CC BY
23
DOI 10.31588/2413-4201-1883-237-1-44-47
УДК: 616.981.51.539.107
ПОЛУЧЕНИЕ КАПСУЛЬНО-ПРОТЕКТИВНОЙ ПРОТИВОСИБИРЕЯЗВЕННОЙ
СЫВОРОТКИ
*Галиуллин А.К. - д.в.н., профессор, Задорина И. И. - аспирант, Иванова С.В. - к.б.н., Мельникова Л.А. - к.в.н.
*ФГБОУ ВО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э.Баумана» ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»
Ключевые слова: возбудитель сибирской язвы, иммунная сыворотка, иммуноглобулины
Keyword: anthrax pathogen, immune serum, immunoglobulin
Важнейшей составляющей при производстве надежных и специфичных сибиреязвенных диагностикумов является гипериммунная сыворотка. Получение ее -это сложный процесс, включающий в себя изучение антигенных свойств штаммов, подбор продуцентов (животных), разработка схем иммунизации, определение дозы и кратности введения, продолжительности иммунизации. Все это позволяет получить сыворотки с достаточно высоким титром специфических антител при минимальных затратах. Начальным этапом при получении гипериммунных сывороток является изучение антигенного состава микроорганизмов. У возбудителя сибирской язвы он достаточно сложный [2]. В состав бациллы антракса входят неиммуногенный соматический полисахаридный комплекс и капсульный глутаминполипептид. Полиса-харидный антиген не создает иммунитет у животных и не определяет агрессивных функций бациллы: всегда присутствует как у вирулентных, так и у авирулентных штаммов. Капсульный антиген представлен сложным полипептидом d-глутамино-вой кислоты, его принимают за группо-специфическое вещество, так как он дает перекрестные серологические реакции с полипептидом B. subtilis, B. cereus [3, 4].
Активными антигенами также являются три компонента сибиреязвенного экзотоксина, который образуется в результате жизнедеятельности микроорганизма и выделяется в окружающую среду (токсический комплекс). Наиболее активным в иммуногенном отношении в экзотоксине
является протективный антиген [1, 5]. Таким образом, у возбудителя сибирской язвы можно выделить три вида антигенов: соматический, капсульный, протективный. При получении гипериммунных сывороток особую роль отводят отбору продуцентов и способности их организма к иммунобиологической перестройке, способам введения антигенов, схемам иммунизации. Вышеизложенное определяет актуальность работ по получению иммунных сывороток для изготовления сибиреязвенных диаг-ностикумов.
Целью работы явилось получение гипериммунной сибиреязвенной сыворотки на капсульный и протективный антигены.
Материал и методы исследований. Получение антигенов возбудителя сибирской язвы проводили с использованием штаммов 55 (ВНИИВВиМ) и 71/12. Для определения специфичности, полученной на капсульный и протективный антигены сыворотки использовали культуры штаммов B. cereus 8035 и B.subtilis 433.
В качестве продуцентов гипериммунных сывороток использовали кроликов породы «Шиншилла».
Для получения капсульного антигена штамм 71/12 засевали в специальную среду ГКИ и инкубировали в условиях анаэростата при температуре 370 С в течение 18-20 часов. Наличие капсулы возбудителя сибирской язвы, после инкубации на питательной среде, изучали путем окрашивания мазков по Граму и Михину. При выявлении капсулы среду ГКИ цен-
трифугировали при 4000 об/ми, осажденные клетки возбудителя, промывали 3-х кратно физиологическим раствором.
Отделение капсульного вещества от бактериальной клетки проводили следующим способом: полученный осадок по вышеописанному способу, растворяли в 50 мкл дистиллированной воды с добавлением 50 мкл лизирующего раствора, содержащего 10 мМ трис-буфера рН 6,8, 3% додецилсульфата натрия (БОБ) и 0,1% меркаптоэтанола на шуттель аппарате. Инактивацию возбудителя антракса осуществляли 10% раствором формалина. Затем взвесь микроорганизмов с лизирую-щим раствором центрифугировали при 4000 об/мин, а липополисахаридный комплекс в супернатанте, осаждали сульфатом аммония при комнатной температуре с последующим промыванием осадка 3-х кратно физиологическим раствором.
Протективный антиген экзотоксина возбудителя сибирской язвы, культивированной на бикарбонатной среде 199, получали путем фильтрации через бактериальные свечи. Антиген так же осаждали сульфатом аммония при комнатной температуре в течение 18 часов и промывали 3 -х кратно.
