CC BY
25
УДК 577.158:594.933
Вестник СПбГУ. Сер. 3,2004, вып. 3
Т. Г. Шапошникова, О. И. Подгорная
ВЫЯВЛЕНИЕ В ТЕСТАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ АСЦИДИИ MOLGULA CITRINA БЕЛКОВ, ИММУНОЛОГИЧЕСКИ СХОДНЫХ С БЕЛКАМИ МОРУЛЯРНЫХ КЛЕТОК*
Введение. В образовании внеклеточного матрикса туники взрослых асцидий принимают участие клетки покровного эпителия и один из типов клеток крови - морулярные клетки. Последние мигрируют в тунику и обеспечивают в ходе ее формирования задубли-вание белков матрикса [3, 4, 12, 21].
Миграция морулярных клеток в тунику происходит у личинок асцидий лишь на последнем этапе эмбриогенеза, когда туника уже полностью сформирована [1]. Таким образом, можно предполагать наличие функционального аналога морулярных клеток в период формирования личиночной туники асцидий. Одна из гипотез о формировании личиночной туники на ранних стадиях эмбриогенеза предполагает участие в этом процессе тестальных клеток - одного из типов вспомогательных клеток, окружающих ооциты и эмбрионы асцидий [10, 14].
У живородящей асцидии Molgula citrina в сезон размножения в гонадах присутствуют ооциты на разных стадиях вителлогенеза, а в клоакальной полости - эмбрионы на всех стадиях развития, что делает ее удобным объектом исследования. Ранее мы обнаружили, что антитела АВ26 и АВ47, полученные к белкам морулярных клеток S. rustica, окрашивают гранулы отдельных тестальных клеток, окружающих зрелые ооциты [5]. Иммуноцито-химический анализ показал, что тестальные клетки реагируют с этими антителами, начиная со стадии позднего вителлогенеза, причем иммунореактивность проявляет только содержимое гранул тестальных клеток как ооцитов, так и эмбрионов [2]. Поэтому мы предприняли попытку выявить в составе тестальных клеток ооцитов и эмбрионов белки, имеющие иммунологическое сходство с белками 26 и 47 кДа морулярных клеток.
Материалы и методы. Асцидии Molgula citrina и Styela rustica собраны в губе Чупа Кандалакшского залива Белого моря. Животные содержались в аквариумах с аэрируемой морской водой в изотермической комнате при 10°С. Перед кровопусканием тунику очищали от обрастателей, тщательно промывали фильтрованной морской водой и обсушивали фильтровальной бумагой. Область нанесения разреза стерилизовали 70°-ным спиртом. Тунику надрезали до уровня мышц без повреждения внутренних органов. Вытекающую в разрез гемолимфу собирали пипеткой в охлажденные на льду микроцентрифужные пробирки и центрифугировали при 800 g в течение 5 мин. Полученный клеточный осадок использовали для приготовления электрофоретических проб.
Для получения ооцитов и эмбрионов асцидий М. citrina вскрывали под бинокулярной лупой, вырезали гонады и собирали эмбрионы из клоакальной полости. Гонады аккуратно потрошили в фильтрованной морской воде, пропускали через газ, чтобы избавиться от. кусков соединительной ткани. Полученную суспензию оставляли в пробирках на несколько минут, давая ооцитам осесть. Надосадок, содержащий клетки крови, которые присутствуют в гонаде в достаточном количестве, удаляли, а осевшие ооциты заливали свежей порцией фильтрованной морской воды, мягко суспендировали и снова давали ооцитам осесть. Такие отмывки повторяли несколько раз, контролируя под фазово-контрастным микроскопом присутствие клеток крови среди отмытых ооцитов. Полученную порцию ооцитов либо сразу использовали для приготовления электрофоретической пробы, либо замораживали и хранили при -20°С. ■ .
Белковый состав фракций определяли с помощью SDS-электрофореза в 12%-ном полиакриламидном геле [17]. Гели окрашивали Кумасси бриллиантовым синим G-250. Полусухой перенос белков на нитроцеллюлозу проводили в электродном буфере Лэммли с 20% метанола [23]. Блоты отмывали в PBS-Tw. Далее проводили инактивацию сайтов неспецифического связывания нитроцеллюлозы 3%-ным бычьим сывороточным альбумином или
* Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 02-04-49420).
