CC BY
52
2001
Известия Тихоокеанского научно-исследовательского рыбохозяйственного центра
Том 129
Д.В.Куклев, А.Е.Караулов, В.Г.Рыбин, В.И.Высоцкий* (ТИНРО-центр, * Институт химии и прикладной экологии ДВГУ)
ЭТАНОЛАМИД ОКТАДЕКАПЕНТАЕНОВОЙ КИСЛОТЫ
Известно, что “морские” омега-3 полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК) играют чрезвычайно важную роль в организмах наземных животных, в том числе и человека. Функции омега-3 ПНЖК многообразны, но их особая роль заключается в том, что организм, потребляющий в пищу липиды с высоким содержанием этих кислот, становится устойчивым к ряду заболеваний сердечно-сосудистой системы. Это делает “морские” омега-3 ПНЖК уникальными природными лечебно-профилактическими агентами. В настоящее время интенсивно изучается биохимия как самих омега-3 ПНЖК, так и различных их производных, в том числе спиртов, галогенпроизводных, этерифицированных производных и др. Особое место среди них занимают этаноламиды омега-3 ПНЖК благодаря наличию в их структурах двух разных активных факторов: омега-3 полиненасыщенного углеводородного радикала и этаноламидного фрагмента.
Этаноламиды жирных кислот впервые привлекли внимание исследователей как биорегуляторы в 1957 г., когда было установлено, что N-пальмитоилэтаноламин является противовоспалительным фактором, содержащимся в липидах соевых бобов, арахисового масла и яичного желтка (Kuehl et al., 1957). Возвращение интереса к амидам ЖК с первичными аминами связано с открытием выраженного модуляторного действия природных N-арахидоноилэтаноламина (анандамида) (Devane et al., 1992) и олеоиламина (олеамида) (Cravatt et al., 1995). Впоследствии из мозга свиньи были выделены два новых этаноламида жирных кислот: ди-гомо-у-линоленоилэтаноламин и докозатетраеноилэтаноламин (Hanus et al., 1993; Pertwee et al., 1994). Далее было показано, что еще два этаноламида ПНЖК - докозагексаеновой (Fride et al., 1995) и эйко-затриеновой (20:3ю9) (Priller et al., 1995) - обладают выраженным биологическим действием.
Биологическую активность этаноламидов жирных кислот в настоящее время объясняют их способностью связываться с центральным (CB1) и периферическими (CB2) каннабиноидными рецепторами (Bezuglov et al., 1998). Физиологическая роль каннабиноидных рецепторов до сих пор окончательно не установлена. Сопоставляя этот факт с тем, что каннабиноиды оказывают определенный психотропный эффект, можно предположить, что СВ1 участвует в регуляции процессов движения, памяти, формировании эмоций и болевой чувствительности, а также
34
в регуляции вегетативных функций организма, тогда как СВ2, вероятно, связан с модуляцией реакций иммуннокомпетентных клеток.
Этаноламиды ЖК в зависимости от длины и структуры жирнокислотной части проявляют различные лигандные свойства по отношению к каннабиноидным рецепторам (Bezuglov et al., 1998). Следует, однако, заметить, что данные, полученные разными исследователями или в различных тест-системах для одного и того же соединения, могут различаться в несколько десятков раз. В подавляющем большинстве случаев приводимые в литературе константы относятся к вытеснению радиоактивно меченных каннабиноидов из препаратов СВ под действием испытуемых соединений, а не к прямому связыванию анандамида и родственных соединений с рецептором (Bezuglov et al., 1998).
Впервые синтезированная нами (Куклев и др., 1991) (3Z,6Z,9Z,12Z, 15Z)-октадекапентаеновая кислота (ОДПК) (рис. 1, структура 1) была обнаружена в 1974 г. в липидах морских организмов (Ackman et al., 1974). Она является предельно ненасыщенной метиленразделенной жирной кислотой С-18 ряда и относится к семейству омега-3 кислот. ОДПК обнаружена в ряде одноклеточных водорослей отдела Dinophyta, причем в некоторых из них (например в Prorocentrum minimum) ее доля в жирнокислотном составе превышает 20 % (Jozeph, 1975).
