CC BY
97
УДК 616.981.51:616.-097
В.П.Бондарев, А.В.Филиппов, И.В.Дармов, И.В.Живов, В.А.Пятков
РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ МОНОКЛОНАЛЬНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА BACILLUS ANTHRACIS
48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны
Российской Федерации, Киров
Разработана высокочувствительная и специфичная моноклональная иммуноферментная тест-система, перспективная для обнаружения и количественного определения протективного антигена сибиреязвенного микроба в полуфабрикатах на стадиях приготовления химической сибиреязвенной вакцины. Сформирована коллекция из 13 стабильных гибридных клонов, характеризующихся высокими продуктивными и ростовыми свойствами.
Ключевые слова: В. anthracis, протективный антиген сибиреязвенного микроба, моноклональные антитела, иммуноферментный анализ.
Сибирская язва продолжает оставаться значимой проблемой для здравоохранения [1]. Особую актуальность эта инфекция приобрела после появления сообщений о применении спор В. anthracis в качестве бактериологического оружия в США осенью 2001 г. По данным Центра по контролю и профилактике заболеваний были зарегистрированы 11 случаев кожной и 11 случаев легочной формы болезни, из которых 5, несмотря на интенсивную ан-тибиотикотерапию, закончились летальным исходом [6]. Таким образом, необходимость специфической иммунопрофилактики сибирской язвы не вызывает сомнений. В 1992 г. в 48 ЦНИИ МО РФ было освоено производство высокоэффективной комбинированной сибиреязвенной вакцины, в состав которой, помимо живых спор бескапсульного штамма В. anthracis СТИ-1, входит адсорбированный на оксиде алюминия протективный антиген (ПА), используемый во многих зарубежных странах в качестве химической сибиреязвенной вакцины [2, 8]. Для оценки качества и повышения эффективности производства этих препаратов необходим надежный и экспрессный метод количественного определения ПА. Оптимальным, с нашей точки зрения, методом для решения этой задачи является иммуноферментный анализ (ИФА).
Целью настоящей работы явилось получение моноклональных антител (МКАТ) к ПА и разработка на их основе иммуноферментной тест-системы для обнаружения и количественного определения ПА В. аnthracis.
Материалы и методы
Препарат ПА, используемый для сенсибилизации планшетов и иммунизации животных, выделяли из полуфабриката химической сибиреязвенной вакцины - культуральной жидкости после выращивания клеток штамма СТИ-1 в жидкой питательной среде на основе гидролизата казеина. Методика выделения и очистки ПА включала ультрафильтрацию через мембраны УАМ-100, ионообменную хроматографию на КМ-toyopearl и ДЭАЭ-toyopearl (Toyo
soda, Япония) и адсорбционную хроматографию на гидроксилапатите (Serva, ФРГ). Полученные препараты очищенного ПА содержали от 78 до 380 мкг белка в 1 мл. В реакции диффузионной преципитации [10] с моноспецифической кроличьей сывороткой (48 ЦНИИ МО РФ) линии преципитации формировались при разведении от 1:32 до 1:128. Другие серологически активные примеси не выявлялись.
При получении гибридом-продуцентов МКАТ к ПА B. anthracis иммунизацию мышей линии BALB/с проводили путем 3-кратного подкожного введения животным возрастающих доз высокоочи-щенного препарата ПА, сорбированного на гидроокиси алюминия (по 4-8-16 мкг белка на животное) с интервалом 21 сут. Заключительную иммунизацию проводили внутрибрюшинным введением 20 мкг белка ПА в 0,9 % растворе хлорида натрия через 30 сут после окончания циклической схемы иммунизации.
Гибридизацию спленоцитов иммунизированных мышей с клетками миеломы SP 2/0-Ag.l4 осуществляли на 4-е сутки после заключительной иммунизации с использованием 50 % раствора поли-этиленгликоля (ПЭГ 1560 Sigma, США) по общепринятой методике [5].
Скрининг первичных гибридных клонов проводили начиная с 12-х суток культивирования трижды с интервалом 2-3 дня, а скрининг антителопродуцирующих гибридом - на 12-15-е сутки после клонирования.
