленную в работе (4), где ядро формировали из растворов СаС12 и Ка2С03 в присутствии раствора гемоглобина с концентрацией 5 мг/мл, объемом 3 мл. Раствор гемоглобина готовили растворением оксигемоглобина, лиофилизи-рованного в дистиллированной воде, подкисленной 0,Ш раствором соляной кислоты (рН 4,1).
При нанесении полиэлектролитных слоев на кальций карбонатную матрицу использовали растворы полиэлектролитов (ПЭ) с концентрацией 2 мг/мл в фосфатном буферном растворе (рН 6,8). Для этого к 100мг СаС03 матрицы с иммобилизованным гемоглобином поочередно добавляли по два мл растворов ПЭ, начиная с положительно заряженного хитозана. Суспензию перемешивали 10-15 минут на шейкере, после чего центрифугировали (800-1000 об/мин, 3 мин). Жидкость декантировали, а осадок дважды промывали дистиллированной водой, каждый раз центрифугируя. После этого таким же способом наносили слой каррагинана. Оболочку капсул формировали из шести слоев ПЭ: трех хитозана и трех каррагинана. Взаимодействие ПЭ между собой предполагает образование нерастворимого в условиях
формирования ПЭ-комплекса. Данный процесс имеет в основе своей электростатическое взаимодействие между противоположно заряженными ПЭ. Многократно повторяя конкурирующие процессы адсорбции последующего и десорбции предыдущего, можно получить оболочку капсулы на твердом ядре.
Получение капсулированного гемоглобина предполагает удаление ядра и в этом случае необходимо соблюдение условий, исключающих нарушение структуры ПЭ оболочки. Для разрушения СаС03 матрицы, являющейся ядром, использовали 0,1 N водный раствор ЭДТА объемом 10 мл (время перемешивания составило 15 мин). Капсулы промывали 3 раза дистиллированной водой в течение 3-5 минут и хранили в виде суспензии при 4 оС.
2 метод. По второму методу гемоглобин в капсулы включали совместным осаждением полиэлектролитов с белком в его изо-электрической точке (ИЭТ, рН 6,8). К трем мл раствора хитозана (концентрация 2 мг/мл) добавляли подкисленный 0,Ш раствором соляной кислоты (рН 4,1) раствор гемоглобина с концентрацией 5 мг/мл, объемом 3 мл и три мл раствора каррагинана с концентрацией 2 мг/мл. Формирование оболочки капсул с включенным гемоглобином осуществляли путем перемешивания на шейкере в течение 30 мин, после чего центрифугировали (800-1000 об/мин, 3 мин). Жидкость декантировали, а суспензию дважды промывали дистиллированной водой, каждый раз центрифугируя. На сформированные коллоидные частицы далее последовательно наносили ПЭ хитозан-каррагинан. Оболочку капсул формировали из шести слоев ПЭ: трех хитозана и трех каррагинана. Капсулы хранили при температуре 4 °С.
Определение концентрации белка в растворах проводили спектрофотометрически на стационарном приборе - спектрофотометре СФ-26 (ГОСТ 15150-69) по методу Варбурга и Кристиана (3). Эффективность включения (иммобилизации) белка определяли по разности оптической плотности в исходном растворе к значению в суперна-танте после включения в капсулы.
Процесс высвобождения гемоглобина из капсул происходит во времени с учетом изменения рН среды. Для анализа влияния рН среда на процесс высвобождения белка из капсул, суспензию микрочастиц помещали в буферные растворы с различным значением рН до концентрации 0,25-0,50 мг/мл. В качестве буферных растворов использовали карбонат-бикарбонатный (КББ) буферный раствор рН 7,0-11,0 (0,1 М ^СОз; 0,1 М КаНС0з/0,2 М КаОН). После часа перемешивания на шейкере образцы центрифугировали (800-1000 об/мин, 3 мин), и в супер-натанте определяли концентрацию белка по методу Варбурга и Кристиана. Процент высвобождения белка из микрочастиц определяли как отношение содержания белка в суперна-танте к содержанию белка в суспензии частиц.