Рис. 1. Структуры (32,62,92,122,152)-октадекапентаеновой кислоты (ОДПК) (1) и этаноламида (32,62,92,122,152)-октадекапентаеновой кислоты (EA-ОДПК) (2)
Fig. 1. The structures of (32,62,92,122,152)-octadecapentaenoic acid (1) and ethanolamide of (32,62,92,122,152)-octadecapentaenoic acid (2)
Нами впервые обнаружено, что данная жирная кислота легко подвергается ферментативному окислению различными липоксигеназами и простагландинсинтетазой с образованием продуктов, характерных для других ненасыщенных жирных кислот С-18 ряда (Куклев и др., 1995; Когтева и др., наст. сб).
Уникальность структуры ОДПК и полное отсутствие у млекопитающих открывает возможность её использования как нерадиоактивного маркера при исследовании метаболизма различных производных жирных кислот по карбоксильной группе. Однако сложность структуры ОДПК накладывает ограничения на использование ряда синтетических методов, обычных для других жирных кислот.
При исследовании синтеза и биологической активности модифицированных жирных кислот нами изучалась возможность препаративного получения этаноламида ОДПК (рис. 1, структура 2).
Целью данной работы является препаративный синтез этаноламида ОДПК и его характеризация физико-химическими методами.
Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили на пластинках с закрепленным силикагелем “Silufol UV254“ ("Kavalier", Чехия).
Элюировали системой растворителей: н-гексан-ацетон (1: 1, об/об). Веще-
35
ства на хроматограммах обнаруживали опрыскиванием пластинок 10 % -ным раствором фосфорномолибденовой кислоты в этаноле и последующим подогревом пластинок до 90 °С.
Аналитическую высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) осуществляли на хроматографе LC-6A (“Shimadzu”, Япония) с использованием колонки Zorbax ODS (4,6 х 250 мм, 5 мкм, “DuPont”, США) и предколонки S him-Pack FLC-ODS (4,6 x 50 мм, 3 мкм, “Shimadzu”, Япония) при температуре колонки 55 оС. Для регистрации хроматограмм использовали УФ-детектор с диодной матрицей SPD-M6A (“Shimadzu”, Я пония). Скорость элюирования 2 мл/мин. В качестве элю-ента применяли системы растворителей ацетонитрил-вода (80: 20).
Газо-жидкостную хроматографию (ГЖХ) проводили на газовом хроматографе GC-16B (“Shimadzu”, Япония) с пламенно-ионизационным детектором. В работе применялась капиллярная кварцевая колонка с неподвижной фазой Supelcowax 10 (30 м х 0,32 мм, “Supelco”, США). Скорость потока газа-носителя (гелия) 40 мл/мин. Температура инжектора 220 оС, температура детектора 220 оС, температура колонки 190 оС. В качестве внутреннего стандарта был использован тридекан. Обработку хроматограмм осуществляли на базе обсчета данных C-R4AX Сhromatopac (“Shimadzu”, Япония).
Масс-спектры регистрировали на хромато-масс-спектрометре Agilent MS D 1100 (“Hewlett Packard”, США) в режиме химической ионизации при атмосферном давлении (регистрация положительных ионов) и на хромато-масс-спектрометре Finnigan Mat 4615B ("Finnigan", США) при ионизации электронным ударом (энергия электронов 70 эВ, прямой ввод в источник, ампула, регистрация положительных ионов). ВЭЖХ проводили на колонке S him-Pack FLC-ODS (4,6 x 50 мм, 3 мкм, “Shimadzu”, Япония) при температуре колонки 55 оС, скорость потока 0,5 мл/мин.
ИК-спектры регистрировали на ИК-спектрометре с фурье-преоб-разованием сигнала FT-IR Spectrum 1000 ("Perkin-Elmer", США) в таблетке KBr.
Реактивы и растворители, использованные в работе, были квалификации "химически чистый" и очищались перед употреблением согласно методикам (Беккер и др., 1992).