© Т. Г. Шапошникова, О. И. Подгорная, 2004
II
III
казеином в течение одного часа, затем блоты инкубировали в растворе антисыворотки АВ26 или АВ47 [19] (рабочее разведение 1:1500) на PBS-Tw в течение одного часа, отмывали PBS-Tw 4 раза по 15 мин, инкубировали со вторыми антителами (GAR, конъюгированные со щелочной фосфатазой, «Sigma») и окрашивали BC1P-NBT. Все операции проводили при комнатной температуре.
Результаты исследований. Результаты электрофоретического разделения белков клеток крови Styela rustica и Molgula citrina и белков из ооцитов и эмбрионов, окруженных тестальными клетками, асцидии Molgula citrina представлены на рисунке, I.
Среди белков клеток крови Styela rustica преобладают мажорные белки морулярных клеток массой 26 и 47 кДа, встречается белок с молекулярной массой 42 кДа (рисунок, I, 1). В клетках крови Molgula citrina наблюдается сходная картина - видны два мажорных белка
с молекулярной массой 27 и 44 кДа (рисунок, I, 2). Среди белков ооцитов и эмбрионов с тестальными клетками при окрашивании по Ку-масси выявляется несколько белков: в наибольшем количестве присутствует белок с массой около 170 кДа, в меньших количествах выявляются белки 140 - 150, 69, 65, 45, 32 и 28 кДа (рисунок, I, 3).
На иммуноблоте после разделения белков в условиях SDS-электрофореза АВ26 взаимодействовали с обоими мажорными белками морулярных клеток Styela rustica, но взаимодействие с белком 47 кДа было значительно слабее (рисунок, 11,1). В препарате из^ клеток крови Molgula citrina связывание АВ26 происходит с белком 27 кДа, а среди белков из препарата ооцитов и эмбрионов - с белками 69 и 26/27 кДа (рисунок, И, 2-3).
АВ47 с высокой степенью аффинности взаимодействуют с белком 47 кДа в клетках Styela rustica и значительно слабее - с белком крови 26 кДа (рисунок, III, 1), а вот белки клеток крови Molgula citrina не связываются с антителами АВ47. Среди белков ооцитов и эмбрионов Molgula citrina АВ47 взаимодействуют только с белком 28 кДа (рисунок, III, 3), аффинность этого взаимодействия не очень высока и сравнима с аффинностью связывания АВ47 с белком 26 кДа в клетках крови Styela rustica.
Обсуждение результатов. Для Styela rustica ранее было показано, что мажорные белки 26 и 47 кДа принадлежат морулярным клеткам, так как выявляются во фракции этих клеток, полученной в градиенте Перколла [19]. Поскольку доля морулярных клеток составляет до 50% и более в составе циркулирующей крови, то в белковом спектре цельной крови белки 26 и 47 кДа остаются преобладающими. В циркулирующей крови Molgula citrina доля морулярных клеток также составляет не менее половины, поэтому можно ожидать, что в препарате цельной крови белковое представительство морулярных клеток будет значительным. Электрофоретическая картина белкового спектра клеток крови Molgula citrina сходна с таковой для клеток крови Styela rustica -мы наблюдаем два мажорных белка, молекулярный вес которых - 27 и 44 кДа - близок к молекулярным весам мажоров морулярных клеток Styela rustica. Иммунологическое сход-
1 "V • f'" 's*
к: ■ - ' Г '.1 fßV•. ;••' 'VI
' ' ' о
* >. . i 1¿yúiC . '.'i' • ■■'
¥ ; 5ж : * j ■ ■;;■••'.';y.:
í Mi s»« . -
f £ •: yyt" ■■' '•■/.'
jk-,
» 1
: , -
1
2 3
SDS-электрофорез (I) и иммуноблот (II, III) клеток крови Styela rustica (1), клеток крови (2) и ооцитов и зародышей (3) Molgula citrina с антителами:
II - АВ26, III - АВ47 (в разведении 1:1500). Гель (I) окрашен Кумасси бриллиантовым синим.
