CC BY
98
2003
Известия ТИНРО
Том 135
УДК 577.115:574.5
А.Е.Караулов, В.Г.Рыбин, В.Н.Акулин
ПОЛУЧЕНИЕ ЭТАНОЛАМИДОВ ЖИРНЫХ КИСЛОТ ИЗ ЛИПИДОВ МОРСКИХ ОРГАНИЗМОВ
Осуществлен препаративный синтез этаноламидов жирных кислот из жиров морских гидробионтов. Определены оптимальные условия (молярное соотношение субстрат—реагент 1: 5, 140 °С, 2 ч, отсутствие доступа воздуха) синтеза целевых продуктов с выходом около 60 % без образования побочных продуктов. Показано, что синтез этаноламидов жирных кислот двустадийным способом, через стадию переэтерификации исходных триглицеридов, приводит к значительному увеличению выхода конечных продуктов. Структуры полученных этанолами-дов жирных кислот подтверждены методами электронной спектрофотометрии, инфракрасной и масс-спектрометрии в режиме химической ионизации при атмосферном давлении. Показано, что в процессе последовательного проведения реакций переэтерификации и аминолиза происходит равновероятная для всех жирных кислот конверсия в этаноламиды жирных кислот.
Karaulov A.E., Rybin V.G., Akulin V.N. Synthesis of fatty acids ethano-lamides from lipids of marine organisms // Izv. TINRO. — 2003. — Vol. 135. — P. 288-294.
Synthesis of fatty acids ethanolamides from oils of marine hydrobionts has been carried out. The following optimal conditions have been determined for the synthesis with 60 % yield and without by-products formation: molar ratio "substratum: reagent" 1: 5, temperature 140 oC, duration of reaction 2 hours, without access of air. The carrying out of the ethanolamides synthesis by two-stage way, through the stage of re-esterification of triglycerides, resulted in considerable increase of the yield of reaction. Structures of all synthesized ethanolamides were confirmed by UV-spectro-photometry, IR-spectrometry and mass-spectrometry method at atmospheric pressure chemical ionization. The equal probability of all fatty acids conversion into ethanola-mides is shown for consecutive carrying out the reactions of re-esterification and aminolysis.
Одной из задач рыбоперерабатывающей отрасли промышленности является комплексная переработка сырья. Существуют такие компоненты переработки гидробионтов, использование которых по существующим технологиям не всегда позволяет получать продукты, обладающие всем комплексом ценных, характерных для данного продукта свойств. Примером такого продукта может служить рыбный жир. Биологическая активность рыбного жира определяется наличием в нем омега-3 полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК). Организм, потребляющий липиды с высоким содержанием этих кислот, становится устойчивым к ряду сердечно-сосудистых заболеваний (Левачев, 1988). Установлено, что липиды, содержащие омега-3 ПНЖК (или некоторые их производные), демонстрируют противовоспалительную активность (Devane at al., 1992). Все это обусловливает уникальные лечебно-профилактические свойства "морских" омега-3 ПНЖК. В настоящее время интенсивно изучаются физиологические свойства не только
омега-3 ПНЖК, но и их различных производных, таких как спирты, галогенпроиз-водные, этерифицированные производные и др. Особое место среди них занимают этаноламиды омега-3 ПНЖК благодаря наличию в их структуре двух активных фрагментов — полиненасыщенного углеводородного и этаноламидного. Биологическая активность этаноламидов некоторых омега-3 ПНЖК изучалась ранее (Bezuglov et al., 1998).
Наиболее распространенным методом получения амидных производных карбоновых кислот является реакция хлорангидридов, или смешанных ангидридов, карбоновых кислот (например, ангидрида с изобутилхлороформиатом) с соответствующим свободным амином (Майенхофер, 1983). Однако наличие в структурах ПНЖК метиленразделенных двойных связей приводит к осмолению продукта в случае использования изобутилхлороформиата (данные эксперимента не приводятся), что практически делает невозможным применение этого метода. Для получения целевого продукта нами применялась реакция аминолиза сложно-эфирной связи этиловых эфиров жирных кислот свободным моноэтанолами-ном (Куклев и др., 2001).
Цель данной работы — получение концентратов этаноламидов омега-3 ПНЖК как технологического продукта из источников морского происхождения и их характеристика физико-химическими методами. В качестве источника ПНЖК был выбран рыбный жир (ГОСТ 1304).
Реактивы и растворители, использованные в работе, были квалификации "хч" и очищались перед употреблением согласно методикам (Беккер и др., 1992). 32,62,92,122,152-октадекапентаеновая кислота (18:5n-3) любезно предоставлена Д.В.Куклевым (Университет штата Мичиган, США). Этанола-мид 18:5n-3 был приготовлен согласно описанной ранее методике (Куклев и др., 2001).
Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинках с закрепленным слоем силикагеля Silufol UV254 ("Kavalier", Чехия). Элюировали системой растворителей: н-гексан—ацетон в объемном соотношении 1: 1. Вещества на хроматограммах обнаруживали опрыскиванием пластинок 10 %-ным раствором фосфорномолибденовой кислоты в этаноле и последующим подогревом пластинок до 90 оС. Массовые доли компонентов всех реакционных смесей определяли методом тонкослойной хроматографии на хроматографе Iatroscan TH-10 ("Yanaco", Япония), снабженном пламенно-ионизационным детектором с использованием хромародов Chromarod-SIII ("Yanaco", Япония). Элюировали системой растворителей гексан—ацетон—уксусная кислота в объемных соотношениях 50,0: 50,0: 0,2.
Высокоэффективную жидкостную хроматографию этаноламидов жирных кислот проводили на жидкостном хроматографе Agilent 1100 Series LC/MSD ("Hewlett-Packard", США), снабженном комплексом масс-спектро-метрического детектора (химическая ионизация при атмосферном давлении) и детектора на диодной матрице. Разделение осуществляли на колонке Hypersil ODS (4,0 x 250 мм, 5,0 мкм) при температуре 55 оС в режиме линейного градиентного элюирования от 55 %-ного водного ацетонитрила до 100 %-ного ацето-нитрила со скоростью 2,25 % в минуту. Скорость элюирования 1 мл/мин. Диапазон регистрируемых масс составил 150-1000 Да (режим регистрации положительных ионов), напряжение на фрагменторе 70 В, напряжение в ионизационной камере 4 кВ, поток газа-осушителя (азот) 6 л/мин и давление газа-распылителя (азот) 50 кгс/ см2. Количественное определение этаноламидов жирных кислот осуществляли по отклику масс-детектора с использованием этаноламида 18:5n-3 в качестве внутреннего стандарта.
Получение метиловых эфиров жирных кислот и их анализ методом газожидкостной хроматографии проводили, как описано ранее (Кейтс, 1975).
Получение этаноламидов жирных кислот
Одностадийный синтез. К 3,24 г рыбного жира добавляли 3,20 г све-жеперегнанного над гидроксидом калия моноэтаноламина (молярное соотношение субстрат: реагент 1: 5) и 5 мкл трифторуксусной кислоты. Полученную смесь запаивали в ампулу и энергично встряхивали. Реакционную смесь выдерживали в течение 2 ч при температуре 140 °С. Далее реакционную смесь охлаждали до 25 оС и извлекали из ампулы, после чего к содержимому прибавляли 6 мл хлороформа и 10 %-ный водный раствор соляной кислоты до рН 3. Полученную смесь энергично встряхивали. После расслоения хлороформный слой отделяли. Процедуру экстракции повторяли два раза. Хлороформные фракции объединяли, сушили над безводным сульфатом натрия, после чего упаривали в вакууме при температуре 40 оС до постоянного веса. Получали 3,39 г продукта в виде непрозрачного, желто-оранжевого масла, содержащего 1,01 г этаноламидов жирных кислот. Степень конверсии составила 28 %.
Двустадийный синтез. 0,3 г гидроксида калия растворяли в 10 мл 96 %-ного водного этилового спирта при температуре 80 оС. К полученному раствору добавляли 8,01 г рыбного жира. Смесь кипятили с обратным холодильником в течение 1 ч. Далее в охлажденную до 55 оС реакционную смесь добавляли 50 %-ный раствор серной кислоты в этиловом спирте до рН 3. Затем полученную смесь трижды промывали водой (по 30 мл) при температуре 55 оС. Органическую фракцию отделяли и упаривали досуха в вакууме при температуре 40 oC. Получали 7,99 г этиловых эфиров жирных кислот в виде светлого желто-оранжевого масла. Степень конверсии составила 95 %. Чистоту этиловых эфиров жирных кислот анализировали методом ТСХ.
К 6,56 г этиловых эфиров добавляли 6,53 г свежеперегнанного над гид-роксидом моноэтаноламина (молярное соотношение субстрат: реагент 1: 5) и 10 мкл трифторуксусной кислоты. Полученную смесь запаивали в ампулу и энергично встряхивали. Реакционную смесь выдерживали в течение 2 ч при температуре 140 оС. Далее реакционную смесь охлаждали до 25 оС и извлекали из ампулы, после чего к содержимому прибавляли 10 мл хлороформа и 10 %-ный водный раствор соляной кислоты до рН 3. Полученную смесь энергично встряхивали. После расслоения хлороформный слой отделяли. Процедуру экстракции повторяли два раза. Хлороформные фракции объединяли, сушили над безводным сульфатом натрия, после чего упаривали в вакууме при температуре 40 оС до постоянного веса. Получали 6,67 г продукта в виде непрозрачного желто-оранжевого масла, содержащего 4,09 г этаноламидов жирных кислот. Степень конверсии составила 60 %.