Изучение кинетики высвобождения белка из микрочастиц проводили в КББ буферном растворе рН 9,5. К суспензии микрочастиц добавляли КББ буферный раствор до конечной концентрации капсул 0,25-0,50 мг/мл. Суспензию частиц перемешивали на
шеикере и через следующие промежутки времени, равные 30 мин, 60 мин, 3, 6, 12 и 24 часа пробы образцов центрифугировали (800-1000 об/мин, 3 мин) и в супернатанте определяли содержание белка.
Статистическая обработка результатов исследования проводили с помощью программы Statistic V.6 с привлечением метода искусственные нейронные сети (Neural Networks).
Результаты и их обсуждение. При выборе полиэлектролитов мы остановились на полисахаридах природного происхождения - каррагинане и хитозане. Выбор данной пары электролитов обусловлен их способностью образовывать прочные ПЭ комплексы за счет электростатических сил между разноименными группами, расположенными на поверхности ПЭ (5, 6). Кроме того, наличие неполярных участков полиэлектролита может отвечать за образование водородных связей или гидрофобного взаимодействия (7). Иммобилизация гемоглобина в капсулы по методу 1 представлена на рисунке 1.
Б
(+)- пош 1эл ектр ол ит
§0 ©е
молекула гемоглобина
(-)-полиэлекгролит
А
оооо оо ООО оооосшсзоо оо
oo_qoq д. .оооо q о ОООООО ОО
J О О ООО Н-попюлектролчт
0о88°8о°8о8о0
ООО ООО
Твердые микрочастицы с имшпи.ипопаниымн молекулами белка
Л111крочастицы с пк.почениымн
молекулами белка
Рис. 1. Иммобилизация гемоглобина в капсулы методом совместного осаждения в изоэлектрической точке (А) и на СаСОз микрочастицы(Б)
74/2011 га
Вестник Ставропольского государственного университета ^дд
Рис. 2. Фотографии полученных сферических СаСОз частиц (2) (А-В)
Карбонатные микрочастицы получали смешиванием двух солей - CaCl2 и Na2CO3, их структура, как свидетельствуют литературные источники (2), представляет собой микропористые сферы (рисунок 2).
Процент включения гемоглобина в капсулы методом совместного осаждения на CaCO3 составил 45,64 %. Невысокий процент включения белка, вероятно, связан с потерями на стадии разрушения ядра хелат-ными агентами. С целью повышения эффективности капсулирования гемоглобина разработан метод совместным осаждением его с полиэлектролитами в изоэлектрической точке (ИТ) (рН 6,8) (метод 2). Процент включения гемоглобина в капсулы, сформированные различными методами, представлен в таблице.
Эффективность включения гемоглобина падает с увеличение количества слоев ПЭ, что может быть технологическими потерями, а не вытеснением белка полиэлектролитами.
Высвобождение белка из капсул связано с изменением рН и ионной силы раствора. Максимальный процесс высвобождения белка наблюдался при значении рН 13,0, при этом капсулы полностью разрушались. Кинетика высвобождения гемоглобина из капсул представлена на рисунке 3.
Данные, представленные на рисунке, свидетельствуют о том, что способ включения белка в капсулы не оказывает влиянии на процесс его высвобождения во времени. Максимальное высвобождение белка наблюдалось через 24 часа. Можно предположить, что процесс высвобождения связан с количеством ПЭ слоев в капсуле. В наших случаях оно одинаково и равно шести.
С помощью программы Statistic V.6 проведена оптимизация условий (рН и времени), влияющих на высвобождение гемоглобина из капсул и построена поверхность отклика зависимости входящих факторов на выходные параметры (рисунок 4).
Иммобилизация гемоглобина в полиэлектролитные капсулы
ГУ" и и
СиЬсиС Ко.тчег.т&и
ВКЛЮЧЕНИЯ Ч«\ТКЛ,
Е1ЯТОГО ДЧЛ ЛТГЯ Л1Т1Л. мг
■'. 'мся^етте ш СаССч
Кя^'йждн гаё л ЮТ?
