CC BY
16
DOI 10.31588/2413-4201-1883-240-4-84-87
УДК: 616.981.51:616-07
ПОЛУЧЕНИЕ И ОЧИСТКА ПРОТИВОСИБИРЕЯЗВЕННЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
Задорина И.И. - аспирант
ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»
Ключевые слова: сибирская язва, иммуноглобулин, антиген, сыворотка Keywords: anthrax, immunoglobulin, antigen, serum
Опасная сапрозоонозная инфекционная болезнь людей и животных, вызываемая спорообразующей бактерией Bacillus anthracis. Характеризуется острым течением, тяжелой интоксикацией, лихорадкой, септицемией, возникновением отеков и карбункулов. Протекает в кожной, ле-гочной(ингаляционной) и кишечной формах [4].
К настоящему времени уже накоплен достаточный материал, который дает отчетливое представление о сибиреязвенной инфекции. Однако и на сегодняшний день много теоретических и практических вопросов, связанных с необходимостью дальнейшего, еще более углубленного изучения этой инфекции [6,7].
В последние годы заболеваемость сибирской язвой на территории России несколько стабилизовалась, однако угроза возникновения полностью не устранена [1,5]. Одной из главных причин имеющегося эпизоотологического и эпидемиологического неблагополучия по сибирской язве является способность возбудителя образовывать во внешней среде устойчивые споры, что обуславливает не только дальнейшее сохранение возбудителя в абиотическом состоянии, но и возможность размножаться и накапливаться в почве [2]. При определенных условиях это способствует созданию долговременных активных почвенных очагов и потенциально опасных территорий и может приводить к постоянной угрозе заражения, развития эпизоотий и эпидемий. В этой связи возникает острая необходимость в усовершенствовании и создании новых диагностических препаратов [3]. Для изготовления диагностикумов необходимо приме-
нить высоко активные и специфические антитела. Это достигается благодаря дробным многократным гипериммунизации лабораторных животных введением различных доз АГ.
Целью работы явилось получение высокоактивных и специфичных, сибиреязвенных иммуноглобулинов.
Материал и методы исследований. Иммунизацию кроликов проводили пятикратым введением протективного сибиреязвенного антигена в определенной дозе внутрикожно вдоль позвоночного столба в пять точек с каждой стороны с интервалом между инъекциями 7-10 дней. Глобулиновую фракцию из сыворотки получали путем высаливания насыщенным сернокислым аммонием. Отмеренный объем сыворотки помещали в химический стакан на магнитном смесителе, в ледяную баню при температуре 4°С. После остановки смесителя добавляли в сыворотку пипеткой насыщенный раствор сернокислого аммония в объеме, равном половине объема сыворотки (насыщенный раствор сернокислого аммония содержит 542г соли в 1л дистиллированной воды). После перемешивания в течение 20 минут, центрифугировали при 10 000об/мин. Жидкость над осадком удаляли, а полученный осадок растворяли в 0,15М растворе хлористого натрия. Диализационную жидкость в первый день меняли каждые четыре часа, в следующие три - четыре дня - один раз в день до полного исчезновения сернокислого аммония.
Контроль окончания диализа проводили с помощью 10% раствора хлористого бария. В одну пробирку наливали 5мл диализата, в другую 5мл раствора сер-
нокислого аммония в разведении 1:300 000 (контроль). В обе пробирки добавляли по несколько капель 10% раствора хлористого бария. Если исследуемый диализат мутнеет не более, чем контрольный раствор, то диализат считали законченным.
Результаты исследований.
Очистку и разведение белков глобулино-вой фракции проводили на хроматографи-ческой колонке с ДЭАЭ - целлюлозой. Для этого 50г ДЭАЭ целлюлозы растворяли в 1л дистиллированной воды, непрерывно помешивая. Оставляли на 45минут и удаляли желтоватый отстой жидкости над целлюлозой. Растворяли целлюлозу в 1л 1Н КаОИ. Через 30минут удаляли жидкость и растворяли целлюлозу в 1л 1Н соляной кислоты. Оставляли на 30минут, в течение этого времени целлюлоза подвергалась осветлению. Удаляли отстой и растворяли целлюлозу в 1л 1Н КаОИ. Спустя 30минут пропускали целлюлозу через во-
где х - содержание белка, мг/мл
а - разведение.