Синтез ЭА-ОДПК. Метиловый эфир ОДПК, полученный по известной методике (Куклев и др., 1991), чистотой более 96 % по данным ГЖХ и ВЭЖХ, в количестве 211 мг растворяли в 1 мл этаноламина (свежеперегнанного над KOH) и помещали в стеклянную ампулу объёмом 3 мл, ампулу запаивали под аргоном и выдерживали в термостате при температуре 50 оС в течение 1 ч, после чего охлаждали, вскрывали, содержимое растворяли в 50 мл хлористого метилена и переносили в делительную воронку. Полученный раствор промывали последовательно 1N HCl (3х30 мл), водой (2х30 мл), насыщенным раствором NaCl (1х50 мл) и сушили над безводным Na2SO4. Осушенный раствор ЭА-ОДПК в хлористом метилене упаривали досуха в вакууме, полученный остаток в виде светло-желтого масла очищали колоночной хроматографией на 50 г силикагеля Chemapol L ("Kavalier", ЧССР) 40-100 мкм с использованием ступенчатого градиента ацетона в н-гексане (0^30 %). Получали 164 мг (74 %) ЭА-ОДПК в виде бесцветного вязкого масла.
Наиболее распространенным методом синтеза амидных производных жирных кислот является реакция хлорангидридов или смешанных
36
ангидридов жирных кислот (например, ангидрида с изобутилхлорофор-миатом) с соответствующим свободным амином. Однако наличие в структуре ОДПК аллильного а-атома углерода приводит к осмолению реакционной смеси в случае хлорангидридов или к сложной смеси продуктов реакции в случае использования изобутилхлороформиата (характеризация не приводится), что делает невозможным применение этого метода.
Для получения целевого ЭА-ОДПК нами использовалась реакция аминолиза сложноэфирной связи этилового эфира ОДПК свободным этаноламином. Проведение реакции в запаянной ампуле при температуре 50 оС в течение 1 ч приводит к образованию целевого продукта с выходом более 70 %, без образования побочных продуктов (рис. 2).
Рис. 2. ТСХ-анализ реакционной смеси этано-ламина и метилового эфира (3Z,6Z,9Z,12Z,15Z)-ок-тадекапентаеновой кислоты (продукт реакции - пятно № 2, Rf 0,47) в присутствии свидетеля - исходного метилового эфира октадекапентаеновой кислоты (пятно № 1, Rf 0,8). Элюент - смесь растворителей ацетон-гексан (1: 1)
Fig. 2. TLC of reactionary mixture of ethanolamine and (3Z,6Z,9Z,12Z,15Z)-octadecapentaenoic acid methyl ester (spot number 2 with Rf 0,47 is a product of reaction) over a standard of (3Z,6Z,9Z,12Z,15Z)-octadecapentaenoic acid methyl ester (spot number 1 with Rf 0,8). The acetone-hexane (1: 1) solvent mixture was used as eluent
Полученный нами хроматографически очищенный ЭА-ОДПК характеризовался Rf = 0,45 (н-гексан-ацетон (1: 1) (рис. 2), ВЭЖХ - подвижностью к’ = 2,9, ИК-спектром (рис. 3) с основными характеристичными полосами поглощения при: 3311 см-1 (>NH, вторичный амид, -ОН), 2925 (-СН<), 1714 (-СО^Н^), 1653 (>С=С<), 1550 (-СО^Н^), 1463 (-СН2-), 1267 (-СО^Н^), 1070 (^С-О-), 720 см-1 (>С=С<), - УФ-спектром с максимумом поглощения при ^тах= 208 нм (метанол), масс-спектром ВЭЖХ-МС, т^: 318 ([М+Н]+), 301 ([М-Н2О+Н]+) в режиме химической ионизации при атмосферном давлении (рис. 4). Масс-спектр триметилсилильного производного по гидроксильной группе (электронный удар, энергия электронов 70 эВ, прямой ввод в источник, ампула) т^ (в скобках предполагаемая структура иона): 389 ([М]+) 360 ([М-С2Н5]+), 357 ([М-СН3ОН]+), 320 ([М-(СН2-СН=СН-С2Н5)]+), 280 ([М-(СН2-СН=СН)2-С2Н5]+), 240 ([М-(СН2-СН=СН)3-С2Н5]+), 200 ([М-(СН2-СН=СН)4-С2Н5]+), 160 ([O=C-NH-(CH2)2-OSi(CH3)3]+).