I
Таблица
Кииичепви Кшшчзд'гви П[М.Ц1гН|
СЛМБ Е КЛЮЧ ЖИЛОГО ВКЛЮЧЕНИЯ
гемоглобина. "о
■\1Г
■-1 4~^Г.| 1 Й.50
4 49,25 1 №Г
Г? № 45 даи.40
п
4 9,25
Р У,00
Ет-ЦЗ: Р-0Д5
I
<с I»
ч!
§
3
10
9
8
■у
6 5
4
3
•у
1
О
—""
/
__—
„ ■й-
/
/ >
/ /
1
О
20
74
5 10 15
■ Соосажденне в ПЭТ Соосажденпе на СаСОЗ
Рис. 3. Кинетика высвобождения гемоглобина из капсул
30
Время,ч
Рис. 4. Поверхность отклика зависимости входящих факторов на выходные параметры
74/2011
Вестник Ставропольского государственного университета
Разработка методов капсулирования гемоглобина может оказать неоценимую роль в получении лекарственных препаратов пролонгированного действия. Решение вопроса, связанного с доставкой гемоглобина к эритроцитам, требует выбора объектов и разработки методов его транспортировки.
Работа выполнена в рамках проведения поисковых научно-исследовательских работ по направлению «Коллоидная химия и поверхностные явления» мероприятия 1.3.2.
Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 - 2013 годы по теме: «Разработка научных основ построения коллоидных ансамблей с заданными свойствами и функциями с учетом принципов самосборки и взаимной комплиментарности с целью использования их в качестве контейнеров для иммобилизации биологически активных субстанций» (Конкурс № НК-365П; контракт П1754 от 29.09.2009).
ЛИТЕРАТУРА
1. Бородина Т. Н., Румш Л. Д., Кунижев С. М., Сухоруков Г. Б., Ворожцов Г. Н., Фельдман Б. М., Марквичева Е. А. Полиэлектролитные микрокапсулы как системы доставки биологически активных веществ // Биомедицинская химия. 2007. № 53(5). С. 557-565.
2. Мустафаев М. И. Комплексы неприродных полиэлектролитов с белками: дис. ... д-ра хим. наук. - М.: МГУ, 1981. - С. 344.
3. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Элиот, У. Элиот; пер. с англ. - М.: Мир, 1991. -544 с. ил.
4. Antipov A. A., Shchukin D., Fedutik Y., Pet-rov A. I., Sukhorukov G. B. Carbonate mi-croparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Surf.: Physicochem. Eng. Aspects. 2003. V. 224. P. 175-184.
5. Houska M. and Brynda E. Interactions of proteins with polyelectrolytes at solid/liquid interfaces: Sequential adsorption of albumin and heparin. J. Colloid Interface Sci. 1997. V. 188 (2). Р. 243-250.
6. Lvov Y., Onda M., Ariga K. and Kunitake T. Ultrathin films of charged polysaccharides assembled alternately with linear polyions. J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 1998. V. 9(4). Р. 345-355.
7. Lvov Y. M. and Sukhorukov G. B. Protein architecture: Assembly of ordered films by means alternated adsorption of opposite charged mac-romolecules. Membr. Cell. Biol. 1997. V. 11.
Об авторах
Ковалькова Маргарита Владимировна, ГОУ
ВПО «Ставропольский государственный университет», аспирант кафедры биологической и медицинской химии, медико-биолого-химического факультета. Сфера научных интересов - биохимическая технология. шш^о.к@ list.ru
Пшеничная Эмма Николаевна, ГОУ ВПО
«Ставропольский государственный университет», аспирант кафедры биологической и медицинской химии, медико-биолого-химического факультета. Сфера научных интересов - биохимическая технология. р$ЬешсЬпауа-еп@ arnest.ru Воробьева Оксана Владимировна, ГОУ ВПО «Ставропольский государственный университет», кандидат биологических наук, доцент кафедры биологической и медицинской химии, медико-биолого-химического факультета. Сфера научных интересов - биохимическая технология. уоу-91 @ yandex.ru
Аванесян Светлана Суреновна, ГОУ ВПО
«Ставропольский государственный университет», ассистент кафедры биологической и медицинской химии, медико-биолого-химического факультета. Сфера научных интересов - биохимическая технология. biomedchem@stavsu.ru
Р. 277-303.
