CC BY
47
УДК 619: 615.41:616.981.553
ПОЛУЧЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ БОТУЛИНИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ
Красовская Ю.В. - к.в.н., доцент; Галиуллин А.К. - д.в.н., профессор, зав. кафедрой; Волков А.Х. - д.в.н., профессор, зав. кафедрой; Юсупова Р.Х. - к.в.н. Казанская государственная академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана
тел.: (843) 273-97-34
Ключевые слова: возбудитель ботулизма, токсин ботулизма, гипериммунная ботулиническая сыворотка.
Key words: causative agent of botulism, botulism toxin, hyperimmune botulinichesky serum.
Возбудитель ботулизма относится к политропным представителям микробов, которые в ходе инфекционного процесса занимают ряд последовательных локализаций в организме, тем самым, обнаруживая свою адаптированность к различным органам и тканям. Однако это есть единая форма болезни, в которой разные локализации возбудителя соответствуют разным стадиям болезни (кишечник, печень, почки, легкие, нервная система).
Токсин ботулизма, попадая в кишечник животного, всасывается в кровь и разносится по всему организму. Вследствие разрушения нервных центров
продолговатого мозга развиваются параличи глотки, жевательных мышц и языка. Токсин подавляет выделение ацетилхолина, а это ведет к расслаблению скелетных мышц, нарушению движения, к параличам дыхательных и сердечных мышц, асфиксии и смерти животных. К. И. Матвеев (1957) отмечает, что люди наиболее восприимчивы к ботулиническим ядам типов A и C , лошади- B , крупный рогатый скот- и "С', овцы-
££ А " ££/"1?? _ ££/"1??
A и C , птицы к типу C .
Основу лабораторной диагностики ботулинического токсина или возбудителя является исследование остатков пищевых продуктов, каловых масс, из трупов берут кусочки печени, тонкого кишечника и желудка с содержимым; биопроба на белых мышах. В качестве экспресс методов лабораторной диагностики определяют фагоцитарный показатель и ставят РНГА с эритроцитами, сенсибилизированными антитоксическими сыворотками или реакции нейтрализации (РН)
ботулинического токсина на белых мышах. Однако, при вскрытии животных, павших
от колбасного яда, точно поставить диагноз не всегда удается, ведь концентрация яда в крови ничтожна, и выявить токсин с обычными реакциями (РНГА, РН) не всегда получается.
Все вышесказанное и обуславливает изыскания новых диагностических препаратов на основе специфических антител.
Целью исследований является разработка способа получения
гипериммунной ботулинической сыворотки для конструирования
высокочувствительных тест-систем для экспресс-индикации возбудителя ботулизма и его токсина в продуктах животноводства.
Материалы и методы. Исследования проводили на кафедре микробиологии и вирусологии ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины» и в лаборатории по хранению и изучению штаммов возбудителей особо опасных болезней животных ФГУ «Федерального центра токсикологической и радиационной безопасности животных -ВНИВИ», (г.Казань).
В ходе работы были использованы следующие материалы:
1. Инактивированная вакцина против ботулизма норок, изготовленная Армавирской биофабрикой.
2. Питательные среды: мясопептонный агар (МПА); мясопептонный агар с добавлением 1% глюкозы; глюкозо-кровяной агар Цесслера; среда Китта-Тароцци; среда Китта-Тароцци с добавлением 1% глюкозы; бульон Хоттингера под вазелиновым маслом; среды Гисса; обезжиренное молоко.
3. Оборудование: термостат; анаэростат; центрифуги; холодильные установки; люминесцирующий микроскоп МЛ-3; весы аналитические с разновесами типа АДС-200;
спектрофотометр СФ-46; магнитная мешалка; водяная баня.
4 ._Реактивы: в различных
микробиологических и иммунологических исследованиях применялись стандартные растворы, необходимые химические реактивы, сыворотки, метаболиты и коммерческие анатоксические
противоботулинические поливалентные и моновалентные сыворотки (А,В,С,Д,Е).
5. Подопытные животные: кролики породы «Шиншилла», «Серый великан» 12-18 месячного возраста, живой массой 2,5-3,5 кг -10 гол. белые мыши живой массой 18-20 г -50гол.
Антигенные свойства вакцинной культуры С1.Ьо1иПпиш изучали в ИФА с использованием иммуноглобулинов против иммуноглобулинов кролика, меченных пероксидазой хрена, изготовленных НПО НИИ им.Н.Ф.Гамалея и коммерческие анатоксические противоботулинические поливалентные и моновалентные сыворотки (А,В,С,Д,Е).
Стерильность, полученных
гипериммунных сывороток проверяли посевом на сахарный МПА. Посевы со всеми средами выдерживали в анаэростате при температуре (35 ± 2оС) в течение 15 суток. Питательные среды с посевами должны оставаться стерильными.