Для тестирования использовали 96-луночные планшеты (Costar, США), сенсибилизированные препаратами очищенного ПА B. anthracis в концентрации 1,4 мкг/мл. Второе и третье тестирование всех первично-позитивных культур (ППК) проводили, кроме того, с использованием комплекса термостабильных антигенов сибиреязвенного микроба и ультразвуковых дезинтегратов гетерологичных аэробных сапрофитов: Bacillus cereus штаммов 96, 8, Bacillus subtilis штаммов 35, 38 и Bacillus megate-rium штаммов 2, 654, взятых в концентрации 1 млрд м.к. в 1 мл. Конъюгат кроличьих иммуно-
бб
глобулинов с пероксидазой хрена против Ig G мыши (Sigma, США) применяли в рабочем разведении 1:5000. В качестве субстрата использовали ортофе-нилендиамин (Sigma, США). Оптическую плотность субстратно-индикаторной смеси измеряли на фотометре Multiskan (Labsystems, США) при длине волны 492 нм.
Штаммы микроорганизмов, использованные в работе, получены из коллекции микробных культур 48 ЦНИИ МО РФ.
Для получения асцитных жидкостей мышам линии BALB/с интраперитонеально вводили сначала по 0,5 мл пристана (Sigma, США), а через 20 сут - от 1 до 5 млн гибридомных клеток. Выделение МКАТ из асцитной жидкости осуществляли однократным осаждением сульфатом аммония при 40 % насыщении с последующей очисткой диализованных препаратов МКАТ путем ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе (Whatman, Великобритания).
Специфичность МКАТ различных клонов гибридом по отношению к эпитопам ПА подтверждали методом иммуноблотинга. Для этого высокоочи-щенный препарат ПА подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле (линейный градиент от 10 до 15 %) толщиной 1,5 мм в присутствии додецил-сульфата натрия [7] с использованием прибора PROTEAN II xi (BioRad, США). В качестве маркеров использовали набор белков (Sigma, США) с диапазоном молекулярных масс 14,4-97,4 кД. На всю ширину геля наносили 13 мкг препарата ПА в 1,6 мл буферного раствора для подготовки образцов. После электрофореза разделенные белки переносили на нитроцеллюлозную (НЦ) мембрану SM-11307 (Sartorius, ФРГ) с использованием прибора Transphor TE50 (Hoefer, США) [12]. После завершения электропереноса НЦ мембрану разрезали на полосы шириной 1,5 см, а затем инкубировали с жидкими образцами МКАТ, разведенными в 4 раза буферным раствором для инкубации, и конъюгатом кроличьих иммуноглобулинов с пероксидазой хрена против Ig G мыши (Sigma, США) в рабочем разведении 1:1000 в течение 18 ч при комнатной температуре [11]. Визуализацию прореагировавших антител осуществляли с использованием субстратно-индикаторной смеси на основе 3,3'-диаминобензидина с хлористым никелем [4].
Синтез конъюгатов МКАТ с пероксидазой хрена (Sigma, США) осуществляли c использованием перйодатного окисления [9]. Рабочее разведение иммунопероксидазных конъюгатов (ИПК) определяли методом «шахматного» титрования.
Для определения оптимальной сенсибилизирующей дозы МКАТ в лунки 96-луночного планшета вносили раствор иммуноглобулинов в концентрации от 0,062 до 16 мг/мл белка в 0,05 М карбо-натно-бикарбонатном буферном (КББ) растворе. Планшеты инкубировали в течение 1 ч при температуре 37 °С.
Результаты и обсуждение
Всего было проведено три опыта по слиянию иммунных спленоцитов и миеломных клеток. В ре-
зультате получено 78 ППК, продуцирующих МКАТ к ПА B. anthracis. С целью отбора наиболее перспективных для клонирования ППК оценивали морфологию растущих гибридных клеток, их пролиферативную активность, а также способность сохранять высокий уровень синтеза специфических антител. В результате были отобраны 21 ППК, которые подвергли клонированию методом предельных разведений. По результатам оценки пролиферативной активности и стабильности антителопро-дукции отобраны 13 гибридом от соответствующих им ППК, которые затем были использованы для наработки МКАТ in vivo.
Полученные асцитные жидкости исследовали в ИФА. Уровень продукции МКАТ у 4 гибридом оказался невысоким. Наиболее выраженная специфическая активность (на уровне титров от 1:160000 до 1:2560000) отмечена у 9, секретируемых гибридо-мами линий 6D9C5, 24F9F10, 21B4G3, 43C6C9, 43E5C9, 29C4G8, 27E9F7, 25A6C9, 46B7B10, которые также характеризовались высокой стабильностью своих основных свойств в процессе культивирования in vivo.