Титры антител сыворотки крови определяли в ИФА. Постановку реакции осуществляли в непрямой модификации ИФА. Для иммобилизации антигена использовали твердую фазу иммунологических планшет производства ВНИИ «Мед-техника» (г. Москва). Растворение антигена белковой природы (протективного) и сенсибилизацию планшет проводили КББ рН 9,25±0,25, тогда как для липополисаха-ридного антигена (капсульного) использовали ФСБ с добавлением 0,5 мл детергента - твин 20. В качестве антивидовых антител, меченных ферментом, использовали -иммуноглобулины диагностические О (И-Ь) кролика. Для выявления активности фермента в иммунной системе «антиген-антитело» применяли орто-финилендиа-миновый субстрат. Реакцию останавливали раствором серной кислоты в концентрации 0,5 моль/л.
С помощью дозатора пипеточного в лунки планшета вносили раствор антигена по 200 мкл при концентрации белка 10
ронку Бюхнера, заполненную фильтровальной бумагой, и промывали 10л дистиллированной воды. После доведения рН 7,2, ее заливали 500мл 0,01М фосфатного буфера рН 7,2.
Заполняли целлюлозой колонку диаметром 2,5см. Наполнение проводили постепенно и точно до высоты 40см. Затем доводили рН вытекающего из колонки стартового буфера до рН 7,2. Пипеткой добавляли в колонку очень осторожно 10мл иммуноглобулинов, предварительно за ночь диализированной стартовым буфером. Промывание начинали 0,01М фосфатным буфером рН 7,2 и продолжали его промывать порциями этим же буфером с возрастающей молярностью и уменьшающимся рН. Вытекающие фракции собирали в пробирки коллектора фракций - по 10мл каждой фракции. Белок определяли спектрометрически при длине волны 280нм, по формуле:
х= (а*280), 1,35
мкг/мл. Адсорбцию антигена на планшете проводили в течение 2 часов при температуре (37±1)°С. Затем раствор из лунок удаляли, и трехкратно промывали каждую лунку, используя ФСБ-Т. В лунки А-1, В-1 вносили по 200 мкл контрольную положительную сыворотку в рабочем разведении, в лунки С-1,Б-1 - контрольную отрицательную сыворотку в рабочем разведении, а в остальные лунки планшета по 200мкл исследуемых сывороток также в рабочем разведении в ФСБ-Т. Лунки Е-1, Б-1, О-1, И-1 оставляли пустыми. Выдерживали при температуре (37±1)°С в течение 1 часа и также раствор удаляли и отмывали планшет как указано выше. В каждую лунку планшета вносили по 200мкл антивидовых антител меченных пероксидазой хрена в рабочем разведении, кроме лунок О-1, И-1 и выдерживали в термостате при температуре (37±1)°С. Планшет промывали трехкратно и в каждую лунку вносили по 150мкл субстратной смеси. Выдерживали при комнатной температуре в течение 25
минут в темном месте. Реакцию останавливали внесением во все лунки планшета по 50мкл останавливающего раствора.
Содержание белка в иммуноглобулине составило - 25мг/мл. Активность
На основании полученных результатов можно заключить, что выбранный нами метод выделения и очистки иммуноглобулинов в ионообменной хроматографии на колонке ДЭАЭ - целлюлозой не снижает активность.
Заключение. Полученный высокоактивный, специфичный, очищенный сибиреязвенный глобулин, в дальнейшем будет использоваться для получения флюоресцирующей сибиреязвенной сыворотки для индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы в биологических объектах.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Галиуллин, А.К. Получение кап-сульно-протективной противосибиреяз-венной сыворотки / А.К. Галиуллин, И.И. Задорина, С.В. Иванова, Л.А. Мельникова // Ученые записки Казанской государственной академии ветеринарной медицины Н.Э. Баумана. - 2019. - Т.237 (I). - С. 44-47.
2. Галиуллин, А.К. Субъединичный сибиреязвенный антиген и его диагностические значения / А.К. Галиуллин, В.П. Кок-син, А.И. Алимов, К.И. Салмаков // Ветеринария. - 1996. - N 1. - С.23-25.
иммуноглобулинов, выделенных из сыворотки, испытали в непрямом варианте ИФА. Результаты изучения активности иммуноглобулинов представлены в таблице.
3. Коксин, В.П. Получение высокоспецифических антигенов и их иммунологическая характеристика / В.П. Коксин, А.К. Галиуллин, Н.И. Табакова, А.И. Алимов // Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. - 1996. - С. 141.
4. Кубицы, Ю.Ф. Иммунофлюоресцен-ция / под. ред. Ю.Ф. Кубицы // Государственное медицинское издательство. -1967. - 249с.