ство с белками морулярных клеток Styela rustica проявил лишь белок 27 кДа, который взаимодействует с антителами АВ26, но не АВ47.
♦ В составе электрофоретической пробы, изготовленной из ооцитов и эмбрионов Molgula citrina, присутствуют и белки тестальных клеток. Так как на срезах наблюдается окрашивание гранул тестальных клеток, окружающих зрелые ооциты и эмбрионы, а желток и другие структуры не окрашиваются, то с достаточно высокой степенью вероятности можно полагать, что в наших пробах с антителами взаимодействуют белки именно тестальных клеток. АВ26 и АВ47 взаимодействуют при этом с разными белками. Следует также отметить, что АВ26 связывают белки примерно одинакового молекулярного веса в клетках крови и в препарате, содержащем белки тестальных клеток, - 27 и 26/27 кДа соответственно. В то же время эти белки сходны по молекулярному весу и иммунологически с белком 26 кДа из морулярных клеток Styela rustica. Следовательно, данные белки могут содержать сходные домены, а может быть, являются гомологичными белками.
Хотя многие авторы занимались исследованием тестальных клеток, единого мнения о функциях этих клеток до сих пор не сложилось. Одни авторы связывают функции тестальных клеток с процессами синтеза и организации личиночной туники [8, 9, 14, 20]. Другая группа авторов считает, что тестальные клетки осуществляют свои функции в период оогенеза [13, 15, 16], выполняя трофические функции или секретируя другие важные для ооцита факторы, например, предшественники пигмента. Третья группа авторов, обнаружившая гепарин и гис-тамин в составе тестальных клеток Styela plicata, считает их древними эффекторными клетками системы врожденного иммунитета у примитивных хордовых. Авторы сравнивают тестальные клетки асцидий с тучными клетками позвоночных животных [6,7].
Как и у взрослых асцидий у личинок основную роль в морфогенезе туники играют эпидермальные клетки. Это было продемонстрировано в экспериментах с эмбрионами, у которых тестальные клетки удалялись на ранней стадии развития, такие эмбрионы могли продуцировать все основные элементы личиночной туники: внешний и внутренний кутикуляр-ные слои и основное вещество [9, 11]. С другой стороны, показано, что тестальные клетки участвуют в завершении формирования личиночной туники [10]. Японские исследователи [18, 22] получили два моноклональных антитела, специфичных к тестальным клеткам асци-ium Ciona intestinalis. По результатам иммуноблоттинга белки, узнаваемые этими антителами, имеют молекулярную массу около 100 кДа и выше. При иммуногистохимическом окрашивании срезов авторам удалось показать наличие специфичных антигенов в тестальных клетках. Факт такого взаимодействия, с учетом наших данных, может говорить о наличии сходных функций у тестальных и морулярных клеток, синтезирующих сходные белки.
Статья рекомендована проф. А. Д. Харазовой. Summary
Shaposhnikova Т. G., Podgornaya О. I. Determination of proteins with immunological similarity to morula cells proteins in ascidian Molgula citrina.
Antibodies AB26 and AB47 raised to Styela rustica morula cells proteins react with Molgula citrina test cells proteins. The point is that AB26 bind the same proteins in blood and test cells - 26 and 26/27 kDa, respectively. In the same time these proteins have molecular weight and immunological resemblance with 26kDa protein from Styela rustica morula cells. Therefore, all these proteins might have similar domains or homological resemblance. Our data may reflect the presence of similar functions in test and morula cells.
Литература
1. Иванова-Казас О. M. Сравнительная эмбриология беспозвоночных животных. Низшие хордовые. М., 1978. 2. Некрасова Н. Н„ Шапошникова Т. Г., Подгорная О. И., Напара Т. О. К вопросу о роли тестальных клеток в оогенезе и эмбриональном развитии асцидии Molgula citrina // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 3. 2002. Вып. 4 (№ 27). С. 51-56. 3. Чага О. Ю. Орто-дифенолоксидазная система асцидий // Цитология. 1980. Т. 22, № 6. С. 619-625. 4.