Колоночная хроматография этаноламидов жирных кислот
1,94 г этаноламидов жирных кислот очищали на 60 г силикагеля Chemapol L ("Kavalier", Чехия) 40-100 мкм с использованием ступенчатого градиента ацетона в н-гексане (0—>10 %). Получали 0,79 г бесцветного вязкого масла.
Реакция аминолиза сложных эфиров жирных кислот проводилась в запаянной ампуле, т.е. без доступа кислорода. Несоблюдение этого условия приводило к осмолению продукта даже при более низких температурах — 100 оС (рис. 1, а). Реакционные смеси, полученные при разных температурах в ампуле, анализировали методом ТСХ (рис. 1, б). Сумма этаноламидов жирных кислот характеризовалась значением Rf = 0,47, что соответствовало ранее полученному значению Rf для этаноламидов жирных кислот (Куклев и др., 2001). На приведенной хроматограмме (рис. 1, б) видно, что при температуре реакции более 140 оС наблюдается деградация липидных компонентов реакционной смеси, т.е. происходит частичное ее осмоление.
Рис. 1. ТСХ-анализ реакционной смеси синтеза этано-ламидов жирных кислот: а — сравнение составов реакционных смесей без доступа воздуха (1) и с доступом воздуха (2), выдержанных при температуре 100 оС; б — сравнение составов реакционных смесей, выдержанных при различных температурах (1 — 60 оС, 2 — 100, 3 — 120, 4 — 140, 5— 160 °С)
Fig. 1. TLC analysis of reactionary mixture at synthesis of fatty acids ethanolamides: a — comparison of reactionary mixtures composition without access of air (1) and with access of air (2) at 100 oC; б — comparison of reactionary mixtures at various temperatures (1 — 60 оС, 2 — 100, 3 — 120, 4 — 140, 5 — 160 оС)
Проведено исследование зависимости степени конверсии субстрата в реакции аминолиза от температуры в случае одно- и двустадийного подходов (рис. 2, 3, 4), т.е. в первом случае этаноламиды получали в одну стадию из исходного рыбного жира, а во втором — в две: исходный рыбный жир переводили в этиловые эфиры жирных кислот (первая стадия) а затем проводили их аминолиз (вторая стадия). Анализ результатов исследования показал, что получение этаноламидов из триглицеридов в одну стадию нецелесообразно, так как степень конверсии субстрата в целевой продукт слишком мала. Для реакции этиловых эфиров жирных кислот с этаноламином была исследована зависимость степени конверсии субстрата от соотношения субстрат (этиловые эфиры жирных кислот): реагент (этаноламин) и времени проведения реакции (рис. 5, 6). Выявлены оптимальные условия прохождения реакции: температура 140 °С, время 2 ч и молярное соотношение субстрат: реагент 1: 5.
Рис. 2. Схема одностадийного (а) и двустадийного (б) синтезов этаноламидов жирных кислот (III) из триглицеридов (I). II — этиловые эфиры жирных кислот, R, R2, R3 — углеводородные радикалы, х = 1, 2, 3
Fig. 2. Scheme of one-stage (а) and two-stage (б) syntheses of fatty acids ethanolamides (III) from triglycerides (I). II — fatty acids ethyl esters, R1, R2, R3 — hydrocarbon radicals, x = 1, 2, 3
Рис. 3. Зависимость степени конверсии субстрата от температуры в реакции рыбного жира с моноэтанолами-ном
Fig. 3. Dependence of substrate conversion degree on temperature in reaction of fish oil with monoethanolamine
Рис. 4. Зависимость степени конверсии субстрата от температуры в реакции этиловых эфиров жирных кислот из рыбного жира с моноэтаноламином
Fig. 4. Dependence of substrate conversion degree on temperature in reaction of fatty acids ethyl esters with monoetha-nolamine
70
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4
Время, ч
Рис. 5. Зависимость степени конверсии субстрата от времени в реакции этиловых эфиров жирных кислот из рыбного жира с моноэтаноламином
Fig. 5. Dependence of substrate conversion degree on time during reaction of fatty acids ethyl esters with monoethano-lamine
09' ' 11 11 11 11 11 1 1111 11 11 1 1111 1111 1111 012345678
Рис. 6. Зависимость степени конверсии субстрата от соотношения субстрат: реагент в реакции этиловых эфи-ров жирных кислот из рыбного жира с моноэтаноламином
Fig. 6. Dependence of substrate conversion degree on substrate: reagent ratio in reaction of fatty acids ethyl esters with monoethanolamine
Соотношение субстрат : реагент = 1 : х
Структуры всех полученных веществ подтверждены методами электронной спектрофотометрии, ИК- и масс-спектрометрии в режиме химической ионизации при атмосферном давлении.