При исследовании в иммуноблотинге специфичности наработанных in vitro МКАТ девяти вышеуказанных гибридом (рисунок) обнаружено, что все они взаимодействовали с эпитопами, расположенными на белках с молекулярными массами 83,
67 и 43 кД, а МКАТ, секретируемые гибридомами 29C4G8, 43C6C9, 27E9F7, 25A6C9 и 43E5C9, кроме того, связывались с фрагментами ПА с молекулярными массами 34 и 20 кД. Было также установлено, что данные МКАТ проявляли специфичность как к нативному ПА83 и его субдоменам ПА63 и ПА20, так и к фрагментам денатурированного ПА83.
С целью выбора препаратов МКАТ, обеспечивающих наиболее высокую эффективность имму-ноферментных реакций, направленных на выявление ПА B. anthracis, опробованы в качестве сенси-тина и основы для приготовления ИПК различные комбинации специфических иммуноглобулинов, продуцируемых вышеуказанными гибридными клонами (табл. 1).
Результаты ИФА были отрицательными при использовании в качестве сенситина и основы ИПК МКАТ одной гибридомы, а также при сочетаниях МКАТ 24F9F10-21B4G3, 24F9F10-
46B7B10, 29C4G8-43E5C9 и др., что можно объяснить одноэпитопной направленностью антител,
133456789
Результаты иммуноблоттинга ПА с МКАТ гибридом:
1 - 6D9C5, 2 - 24F9F10, 3 - 21B4G3, 4 - 46B7B10, 5 - 29C4G8, б - 43C6C9, 7 - 27E9F7, 8 - 25A6C9, 9 - 43E5C9
Чувствительность ИФА при выявлении ПА В. аМИтет в условиях постановки реакций с использованием разных комбинаций специфических МКАТ
Таблица 1
МКАТ, использованные для сенсибилизации планшета Чувствительность ИФА п )и выявлении ПА с использованием ИПК, приготовленного на основе МКАТ ..., нг/мл (X ±I95, Х)
6D9C5 24F9F10 21B4G3 43C6C9 43E5C9 29C4G8 27E9F7 25A6C9 46B7B10
6D9C5 Н 6,8±1,03 30,4±3,11 60,8±6,23 30,4±3,11 8,8±0,15 17,6±3,11 121,6±12,46 243,2±24,93
24F9F10 2,б±0,58 Н Н 2,8±0,б1 2,4±0,51 2,2±0,39 0,72±0,15 б,4±1,1б Н
21B4G3 17, б±3, 11 Н Н 4,8±1,03 2,8±0,б1 2,2±0,39 1,б±0,29 б,8±1,03 Н
43C6C9 115,2±1б,49 7,2±0,78 7,2±0,78 Н Н Н 6±1,23 243,2±24,93 Н
43E5C9 11,2±2,34 2,4±0,51 2,8±0,б1 Н Н Н 2,4±0,51 3±0,61 Н
29C4G8 9,б±2,0б 8,8±0,15 6,8±1,03 Н Н Н 10,4±2,0б 5,2±1,1б Н
27E9F7 8,8±0,15 1,2±0,25 1,5±0,3 6±1,23 2,8±0,б1 2,8±0,б1 Н Н 281,б±49,8б
25A6C9 140,8±24,93 8,8±0,15 9,б±2,0б 243,2±24,93 14,4±2,06 8,8±0,15 Н Н 28,8±4,12
46B7B10 243,2±24,93 Н Н Н Н Н 140,8±24,93 28,8±4,12 Н
Примечания: Н - невозможно выявление ПА при данном сочетании; во всех случаях п=10.
или за счет экранирования эпитопов при их близком расположении. Высокая чувствительность ИФА при выявлении ПА обеспечивается при следующих сочетаниях МКАТ в качестве сенситина и основы для ИПК: 21В4а3-27Б9Р7, 27Е9Р7-
24Р9Р10, 27Б9Р7-21В403, а наибольшая - при сочетании 24Р9Р10-27Е9Р7. Таким образом, в основу тест-системы взяли МКАТ 24Р9Р10, используемые в качестве сенситина и меченные пероксидазой антител 27Е9Р7.