5. Лобач, Р.Н. Испытание сибиреязвенных флуоресцирующих иммуноглобулинов, предназначенных для выявления возбудителя сибирской язвы / Р.Н. Лобач, А.С. Абдрашитова, Л.В. Саяпина // Биопрепараты. - 2013. - N 6. - С. 15-19.
6. Микробиология: учебное пособие / Р.Г. Госманов, А.К. Галиуллин, А.Х. Волков, А.И. Ибрагимова // 2-е изд., стер.-СПб.: Издательство «Лань», 2017.- 496 с.
7. Супотницкий, В.В. Роль Российских ученых в разработке сибиреязвенных вакцин / В.В. Супотницкий, И.В. Борисевич, ИВ. Кливов, АН. Шевцов, М.Ю. Луб, А.С. Туманов // Актуальная инфектология. - 2015. - N 12. - С. 23-27.
Таблица - Активность противосибиреязвенных иммуноглобулинов сывороток крови кроликов в ИФА_
Антигены Титр антител
Гипериммунные сыворотки Иммуноглобулины
Соматический 1:2048 1:4096
ПОЛУЧЕНИЕ И ОЧИСТКА ПРОТИВОСИБИРЕЯЗВЕННЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
Задорина И.И.
Резюме
Целью работы было получение высокоактивных и специфичных иммуноглобулинов, для изготовления и получения флюоресцирующей сибиреязвенной сыворотки для индикация и идентификации возбудителя сибирской язвы в биологических объектах. При проведении гипериммунизации использовали пятикратную схему с внутрикожным введением
86
протективного сибиреязвенного антигена. Интервал между введениями составлял 7 суток. Иммуноглобулиновую фракцию из гипериммунной сыворотки выделяли путем высаливания сульфатом аммония и отчистки на хроматографической колонке с ДЭАЭ-целлюлозой с последующим контролем активности в непрямом методе ИФА. Проведенная работа позволили нам освободится от основного количества балластных белков и получить специфичный глобулин для изготовления диагностикумов.
OBTAINING AND PURIFYING ANTICHARBONNEUX IMMUNOGLOBULINS
Zadorina I.I.
Summary
The aim of the research was to obtain active and specific immunoglobulins and fluorescent serum for indication and identification of anthrax in biological objects. In hyperimmunization, the five - fold scheme of protective anthrax antigen injection was used. Interval between the injections was 7 days. Immunoglobulin fracture from hyperimmune serum was allocated through ammonium sulphate and the chromatography with DEAE cellulose. Control of activity was performed by indirect ELISA. This method allowed us to eliminate the main quantity of ballast proteins and to get a high-specific globulin for diagnostic systems.
DOI 10.31588/2413-4201-1883-240-4-87-92 УДК 619:612.12:636.085.54:636.2
МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ КОРОВ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ АКТИВИРОВАННОГО ЭНЕРГОПРОТЕИНОВОГО КОНЦЕНТРАТА
«БИОГУММИКС»
Закиров Т.М.- к.б.н., *Шакиров Ш.К.-д.с/х.н., профессор, Волков А.Х - д.в.н., профессор, Юсупова Г.Р. - д.б.н., Николаев Н.В - к.в.н.
ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана» *ТатНИИСХ - федеральный исследовательский центр «Казанский научный центр Российской
академии наук»
Ключевые слова: дойная корова, торф, активированный энергопротеиновый концентрат, гемоглобин, эритроциты, лейкоциты, общий белок, альбумины, мочевина
Keywords: dairy cow, peat, activated energy protein concentrate, hemoglobin, red blood cells, white blood cells, total protein, albumin, urea
Для повышения молочной продуктивности коров необходимо создать рационы кормления, обеспечивающие животных достаточным количеством энергии, питательных веществ, также витаминов. Без создания кормов, сбалансированных по белку, углеводам, микро- и макроэлементам, липидам, витаминам и другими биологически активными соединениями у животных нарушается обмен веществ, и появляются различные негативные последствия [2, 20, 22]. Для восполнения недостающих элементов питания в последние
годы используются различные кормовые добавки, в том числе полученные из торфа - «Комбиолакс», «Сувар», «Гумифит» и другие. Вырабатываемая из низинного торфа кормовая добавка «Комбиолакс» содержит в своем составе соединения гумусового комплекса (гуминовые кислоты, фульвокислоты, аминокислоты, минеральные вещества и другие компоненты. Использование этих препаратов на практике связано со стимуляцией обмена веществ, повышением устойчивости животных к различным неблагоприятным условиям