Активность гипериммунных
сывороток определяли в прямом варианте ИФА, все реакции сопровождались контролем качества компонентов:
1. С заведомо известным антигеном. Этот контроль проверяет правильность выбора рабочего титра иммунопероксидазного контроля. Контроль должен быть положительным;
2. Контроль неспецифической сорбции конъюгата. В лунку сначала вносят рабочее разведение конъюгата, затем после соответствующей промывки рабочий раствор субстрата. Контроль должен быть отрицательным;
3. Контроль субстрата. В лунку вносят только рабочий раствор субстрата. Содержимое лунки должно оставаться без изменения.
Результаты собственных
исследований. Каждый из семи сероваров возбудителя ботулизма обладает токсином, имеющим только ему присущую антигенную структуру. Возбудители
ботулизма имеют жгутиковый Н- и соматический О-антигены. Соматический антиген является групповым, общим для протеолитических штаммов возбудителя ботулизма сероваров А, В, С, а Н-антиген типоспецифичен. Поэтому для получения специфических сывороток против возбудителя ботулизма использовали соматический антиген вакцинного штамма возбудителя ботулизма норок. В работе также были использованы коммерческие лошадиные сухие диагностические противоботулинические сыворотки типов А, В и Е, а также анатоксины типов А, В и Е. Сыворотки растворяли до конечной активности 100 МЕ/мл и хранили в водном растворе глицерина (1:1) при температуре -20°С. Анатоксины и токсины хранили при температуре +4°С.
Для гипериммунизации кроликов испытали три схемы введения отличающихся друг от друга кратностью, концентрацией и местом введения белкового антигена.
Первая_схема. Иммунизацию
кроликов проводили пятикратным введением антигена в дозе 200 мкг/мл в сочетании с полным адъювантом Фрейнда, внутрикожно вдоль позвоночного столба в пять точек с каждой стороны; вторая инъекция - 250 мкг/мл антигена в сочетании с неполным адъювантом Фрейнда, внутрикожно; третья и четвертая инъекции - аналогичны второй по 300-400 мкг/мл соответственно; пятая инъекция -500 мкг/мл, внутривенно. Интервал между инъекциями 7-10 дней.
Вторая схема. Включала три внутривенных инъекции с интервалом 6-7 дней. Концентрация антигена - 500 мкг/мл, при каждом введении.
Третья схема. Осуществляли одну внутривенную инъекцию антигена в дозе 500 мкг/мл и одновременно внутримышечное введение в той же концентрации.
Титры антител сыворотки крови измеряли в ИФА. Постановку реакции осуществляли в непрямой модификации ИФА. Для иммобилизации антигена использовали твердую фазу
иммунологических планшет производства ВНИИ «Медтехника» (г. Москва). Растворение антигена белковой природы и сенсибилизацию планшет проводили КББ
рН 9,25±0,25, тогда как для липополисахаридного антигена
использовали ФСБ с добавлением 0,5мл детергента - твин 20. В качестве антивидовых антител, меченных
ферментом, использовали коммерческий препарат - иммуноглобулины
диагностические ^ G ^-Ь) кролика, меченные пероксидазой производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалея. Для выявления активности фермента в иммунной системе «антиген-антитело» применяли орто-финилендиаминовый субстрат. Реакцию останавливали раствором серной кислоты в концентрации 0,5 моль/л.
С помощью дозатора пипеточного в лунки планшета вносили раствор антигена по 200 мкл при концентрации белка 10 мкг/мл. Адсорбцию антигена на планшете проводили в течение 2 часов при температуре (37±1)°С. Затем раствор из лунок удаляли, и трехкратно промывали каждую лунку, используя ФСБ-Т. В лунки А-1, В-1 вносили по 200 мкл контрольную
Как видно из данных, приведенных в таблице, наибольший титр антител сывороток крови достигается по первой схеме. Поэтому данную схему гипериммунизации кроликов в дальнейшем использовали для получения
диагностических препаратов.
Глобулиновую фракцию из сыворотки получали путем высаливания сернокислым аммонием. Отмеренный объем сыворотки помещали в химический стакан на магнитном смесителе, в ледяной бане при температуре +4°С. После остановки смесителя добавляли в сыворотку пипеткой насыщенный раствор сернокислого аммония в объеме, равном половине объема сыворотки (насыщенный раствор сернокислого аммония содержит 542г соли в 1л дистиллированной воды). После перемешивания в течение 20минут, центрифугировали при 10 000об/мин.
положительную сыворотку в рабочем разведении, в лунки С-1^-1 - контрольную отрицательную сыворотку в рабочем разведении, а в остальные лунки планшета по 200мкл исследуемых сывороток также в рабочем разведении в ФСБ-Т. Лунки Е-1, F-1, G-1, №1 оставляли пустыми. Выдерживали при температуре (37±1)°С в течение 1 часа и также раствор удаляли и отмывали планшет как указано выше. В каждую лунку планшета вносили по 200мкл антивидовых антител меченных
пероксидазой хрена в рабочем разведении, кроме лунок G-1, №1 и выдерживали в термостате при температуре (37±1)°С. Планшет промывали трехкратно и в каждую лунку вносили по 150мкл субстратной смеси. Выдерживали при комнатной температуре в течение 25 минут в темном месте. Реакцию останавливали внесением во все лунки планшета по 50мкл останавливающего раствора. Результаты определения активности сывороток представлены в таблице.