В результате определения влияния сенсибилизирующей дозы МКАТ на чувствительность и воспроизводимость ИФА установлено, что полный уровень сенсибилизации планшета в течение 1 ч при температуре 37 °С обеспечивается при концентрации иммуноглобулинов 2 мкг/мл. Увеличение концентрации антител до 16 мкг/мл повышения чувствительности не давало, а применение МКАТ в концентрации 1 мг/мл и менее не обеспечивало воспроизводимости ИФА. При переводе препаратов МКАТ в лиофилизированную форму была использована концентрация препарата МКАТ до высушивания 40 мкг/мл (10-кратный концентрат).
Для обоснования формы выпуска тест-системы нами исследована способность сохранять стабильность трех экспериментальных серий в жидком и лиофилизированном состоянии по изменению чувствительности в процессе их хранения при разных температурных режимах. Жидкие препараты иммуноглобулинов хранили в виде 10-кратного концентрата в 30 % растворе глицерина в
0,025 М фосфатном буферном растворе (ФБР) с рН 7,5. Для лиофилизации и получения сухой формы иммуноглобулинов использовали 7,5 % раствор сахарозы в 0,5 М КББ с рН 9,6. Жидкий иммуно-ферментный конъюгат хранили в виде 20-кратного концентрата в 30 % растворе глицерина в 0,05 М ФБР с рН 7,4 с добавлением нормальных мышиных иммуноглобулинов (НМИ) в концентрации 5 мг/мл; в качестве консерванта использовали фенол до конечной концентрации 0,1 %. Для лиофилиза-ции ИПК использовали защитную среду следующего состава: 0,1 М раствор ТРИС с рН 7,4, нМи -5 мг/мл, сахароза - 7,5 %.
В результате исследований установлено, что при температуре от 2 до 6 °С заметное уменьшение специфической активности тест-системы в жидком виде наблюдалось после 12 месяцев хранения, а при температуре от 18 до 22 °С - по истечении 30 дней. Чувствительность лиофилизированной тест-системы в процессе хранения в указанных температурных режимах оставалась на исходном уровне (табл. 2).
Таким образом, получено 9 гибридом-проду-центов МКАТ к ПА, сохраняющих высокую стабильность основных свойств при культивировании in vivo. На их основе разработана высокочувствительная и специфичная иммуноферментная тест-система, перспективная для количественного определения ПА в полуфабрикатах на стадиях приготовления химической (комбинированной) сибиреязвенной вакцины.
Таблица 2
Динамика снижения чувствительности сухой и жидкой форм экспериментальной серии иммуноферментной тест-системы для обнаружения и количественного определения ПА сибиреязвенного микроба в процессе ее хранения
при разных температурных режимах
Температурный режим хранения тест-системы Форма Уровень чувствительности ИФА при исследовании препарата ПА B. Gnthracis, %
сразу после изготовления после хранения в течение
1 мес. | 3 мес | 6 мес. | 12 мес.
Постоянно при температуре Сухая 100 100 100 100 100
от 2 до 6 °С Жидкая 100 100 100 100 50
Постоянно при температуре Сухая 100 100 100 100 100
от 18 до 22 °С Жидкая 100 50 25 12,5 б,25
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Онищенко Г.Г. и др. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики. - М., 1999. - 2. Садовой Н.В. и др. Пат. № 2115433 РФ. Вакцина сибиреязвенная
комбинированная // Бюл. изобр. - 1998. - № 20. - 3. Bhatnagar R., Batra S. // Crit. Rev. Microbiol. - 2001. - Vol. 27. - Р. 167200. - 4. De Bias A.L., Cherwinski H.M. // Anal. Biochem. - 1983. - Vol. 133, N 8. - P. 214-219. - 5. Galfree G. et al. // Nature. - 1977. - Vol. 266, N 5602. - P. 550-552. - 6. Jernigan D.B. et al. // Emerg. Infect. Dis. - 2002. - Vol. 8, N 10. - Р. 10191028. - 7. Laemmli U.K. // Nature. - 1970. - Vol. 287, N 5259. -P. 680-685. - 8. Leppla H.S., Robbins J.B., Schneerson R., Shiloach J. // J. Clin. Invest. - 2002. - Vol. 110, N 2. -Р. 141-144. - 9. Nacane P.K., Kawaoi A. // J. Histochem. Cytochem. - 1974. - Vol. 22, N 12. - P. 1084-1091. - 10. Ouch-terlony O. // Scand. J. Lab. Invest. - 1948. - Vol. 21. - P. 246258. - 11. Skurnik M. // Infect. Immun. - 1985. - Vol. 47, N 1. -