Полученные вышеописанными способами антигены растворяли в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ) рН 7,2, каждую в отдельности и диализировали в течение 48 часов против дистиллированной воды для удаления избыточного содержания ионов КН+4. Антигены расфасовывали в ампулы и использовали по необходимости.
Для гипериммунизации кроликов испытали три схемы введения отличающихся друг от друга кратностью, концентрацией и местом введения капсульного и протективного антигена.
Первая схема. Иммунизацию кроликов проводили пятикратным введением протективного и капсульного антигена. Первая инъекция в дозе 100 мкг/мл про-тективного антигена в сочетании с полным адъювантом Фрейнда, внутрикожно вдоль позвоночного столба в пять точек с каждой стороны; вторая инъекция - 100 мкг/мл капсульного антигена в сочетании с не-
полным адъювантом Фрейнда, внутри-кожно; третья и четвертая инъекции - аналогичны второй по 300-400 мкг/мл соответственно, каждого антигена с левой и с правой стороны позвоночного столба; пятая инъекция - протективного и капсуль-ного антигена по 500 мкг/мл, внутривенно. Интервал между инъекциями 7-10 дней.
Вторая схема. Включала три внутривенных инъекции с интервалом 6-7 дней, каждого антигена в левую и правую ушную вену. Концентрация антигена - 500 мкг/мл, при каждом введении.
Третья схема. Осуществляли одну внутривенную инъекцию капсульного антигена в дозе 500 мкг/мл и одновременно внутримышечное введение в той же концентрации протективного антигена.
Титры антител сыворотки крови определяли в ИФА на 14, 21 и 30 сутки после последнего введения. Постановку реакции осуществляли в непрямой модификации ИФА. Для иммобилизации антигена использовали твердую фазу иммунологических планшет производства ВНИИ «Медтехника» (г. Москва). Растворение антигена белковой природы (протектив-ного) и сенсибилизацию планшет проводили КББ рН 9,25±0,25, тогда как для ли-пополисахаридного антигена (капсуль-ного) использовали ФСБ с добавлением 0,5мл детергента - твин 20. В качестве антивидовых антител, меченных ферментом, использовали коммерческий препарат -иммуноглобулины диагностические О (И-Ь) кролика, меченные пероксидазой производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалея. Для выявления активности фермента в иммунной системе «антиген-антитело» применяли орто-финилендиаминовый субстрат. Реакцию останавливали раствором серной кислоты в концентрации 0,5 моль/л.
С помощью дозатора пипеточного в лунки планшета вносили раствор антигена по 200 мкл при концентрации белка 10 мкг/мл. Адсорбцию антигена на планшете проводили в течение 2-х часов при температуре (37±1)°С. Затем раствор из лунок удаляли, и трехкратно промывали каждую лунку, используя ФСБ-Т. В лунки А-1, В-1 вносили по 200 мкл контрольную положи-
тельную сыворотку в рабочем разведении, в лунки С-1,Б-1 - контрольную отрицательную сыворотку в рабочем разведении, а в остальные лунки планшета по 200мкл исследуемых сывороток также в рабочем разведении в ФСБ-Т. Лунки Е-1, Б-1, О-1, И-1 оставляли пустыми. Выдерживали при температуре (37±1)°С в течение 1 часа и также раствор удаляли и отмывали планшет как указано выше. В каждую лунку планшета вносили по 200мкл антивидовых антител меченных пероксидазой хрена в рабочем разведении, кроме лунок О-1, И-1 и выдерживали в термостате при температуре (37±1)°С. Планшет промывали трехкратно и в каждую лунку вносили по
Как видно из данных, приведенных в таблице, наибольший титр антител сывороток крови достигается по первой схеме, причем активность иммунной сыворотки на протективный антиген превышал в два и более раза (1:8192) по сравнению с сывороткой на капсульный антиген (1:1024).
Поэтому данную схему гипериммунизации кроликов в дальнейшем
Как видно из таблицы 2, титры антител сыворотки крови кроликов на сибиреязвенные антигены (шт. 71/12 и 55 (ВНИИВВиМ) составили 1:4096 и 1:8192
150мкл субстратной смеси. Выдерживали при комнатной температуре в течение 25 минут в темном месте. Реакцию останавливали внесением во все лунки планшета по 50мкл останавливающего раствора.
Результаты исследований. Применение капсульного и протективного антигенов, полученных из штаммов 55 (ВНИИВВиМ) и 71/12 возбудителя сибирской язвы по первой схеме иммунизации животных позволило получить активную капсульно-протективную иммунную сибиреязвенную сыворотку. Результаты определения активности гипериммунных сывороток крови кроликов, представлены в таблице 1.