* Чага О. Ю. Клетки крови асцидйи Styela (Goniocarpa) rustica. 1 Гистологический анализ // Цитология. 1998. Т. 40. С. 31-44. 5. Шапошникова Т. Г., Подгорная О. И. Антитела, полученные к белкам морулярных клеток асцидий, распознают также тестальные клетки // Цитология. 1999. Т. 41. С. 31-44. 6. Cavalcante М. С., AUodiS., Valente A.-f., Straus A. H., Takahashj H. K, Mourao P., Pavao M. Occurrence of heparin in the invertebrate Styela plicata (Tunicata) is restricted to cell layers facing the outside environment // J. Diol. Chem. 2000. Vol.275. P. 36189-36196. 7. Cavalcante M. C., deAndrade L., Santos-Pinto C„ Straus A. H., Takahashi H. K., AllodiS., Pavao M. Colocalization of heparin and histamine in the intracellular granules of test cells from invertebrate Styela plicata (Chordata-Tunicata) // J. Struct. Biol. 2002. Vol. 137. P. 313-321. 8. CaveyM. Ornamentation of the larval ascidian tunic by test cells // J. Ultrastr. Res. 1976. Vol. 55. P. 297-298. 9. CaveyM. J., Cloney R. A. Development of the larval tunic in a compound ascidian: morpho-genetic events in the embryos of Distaplia occidentalis // Can. J. Zool. 1984. Vol. 62. P. 2392-2400. 10. Cloney R., CaveyM. Ascidian larval tunic: extraembryonic structures influence mophogenesis // Cell Tissue Res. 1982. Vol. 222(3). P. 547-562. 11. Cloney R. A. Larval tunic and the function of the test cells in ascidians // Acta Zool. 1990. Vol. 71. P. 151-159. 12. Endean R. Studies of blood and test of some Australian ascidians. 1. Blood of Pyura stolonifera (Heller) // Austr. J. Mar. Freshwater Res. 1955. Vol. 6. P. 35-59. 13. Harvey L. The history of the cytoplasmic inclusions of the egg of Ciona during oogenesis, fertilization // Proc. Roy. Soc. B. 1927. Vol. 101 (NB 70 b). P. 136-162. 14. Kalk M. Cytoplasmic transmission of a vanadium compound in a tunicate oocyte, visible with electronmicroscopy // Acta Embr. Morph. Exp. 1963. Vol. 6. P. 289-303. 15. Kessel R., Beams H. An unusual configuration of the Golgi complex in the pigment-producting «test» cells of the ovary of the Tunicate, Styela // J. Cell. Biol. 1965. Vol. 25. P. 55-68. 16. Kessel R., Kemp N. An electron microscopic study of the oocyte, test cells and follicular envelope of the tunicate Molgula manhattensis // J. Ultrastruct. Res. 1962. Vol. 6. P. 57-76.17. Laemmli U. K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of the bacteriophage T4 // Nature. 1970. Vol. 4. P. 680-682. 18. Okada Т., Takamura K„ Yamaguchi Y„ Yamamoto M. Secretory function of the test cell in larval tunic formation in the ascidian Ciona intestinalis-. An immunoelectron microscopic study // Zool. Sci. 1996. Vol. 13. P. 253-261. 19. Podgornaya О. /,y Shaposhnikova T. G. Antibodies with the cell-type specifity to the morula cells from hemolymph of ascidian Styela rustica II Cell Struct, and Funct. 1998. Vol.23. P. 349-355. 20. Sato N.. Numakunai Т., Hori R. Behavior and cellular morphology of the test cells during embryogenesis of the ascidian Halocynthia roretzi II J. Morph. 1982- Vol. 171. P. 219-223. 21. Smith M. The blood.cells and tunic of the ascidian halo-cynthya aurantum. 1. Hematology, tunic morphology and partition of cells between blood and tunic // Biol. Bull. 1970. Vol. -138. P. 354-378. 22. Takamura K. Ueda Y„ Irie U.. Yamaguchi Y. Immunohistology with antibodies specific to test cells in the ascidian Ciona intestinalis suggests their role iff larval tunic formation II Zool. Sci. 1996. Vol. 13. P. 241-251. 23. Towbin H., Staechelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gel to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. Vol. 76. P. 4350-4354.
Статья поступила в редакцию 18 марта 2004 г.
