CC BY
31
УДК 356.102:495.133
Вестник СПбГУ. Сер. 3,2004, вып. 3
Т. Г. Шапошникова, М. П. Самойлович, О. И. Подгорная
ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ МЕЗОГЛЕАЛЬНЫХ И ЭПИДЕРМАЛЬНЫХ КЛЕТОК И КОМПОНЕНТОВ МЕЗОГЛЕИ МЕДУЗЫ AURELIA AURITA*
Введение. Кишечнополостные - двухслойные животные, между эпидермой и гастро-дермой которых расположена прослойка межклеточного вещества, называемая мезоглеей [2, 10]. Мезоглея выполняет скелетную и транспортную функции и, возможно, является резервом питательных веществ [11]. По своему составу матрикс мезоглеи сходен с матрик-сами рыхлых соединительных тканей других животных. В его составе обнаружен фибриллярный коллаген [9, 12, 13, 15, 18], выявлены ламинин и фибронектин - белки, входящие в состав базальных мембран многих животных [17]. У ряда представителей кишечнополостных мезоглея заселена мезоглеальными клетками [3, 10] и приобретает внешнее сходство с соединительными тканями других животных.
Морфологический и гистохимический анализ показал, что у медуз мезоглеальные клетки имеют хорошо развитый белоксинтетический аппарат, накапливают в своей цитоплазме белковые гранулы и выводят их путем экзоцитоза в окружающий матрикс мезоглеи [5]. Материал специфических гранул содержит катионные белки или гликопротеины с высоким содержанием лизина, цистеина и дисульфидных связей [б]. Основное вещество и анизотропные (коллагеновые) волокна окрашиваются практически одинаково. Эластические волокна А. aurita содержат нейтральные гликопротеины, белковый компонент которых имеет катионные свойства за счет высокого содержания лизина. Концентрация цистеина в этих волокнах также высока [6]. Электрофоретический анализ выявил в мезоглее зрелых медуз несколько мажорных белковых зон. Антитела против белков фракции 45/47 кДа выявляют антигены в гранулах мезоглеальных клеток, в эпидермальных клетках и в эластических волокнах мезоглеи зрелых медуз [8J. На основании этих данных было высказано предположение о том, что функции мезоглеальных клеток связаны с формированием межклеточного матрикса мезоглеи [4, 5, 7, 8]. Для проверки данной гипотезы одним из необходимых инструментов могут стать поликлонапьные антитела против компонентов внеклеточного матрикса (мезоглеи), а также эпидермальных и мезоглеальных клеток.
Материалы и методы. Сбор животных и их содержание в лаборатории. Медуз Aurelia aurita отлавливали на акватории Керетского архипелага в Чупинской губе Кандалакшского залива Белого моря и содержали в ваннах с ежесуточно сменяемой морской водой, 2 раза в сутки их обильно кормили свежим планктоном. Животных содержали в изотермической комнате при 10°С. Часть экспериментальной работы выполнена на Морской биологической станции Санкт-Петербургского университета (о-в Средний) и беломорской биологической станции ЗИН РАН (Картеш).
Получение изолированных мезоглеальных и эпидермальных клеток и образцов мезоглеи. Изолированные мезоглеальные клетки получали из растущих медуз с диаметром зонтика 15-20 см. У животных вырезали кусочки мезоглеи, используя бинокулярную лупу очищали ее от эпидермального и гастродермального эпителиев. Очищенную мезоглею измельчали и смешивали с раствором коллагеназы из Clostridium histolyticum, (тип II, Sigma,
* Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 02-04-49420 и № 02-04-49120)
© Т. Г. Шапошникова, М. П. Самойлович, О. И. Подгорная, 2004
G-6885) в фильтрованной морской воде в соотношении 1:1 (конечная концентрация колла-геназы 1 мг/мл). Через 2-3 часа инкубации при комнатной температуре полученную суспензию центрифугировали, клеточный осадок дважды промывали в большом объеме фильтрованной морской воды. Жизнеспособность клеток после выделения оценивали под фазово-контрастным микроскопом. Кусочки вырезанной эктодермы также подвергали действию коллагеназы, чтобы избавиться от остатков прилежащей к ней мезоглеи. Чистоту образцов контролировали под бинокулярной лупой и фазово-контрастным микроскопом. Образцы очищенной мезоглеи получали из зрелых медуз с диаметром зонтика более 20 см.
Электрофоретическое разделение белков. Белковый состав мезоглеи и изолированных мезоглеальных и эпидермальных клеток медузы определяли с помощью SDS-электро-фореза в 12%-ном полиакриламидном геле [14], который окрашивали Кумасси бриллиантовым синим G-250.