Жидкость над осадком удаляли, а полученный осадок растворяли в 0,15М растворе хлористого натрия.
Диализационную жидкость в первый день меняли каждые четыре часа, в следующие три - четыре дня - один раз в день до полного исчезновения сернокислого аммония.
Окончание диализа определяли с помощью 10% раствора хлористого бария. В одну пробирку наливали 5мл диализата, в другую 5мл раствора сернокислого аммония в разведении 1:300 000 (контроль). В обе пробирки добавляли по несколько капель 10% раствора хлористого бария. Если исследуемый диализат мутнеет не более, чем контрольный раствор, то диализат считали законченным.
Очистку и разведение белков глобулиновой фракции проводили на хроматографической колонке с ДЭАЭ -
Таблица 1 -Специфическая активность гипериммунных сывороток
Антиген Схема иммунизации Титр антител в ИФА
кроликов
Соматический 1 1:2048
2 1:1024
3 1:512
целлюлозой. Для этого 50г ДЭАЭ целлюлозы растворяли в 1л
дистиллированной воды, непрерывно помешивая. Оставляли на 45минут и удаляли желтоватый отстой жидкости над целлюлозой. Растворяли целлюлозу в 1л 1Н NaOH. Через 30минут удаляли жидкость и растворяли целлюлозу в 1л 1Н соляной кислоты. Оставляли на 30минут, в течение этого времени целлюлоза подвергалась осветлению. Удаляли отстой и растворяли целлюлозу в 1л 1Н NaOH. Спустя 30минут пропускали целлюлозу через воронку Бюхнера, заполненную фильтровальной бумагой, и промывали 10л
дистиллированной воды. После доведения рН 7,2, ее заливали 500мл 0,01М фосфатного буфера рН 7,2.
Заполняли целлюлозой колонку диаметром 2,5см. Наполнение проводили постепенно и точно до высоты 40см. Затем доводили рН вытекающего из колонки
стартового буфера до рН 7,2. Пипеткой добавляли в колонку очень осторожно 10мл иммуноглобулинов, предварительно за ночь диализированной стартовым буфером. Промывание начинали 0,01М фосфатным буфером рН 7,2 и продолжали его промывать порциями этим же буфером с возрастающей молярностью и
уменьшающимся рН. Вытекающие фракции собирали в пробирки коллектора фракций -по 10мл каждой фракции. Белок определяли спектрометрически при длине волны 280нм, по формуле:
разведение х 280 и деленное на 1,35
Содержание белка в
иммуноглобулине составило - 25мг/мл.
Активность иммуноглобулинов,
выделенных из сыворотки, испытали в непрямом варианте ИФА. Результаты изучения активности иммуноглобулинов представлены в таблице 2.
Таблица 2- Активность противоботулинических иммуноглобулинов сывороток крови кроликов
в ИФА
Антигены Титр антител
Гипериммунные сыворотки Иммуноглобулины
Соматический 1:2048 1:4096
На основании полученных
результатов можно заключить, что выбранный нами метод выделения и очистки иммуноглобулинов в
ионообменной хроматографии на колонке ДЭАЭ - целлюлозой не снижает активность.
ЛИТЕРАТУРА.
1.Бакулов, И.А. Эпизоотология с микробиологией / И.А. Бакулов, Е.И. Буткин, В.А, Ведерников, Г.Г. Юрков. - М.: Агропромиздат, 1987. - С. 122 - 125.
2.Баяр, Г.И. Реакция непрямой гемагглютинации как метод экспресс -индикации в объектах внешней среды / Г.И. Баяр, Р.Е. Конникова // ВПБЗН, 1966. -Вып. 10. - С. 175-180.
3. Матвеев, К.И., Вспышка ботулизма у норок / К.И. Матвеев, Т.И. Булатова,
Т.И.Сергеева // Ветеринария. - 1957. № 10. - С. 53.
4.Маркунина Ю.В. Получение флуоресцирующей ботулинической сыворотки/ Галиуллин А.К., Волков А.Х.// Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инф. болезней. Мат. Международного симпозиума 28-30 ноября. Казань, 2005. -ч.2. -С. 220-222.
5.Маркунина Ю.В. Индикация ботулинического токсина в продуктах животноводства/ Галиуллин А.К.,Волков А.Х.,Мустафина Э.Н.// Ученые записки Казанской Гос.академии вет.мед.[текст]: научный журнал // 2008.-т.191.-С.139-145.