взяли за основную при получении диагностических препаратов. Специфичность иммуноглобулинов сыворотки крови кроликов, испытали в непрямом варианте ИФА с антигенами из штаммов Б.еегеш 8035 и Б^иЬ^Ь 433.
Результаты изучения специфической активности гиперим-мунной сыворотки представлены в таблице 2.
соответственно. При этом перекрестная реакция с аэробными почвенными сапрофитами сохранились в низких титрах. На основании полученных резуль-
Таблица 1 - Активность гипериммунных сывороток
Антиген Схема иммунизации кроликов Титр антител в ИФА, сутки
14 21 30
Протективный 1 1:1024 1:2048 1:8192
2 1:256 1:512 1:1024
3 1:128 1:256 1:512
Капсульный 1 1:128 1:512 1:1024
2 1:64 1:128 1:250
3 1:32 1:64 1:128
Таблица 2 - Специфическая активность капсульно-протективной иммунной сибиреязвенной сыворотки крови кроликов в ^ ИФА_
Антигены Титр антител
Шт.71/12 1:4096
Шт.55 (ВНИИВВиМ) 1:8192
Шт. 8035 1;64
Шт.433 1:8
татов можно заключить, что выбранный нами метод гипериммунизации кроликов протективным и капсульным антигенами позволяет получить высокоактивную иммунную сыворотку.
Заключение. Таким образом, разработанный способ гипериммунизации кроликов капсульным и протективным антигенами возбудителя сибирской язвы, позволил получить активную и специфичную сыворотку.
Поэтому схему пятикратного введения (первая) с применением вышеназванных антигенов можно использовать для получения бивалентной гипериммунной сибиреязвенной сыворотки, на основе которой возможно изготовление иммуннобиологических препаратов.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Абалакин, В.А. Роль факторов токсина Bac. Antracis в диагностике сибирской язвы / В.А. Абалакин, Л.В. Сергеева //
Тез. докл. II Всес. конф. «Бактериальные токсины».- Юрмала. - 1989. - С.4.
2. Галиуллин, А.К. Субъединичный сибиреязвенный антиген и его диагностическое значение / А.К. Галиуллин, В.П. Коксин, А.М. Алимов, К.М. Салмаков // Ветеринария. - 1996. - №1. - С.23-25.
3. Коксин, В.П. Получение высокоспецифических антигенов и их иммунохи-мическая характеристика / В.П. Коксин,
A.К. Галиуллин, Н.И. Табакова, А.М. Алимов // Научные основы технологии промышленного производства вет. биологических препаратов. - 1996. - С. 141.
4.Фаизов, Т.Х. Геноидентификация
B. antracis и почвенных сапрофитов методом ПЦР / Т.Х. Фаизов, А.К. Галиуллин, А.М. Алимов // Ветеринария. - 1995. - №5. - С.8-12.
5. Fish, D. In vivo - produced anthrax toxin / D. Fish, R. Lincoln // J. Bacteriol .1968. - V.95. - №3. - P. 919-924.
ПОЛУЧЕНИЕ КАПСУЛЬНО-ПРОТЕКТИВНОЙ ПРОТИВОСИБИРЕЯЗВЕННОЙ
СЫВОРОТКИ
Галиуллин А.К., Задорина И. И., Иванова С.В., Мельникова Л.А.
Резюме
В статье представлены результаты получения капсульно-протективной гипериммунной сибиреязвенной сыворотки, которая изготовлена с использованием антигенов из штаммов 55 (ВНИИВВиМ) (протективный) и 71/12 (капсульный). Испытаны три схемы гипериммунизации кроликов. По результатам исследований, наиболее активная с титром антител 1:8192 и специфичная, дающая положительную реакцию с гетерологичными антигенами в минимальных титрах (B. cereus 8035 1:64, B.subtilis 433 - 1:8), получена сыворотка по первой схеме иммунизации (пятикратное введение). Поэтому данную схему можно рекомендовать для получения бивалентной гипериммунной сибиреязвенной сыворотки для изготовления иммуннобиологических препаратов.
PRODUCTION OF ANLI SIBERIAN PLAGUE SERUM
Galiullin A.K., Zadorina I.I., Ivanova C.V., Melnicova L.A.
Summary
The method for producing immunoglobulins to the anthrax pathogen has been developed. Capsule and protective antigens were used as an antigen to obtain rabbit hyperimmune serum. Immunization of rabbits was performed by five times introduction of antigens along the spinal column, intradermally. The proposed method of rabbits hyperimmunization ensured high activity and specificity of immunoglobulins to the anthrax pathogen.