Получение политональных антител. Против мажорного белка 45/47 кДа из мезоглеи медузы A. aurita получали поликлональную антисыворотку RA45/47. Процедура иммунизации заключалась в следующем: гомогенаты мезоглеальных и эпидермальных клеток и образцов мезоглеи смешивали с адъювантом Фрейнда (1:1); смеси инъецировали подкожно мышам линии Balb. Повторную инъекцию такой же смесью проводили через 2 недели внутрибрюшинно. Неделю спустя брали кровь из окологйазного синуса. Сыворотку разделяли на порции по 50 мкл и хранили при -20 °С. Образец неиммунной сыворотки получали от интактных животных. ■
Иммуноблоттинг. Полусухой перенос белков на нитроцеллюлозу проводили в электродном буфере Лэммли с 20% метанола [19]. Блоты отмывали в PBS, содержащем 0,05 % Tween 20 (PBS-Tw). Далее проводили инактивацию сайтов неспецифического связывания нитроцеллюлозы 3 %-ным бычьим сывороточным альбумином или казеином в течение 1 ч, затем блоты инкубировали в растворе антисыворотки (рабочее разведение 1:1000 иди 1:2000) в течение 1 ч, отмывали PBS-Tw 4 раза по 15 мин, инкубировали со вторыми антителами (GAR, конъюгированные со щелочной фосфатазой) и окрашивали BCIP-NBT. Все операции проводили во влажной камере при комнатной температуре.
Иммуногистохимия. Для иммуногистохимического исследования материал фиксировали в фиксаторе Буэна. Затем материал заливали в парафин и изготавливали срезы толщиной 5-7 мкм. После обеспарафинивания срёзы промывали в PBS-Tw и проводили непрямое иммуногистохимическое окрашивание по схеме, аналогичной приведенной выше для окраски блотов. Срезы исследовали в световом микроскопе NU-2. В качестве контроля срезы обрабатывали неиммунной сывороткой.
Результаты исследований. При выделении, мезоглеальных клеток из мезоглеи A. aurita с помощью коллагеназы клетки остаются живыми, образуют псевдоподии, прикрепляются к стеклу. В клетках сохраняются специфические гранулы. Электрофоретический анализ показывает присутствие большого количества белков в составе как клеток мезоглеи, так и эпидермальных клеток. Причем часть белков в обоих типах клеток сходны по молекулярным массам, но есть и различия в белковом составе между двумя популяциями клеток. Результаты электрофоретического анализа белкового состава мезоглеи зрелых медуз показывают наличие в ней ряда мажорных белков, описанных ранее.
Нами были получены следующие поликлональные мышиные антитела: против компонентов мезоглеальных клеток - МАтс; против компонентов клеток эпидермиса эксумбреллы - MAect; против компонентов мезоглеи - MAmes. Полученные антитела были протестированы на иммуноблоте. Мы проверяли взаимодействие этих антител с белками,, входящими в состав эпидермальных и мезоглеальных клеток и в состав межклеточного вещества мезоглеи.
с: 80
МАшеБ: данные антитела с высокой степенью специфичности взаимодействуют с белком 47 кДа и очень слабо с белками около 30 кДа в мезоглее, более слабое, но также достаточно специфическое взаимодействие выявляется с белками мезоглеальных и эпидермаль-ных клеток, молекулярная масса которых составляет около 120, 85 и 75 кДа (рисунок, II).
SDS-электрофорез (I) и иммуноблот (II, III, IV, V) клеток эпидермы (1), мезоглеи (2) и мезоглеальных клеток (3) медузы А. aurita (d=25 см) с антителами:
II - MAmes, III - MAect, IV - MAmc, V - RA45/47 (все антитела использовались в разведении 1:1000).
MAecti в препарате мезоглеи наблюдается слабое взаимодействие этих антител с белками молекулярной массой около 30 кДа, а также с белком более 300 кДа. Наиболее слабо данные антитела взаимодействуют с белками 45/47 кДа. Среди белков мезоглеальных клеток с антителами взаимодействуют белки с молекулярной массой около 75, 85, 120 и 300 кДа, более слабое взаимодействие отмечается с белком 88 кДа. В препарате, клеток эктодермы антитела также взаимодействуют с белками 50, 75, 80, 85, 88, 120/125 и 300 кДа (рисунок, III).