37
Рис. 3. ИК-спектр этаноламида (32,62,92,122,152)-октадекапентаеновой кислоты
Fig. 3. IR-spectrum of (32,62,92,122,152)-octadecapentaenoic acid ethanolamide
Рис. 4. ВЭЖХ-MC анализ этаноламида (32,62,92,122,152)-октадекапентаеновой кислоты: а - хроматографический сигнал, регистрация по полному ионному току; б -масс-спектр с вершины главного пика
Fig. 4. HPLC-MS analysis of (32, 62,92, 122,152 )-octadecap en-taenoic acid ethanolamide: a - detection of full ion current; б -mass-spectrum on main peak top
Таким образом, нами впервые осуществлен препаративный синтез ЭА-ОДПК. Результаты физико-химических методов анализа однозначно подтверждают структуру полученного соединения. Полученные данные позволяют планировать проведение исследований биологической активности ЭА-ОДПК.
Литература
Беккер X., Домшке Г., Фангхенель Э. Органикум. - М.: Мир, 1992. -Т. 2. - 402 с.
Когтева Г.С., Куклев Д.В., Рыбин В.Г. и др. Ферментативное окисление октадекапентаеновой кислоты // Наст. сб.
Куклев Д.В, Когтева Г.С., Латышев Н.А., Безуглов В.В. Окисление октадекапентаеновой (18:5n-3) кислоты соевой 15-липоксигеназой // Биоорган. химия. - 1995. - Т. 21, № 8. - С. 651-653.
Куклев Д.В., Латышев Н.А., Безуглов В.В. Синтез (3Z,6Z,9Z,12Z,15Z)-октадекапентаеновой кислоты // Биоорган. химия. - 1991. - Т. 17, № 10. - С. 1433-1436.
Ackman R.G., Manzer A., Joseph J. Tentative identification of an unusual naturally-occurring poeyenoic fatty acid by calculation from precision open tubular GLC and structural element retention data // Chromatographia. - 1974. -Vol. 7, № 1. - P. 107-114.
Bezuglov V.V., Bobrov M.Yu., Archakov A.V. Bioactive Amides of Fatty Acids // Biochemistry. - M., 1998. - Vol. 63, № 1. - P. 27-37.
Cravatt B.F., Prospero-Garcia O., Siuzdak G. et al. Chemical characterization of a family of brain li pids that induce sleep // Ibid. - 1995. - Vol. 268. - P. 1506-1509.
Devane W.A., Hanus L., Breuer A. et al. Isolation and structure of a brain constituent that binds to the cannabinoid receptor // Science. - 1992. -Vol. 258. - P. 1946-1949.
Fride E., Barg J., Levy R. et al. Low doses of anandamides inhibit pharmacological effects of delta 9-tetrahydrocannabinol // J. Pharmacol. Exp. Ther. -1995. - Vol. 272, № 2. - P. 699-707.
Hanus L., Gopher A., Almog S., Mechoulam R. Two new unsaturated fatty acid ethanolamides in brain that bind to the cannabinoid receptor // J. Med. Chem. - 1993. - Vol. 36, № 20. - P. 3032-3034.
Jozeph J.D. Identification of 3,6,9,12,15-octadecapentaenoic acid in laboratory-cultured photosynthetic dinoflagellates // Li pids. - 1975. - Vol. 10, № 3. -P. 395-403.
Kuehl F.A.Jr., Jaoob TA., Ganley O.H., Ormond R.E., Meisinger M.A.P. // J. Am. Chem. Soc. - 1957. - Vol. 79. - P. 5577-5578.
Pertwee R., Griffin G., Hanus L., Mechoulam R. Effects of two endogenous fatty acid ethanolamides on mouse vasa deferentia // Eur. J. Pharmacol. -1994. - Vol. 259, № 2. - P. 115-120.
Priller J., Briley E.M., Mansouri J. et al. Mead ethanolamide, a novel eicosanoid , is an agonist for the central (CB1) and peri pheral (CB2) cannabinoid receptors // Mol. Pharmacol. - 1995. - Vol. 48, № 2. - P. 288-292.
Поступила в редакцию 18.05.2001 г.