P. 183-190. - І2. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 1979. - Vol. 76, N 9. - P. 4350-4354.
V.P.Bondarev, A.V.Filippov, I.V.Darmov, I.V.Zhivov, V.A.Pyatkov
The Development of an Immuno-Enzyme Monoclonal Test-System to Detect Bacillus anthracis Protective Antigen
48-th Central Research Institute of RFDefense Ministry, Kirov
The development of a highly sensitive and specific monoclonal antibody-based immuno-enzyme test system is considered from the point of view of the perspective to use it for detecting and quantitative measurement of B. anthracis protective antigen in half-way products at different stages during manufacturing the chemical anthrax vaccine. A collection of 13 stable hybrid clones has been formed, all of them being characterized as highly productive and actively growing strains.
Key words: B. anthracis, protective anthrax antigen, monoclonal antibodies, immuno-enzyme analysis
nocTynnna 17.11.06.
УДК 616.981.452:636.91
С.А.Бугоркова, Р.А.Белобородов, С.М.Дальвадянц
МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ ОРГАНОВ МОРСКИХ СВИНОК ПРИ РЕВАКЦИНАЦИИ ЖИВОЙ И ХИМИЧЕСКОЙ ЧУМНЫМИ ВАКЦИНАМИ
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Проведено сравнительное морфологическое исследование с элементами морфометрического анализа состояния органов иммунной системы и возможного развития нежелательных побочных реакций у морских свинок, связанных с ревакцинацией их препаратом химической (ХЧВ) и живой (ЖЧВ) чумными вакцинами. По результатам морфометрического исследования выявлено преимущество применения препарата ХЧВ для индукции вторичного иммунного ответа. Показана перспектива использования морфометрического принципа в морфологическом исследовании для характеристики иммуногенеза в зависимости от характера ревакцинирующего препарата, особенностей антигенного состава вакцин и схем их применения.
Ключевые слова: вакцины живые и химические, иммунокомпетентные органы, морфометрия.
Вакцинация остается перспективным и экономически выгодным направлением профилактики инфекционных заболеваний, а исследования в области вакцинопрофилактики являются приоритетными для решения задач по разработке эффективных мер противодействия биологической опасности [2, 16, 20]. Практика многолетнего применения живой вакцины для профилактики чумы позволяет считать этот препарат достаточно эффективным [10, 18, 19, 21, 22]. В то же время живая чумная вакцина (ЖЧВ) имеет ряд существенных недостатков, к которым относятся: относительная реактогенность препарата, выраженное аллергизирующее действие, снижение защитных свойств при заражении атипичными штаммами возбудителя чумы, а главное непродолжительность вызываемого ей иммунитета [3, 5, 7, 8, 13, 14].
Химические чумные вакцины (ХЧВ) имеют определенное преимущество перед живыми - это возможность их использования в качестве ревакцинирующих препаратов и одновременного применения со средствами экстренной профилактики.
В литературе есть сведения об эффективной иммунобиологической перестройке у мышей, вак-
цинированных экспериментальным образцом полу-синтетической вакцины из капсульного антигена и поли-4-винил-Ы-этилпиридина [1].
По результатам комплексного экспериментального исследования была показана высокая иммунизирующая и ревакцинирующая активность бикомпонентного препарата химической вакцины, состоящей из капсульного антигена (Ф1) и основного соматического антигена (ОСА) чумного микроба, предлагаемой для ревакцинации в экстренных эпидемиологических ситуациях [4, 5, 23].
В то же время морфологические аспекты ревакцинации, неоднократного введения вакцинирующих препаратов и развития возможных нежелательных побочных реакций организма представлены лишь в единичных публикациях [7, 12, 13, 17].
Цель данной работы заключалась в проведении сравнительного морфологического исследования с элементами морфометрического анализа состояния органов иммунной системы и возможного развития нежелательных побочных реакций у подопытных животных, связанных с ревакцинацией их препаратом ХЧВ или ЖЧВ.