MAmc: антитела против мезоглеальных клеток в препарате мезоглеальных клеток активно взаимодействуют с белками 60, 75, 85, 88, 115 и 120 кДа и менее активно с белками в области между 88 и 115 кДа, довольно слабое взаимодействие можно отметить с некоторыми белками спектра в области ниже 50 и выше 200 кДа (рисунок, IV, 3). В препарате клеток эктодермы эти антитела также активно взаимодействуют с белками 60, 75, 85 кДа, с максимальной степенью аффинности происходит связывание с белком 115 кДа, менее активно - с белками в диапазоне 88-115 кДа. Среди компонентов мезоглеи среднюю степень взаимодействия с данными антителами проявляют белки 45/47 кДа и 115 кДа, более слабо взаимодействует белковая полоса в области 30 кДа (см. рисунок, IV).
В качестве дополнительного контроля использовались также полученные ранее антитела RA45/47 против мажорного белка мезоглеи с молекулярной массой 45-47 кДа (рисунок, V). В препарате мезоглеи эти антитела взаимодействуют с белком 45/47 кДа, а также с
I II III IV V
1 23 123 123 123 123
белком 30 кДа, в мезоглеальных и эпидермальных клетках происходит взаимодействие антител с белками 75, 85 и 120 кДа. "
Обсуждение результатов. Результаты электрофоретического анализа белкового состава клеток двух популяций вкупе с микроскопическими наблюдениями свидетельствуют о том, что после очистки клеток от компонентов мезоглеи с помощью мягкой обработки коллагеназой клетки остаются неповрежденными. Это делает их пригодными для получения антител и использования при тестировании полученных антител в иммуноблоте. Клетки обеих. популяций содержат значительное количество хорошо разделяющихся в условиях SDS-электрофореза белков. В мезоглее выявляются описанные ранее мажорные белки [8].
Как МАшс, так и MAect взаимодействуют с несколькими клеточными белками в клетках каждой популяции - это белки с молекулярными массами 75, 85 и 120 кДа, МАшс выявляют также белки 60 и 115 кДа, a MAect - белок с молекулярной массой около 300 кДа. При этом все перечисленные белки присутствуют в обеих группах клеток. В мезоглее эти антитела с низкой степенью аффинности связывают белки 45/47 и 115 кДа (МАшс), 30 и около 350 кДа (MAect).
Морфологические наблюдения показали [5], что мезоглеальные клетки зрелых медуз содержат мало специфических гранул, а электрофоретическая картина свидетельствует о том, что у половозрелых медуз клеточные белки в препарате мезоглеи практически не выявляются [8]. По-видимому, масса белков популяции мезоглеальных клеток значительно меньше белковой массы внеклеточного матрикса на поздних стадиях развития медузы. Так как для получения MAmes была использована мезоглея зрелых медуз, мы полагаем, что основными антигенами служили компоненты внеклеточного матрикса. Антитела MAmes с высокой степенью специфичности и аффинности взаимодействуют с белком 47 кДа в составе мезоглеи. Таким образом, поликлональные антитела, полученные против цельной мезоглеи, оказались специфичными всего лишь к одному ее компоненту. С меньшей степенью аффинности эти антитела взаимодействуют с белками 75, 85 и 120 кДа в составе мезоглеальных и эктодермальных клеток.
Белки 75, 85 и 120 кДа выявляются в мезоглеальных и эпидермальных клетках всеми полученными антителами. Это может быть связано с тем, что эти белки являются предшественниками мезоглеального белка 47 кДа, синтезируемого как клетками эпидермы, так и мезоглеальными клетками. Ситуация, когда компонент экстраклеточного матрикса синтезируется в виде высокомолекулярного предшественника, который затем подвергается модификации в процессе экскреции ,и включения его в ВКМ, встречается достаточно часто. Например, при синтезе эластина позвоночных вначале синтезируется молекула тропоэла-стина- предшественник большего молекулярного веса [16]. Сходная ситуация наблюдается и для коллагена [1,12].
Белки с молекулярным весом 75 и 85 кДа, а также белок 120 кДа выявляются в мезоле-альных клетках и при обработке антителами RA45/47, полученными против мезоглеального белка 45-47 кДа [8]. Все эти данные свидетельствуют в пользу того, что мезоглеальные клетки могут синтезировать предшественники компонентов внеклеточного матрикса мезоглеи у медуз.
Статья рекомендована проф. А. Д. Харазовой. Summary
Shaposhnikova Т. G., Samoilovich М. P., Podgornaya О. /^Production and characterization of polyclonal antibodies against rnesogleal and epidermal cells and mesoglea components of jellyfish Aurelia aurita.