Значения т^, соответствующие квазимолекулярным ионам ([М+Н]+) главных этаноламидов жирных кислот, полученных из обоих источников, составили: 272 (ЕА-14:0), 300 (ЕА-16:0), 298 (ЕА-16:1п-7), 328 (ЕА-18:0), 326 (ЕА-18:1п-9), 324 (ЕА-18:2п-6), 322 (ЕА-18:3п-3), 320 (ЕА-18:4п-3), 352 (ЕА-20:2п-6), 348 (ЕА-20:4п-3), 346 (ЕА-20:5п-3), 382 (ЕА-22:1), 374 (ЕА-22:5п-3), 372 (ЕА-22:6п-3).
Применение детектирования в УФ-диапазоне спектра электромагнитных колебаний (детектор на диодной матрице) позволило записать полные электронные спектры поглощения со всех компонентов анализируемых смесей этанола-мидов жирных кислот. Максимумы поглощения отмечались в диапазоне 200210 нм (рис. 7), что характеризует отсутствие сопряженных систем двойных связей в молекулах продуктов реакции аминолиза и, следовательно, отсутствие прохождения изомеризации метиленразделенных двойных связей полиненасыщенных углеводородных радикалов в процессе проведения реакции аминолиза этиловых эфиров жирных кислот.
Рис. 7. Типичный электронный спектр поглощения (ацетонитрил) продуктов реакции аминолиза этиловых эфиров жирных кислот
Fig. 7. Typical UV-spectrum of products from aminolysis fatty acids ethyl esters reaction. Acetonitryl was used as solvent
ИК-спектрометрическое исследование исходных этиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот и продуктов реакции — этаноламидов жирных кислот (рис. 8) — показало в обоих случаях отсутствие увеличения интенсивности полосы поглощения в области 965-980 см-1, характерной для двойных связей в транс-конфигурации. При этом интенсивная полоса в области 700800 см-1, характерная для двойных связей в ^wc-конфигурации, сохранялась без изменения. Следовательно, можно полагать, что в процессе проведения синтеза этаноламидов жирных кислот сохраняется ^wc-конфигурация двойных связей углеводородных полиненасыщенных радикалов.
На основании этого можно заключить, что качественный состав этаноламидов жирных кислот полностью соответствовал составу жирных кислот в исходных субстанциях.
Таким образом, осуществлено получение этаноламидов жирных кислот как технологического продукта с высоким содержанием этаноламидов œ-3 ПНЖК. Полученные данные позволяют планировать процесс разработки технологии биологически активной добавки "ЭА ПНЖК".
Рис. 8. ИК-спектры этиловых эфиров жирных кислот (1) и этаноламидов жирных кислот (2): R, R2 — углеводородные радикалы
Fig. 8. IR spectra of fatty acids ethyl esters (1) and their ethanolamides (2): Rp R2 — hydrocarbon radicals
Литература
Беккер X., Домшке Г., Юфангхенель Э. Органикум. — М.: Мир, 1992. — Т. 2. — 402 с.
Кейтс М. Техника липидологии: Пер. с англ. — М.: Мир, 1975. — 322 с.
Куклев Д.В., Караулов А.Е., Рыбин В.Г., Высоцкий В.И. Этаноламид окта-декапентаеновой кислоты // Изв. ТИНРО. — 2001. — Т. 129. — С. 34-39.
Левачев М.М. Жиры рыб в диетотерапии гиперлипопротеидемий и гипертонии: Медицина и здравоохранение. Сер. Терапия. — М., 1988. — 85 с.
Майенхофер И. Метод смешанных ангидридов угольной кислоты в синтезе пептидов // Пептиды: Пер. с англ. / Ред. Э.Гросс, И.Майенхофер. — М.: Мир, 1983. — С. 268-319.
Bezuglov V.V., Bobrov M.Y., Archakov A.V. Bioactive amides of fatty acids // Biochemistry. — 1998. — Vol. 63, № 1. — Р. 27-37.
Devane W.A., Hanus L., Breuer A. et al. Isolation and structure of a brain constituent that binds to the cannabinoid receptor // Science. — 1992. — Vol. 258. — P. 699-707.
Поступила в редакцию 27.06.03 г.