. Polyclonal antibodies against rnesogleal components (MAmes), exumbretla epidermal cells (MAect) and rnesogleal cells (MAmc) were raised. Both MAmc and MAect react with proteins 75, 85 and 120 kDa from rnesogleal and epidermal cells on immunoblot. MAmes react with protein 47 kDa from mesoglea with high affinity and specificity and also with proteins 75, 85 and 120 kDa from rnesogleal and epidermal cells with less degree of affinity. We are hypothesizing
that these proteins might be the precursors of 47 kDa mesogleal protein and are synthesized both by epidermal and meso-gleal ceils.
Литература
1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М, Роберте К., УотсонДж. Молекулярная биология клетки. Т. 2. М, 1994. 2. Догель В. А. Зоология беспозвоночных. М., 1981. 3. ЗаварзинА. А. Очерки эволюционной гистологии крови и соединительной ткани. М., 1945. 4. Напара Т. О., Оскольский А. А., Чага О. Ю. Мезоглеальные клетки сцифоидной медузы Aurelia aurila. I. Морфология клеток и матрикса мезоглеи // Цитология. 1994. Т. 36, № 7. С. 6-16. 5. Напара Т. О. Исследование клеток и вещества мезоглеи на разных стадиях жизненного цикла Aurelia aurita (Cnidaria: Scyphozoa): Канд. дис. СПб., 1995. 115 с. 6. Напара Т. О., Оскольский А. А., Чага О. Ю. Мезоглеальные клетки сцифоидной медузы Aurelia aurita. II. Ультраструюурный и цитохимический анализ И Цитология. 1996а. Т. 38, №4/5. С. 456-464. 7. Напара Т. О., Оскольский А. А., Шапошникова Т. Г., Чага О. Ю. Мезоглеальные клетки сцифоидной медузы Aurelia aurita. III. Авторадиографический анализ процессов синтеза экстраклеточного матрикса мезоглеи // Цитология. 19966. Т. 38, №4/5. С. 465-474. 8. Шапошникова Т. Г., Напара Т. О., Подгорная О. И. Белковый состав мезоглеи и мезоглеальных клеток медузы Aurelia aurita II Цитология. 2002. Т. 44, №11. С. 1109— 1114. 9. Adams Е. Invertebrate coliagens // Science. 1978. Vol. 202. P. 591-598.10. Chapman D. M Cnidarian histology // Coelenterate biology. Reviews and new perspectives / Eds. by L. Muskatine, H. Lenhoff Acad. Press. New York; San Fran-sisco; London, 1974. P. 1-93.11. Chapman G. The structure and function of the mesoglea. Cnidaria and their evolution // Symp. Soc. / Ed. by Rees. London, 1966. Vol. 16. P. 147-168. 12. DeutzmannR., Fowler S., Zhang X., Boone K., Dexter S„ Boot-Handford R, Rachel R., SarrasM. P. Jr. Molecular, biochemical and functional analysis of a novel and developmental^ important fibrillar collagen (Hcoi-1) in hydra // Development. 2000. Vol. 127. P. 4669-4680. 13. FrancS., Franc J. M., Garrone R. Fine structure and cellular origin of collagenous matrices in primitive animals: Porifera, Cnidaria and Ctenophora// Front. Matrix Biol. 1984. Vol. 3. P. 143-156. 14. Laemmli U. K. Cleavage of structural protein during the essambly of the head of the bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 4. P. 680-682. 15. MiuraS.. KimuraS. Jellifish mesoglea collagen. Characterization .of molecules as ala2a3 hetrotrimers // J. Biol. Chem. 1985. Vol.260. P. 15352— 15356. 16. Rucker R. B. Isolation of soluble elastin from copper-deficient chick aorta// Methods fn Enzymology. 1982. Vol. 82. Pt. A / Ed. by L. W. Cunningham, D. W. Frederiksen. P. 650-656. 17. Schmid V., Bally A., Beck K., HallerM., Schlage W. K., Weber C. The extracellular matrix (mesoglea) of hydrozoan jellyfish and its ability to support cell adhesion and spreading // Hydrobiologia. 1991. Vol. 216/217. P. 3-10. 18. Schmid V., OnoS.-I., Reber-Muller S. Cell-substrate interactions in Cnidaria// Microsc. Res. Tech. 1999. Vol. 44. P. 254-268. 19. Towbin H., Staechelin Т., Gordon J. Electro-phoretic transfer of protein from polyacylamide gel to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Nat. Acad. Sci. 1979. Vol. 76. P. 4350^1354. •
Статья поступила в редакцию 18 марта 2004 г.
