CC BY
176
2003
Известия ТИНРО
Том 135
УДК 577.115
В.Г.Рыбин, А.Е.Караулов; Г.А.Вербицкий (ТИНРО-центр; ДВГУ)
ПРИМЕНЕНИЕ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ДЛЯ АНАЛИЗА ЭТАНОЛАМИДОВ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
Предложен метод анализа смесей этаноламидов жирных кислот высокоэффективной жидкостной хроматографией. Использование масс-селективного детектирования позволило провести точную идентификацию исследуемых компонентов анализируемых смесей. Метод был применен к анализу состава смесей этаноламидов жирных кислот из соевого и льняного масел, а также медицинского рыбного жира и препарата "Омега-3 эйконат". Обнаружено различие в интерпретации хроматографических сигналов, полученных методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и газожидкостной хроматографии. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии установлено наличие пентадеценовой, гексадекатетраеновой (два изомера), изогептадекановой, эйкозадеценовой (n-9), до-козапентаеновой (n-6) и тетракозагексаеновой жирных кислот в составе препарата "Омега-3 эйконат", а также гептадеценовой (один из изомеров) и тетракоза-гексаеновой (n-6) в составе жирных кислот медицинского рыбного жира.
Rybin V.G., Karaulov A.E., Verbitskii G.A. Application of high performance liquid chromatography to analysis of fatty acids ethanolamides // Izv. TIN-RO. — 2003. — Vol. 135. — P. 295-301.
Method of the fatty acids ethanolamides analysis using high performance liquid chromatography has been developed. The mass-selective detection allows precise identifying the investigated components in analyzed mixtures. The method was applied to analysis of fatty acids ethanolamides mixtures from soy bean and linseed oils, and also medical fish oil and preparation "Omega-3-eiconat". A difference was discovered in interpretation of chromatographic signals obtained by high performance liquid chromatography and gas-liquid chromatography methods. The presence of penta-decenoic, hexadecatetraenoic (two isomers), isoheptadecanoic, eicosadecenoic (n-9), docosapentaenoic (n-6), and tetracosahexaenoic acids in the preparation "Omega-3-eiconat" was established by means of high performance liquid chromatography. Besides, one of heptadecenoic acid isomers and one of tetracosahexaenoic acid isomers were discovered in medical fish oil fatty acids composition.
B настоящее время для анализа сложных смесей липидов широко применяется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. Метод позволяет при минимуме затрат на подготовку образцов и отсутствии жесткой необходимости дериватизации веществ проводить достоверный анализ биологических субстанций на предмет содержания в них индивидуальных липидов (Byrdwell, 2001). С введением в широкую мировую практику масс-спектрометрического детектирования в процессе хроматографического анализа появилась возможность быстрой и точной идентификации практически любого компонента смесей липидов (Энгельгардт, 1980). Состав жирных кислот липидов биологических
объектов обычно определяют методом газожидкостной хроматографии с использованием пламенно-ионизационного детектора. При этом идентификацию осуществляют по индексам удерживания Ковача (Christie, 1988). Такой способ идентификации достаточно хорошо себя оправдывает только в случае анализа жирных кислот с уже известным составом. При появлении в структурах липи-дов исследуемых объектов "необычных" жирных кислот возникают известные трудности при их идентификации. Для разрешения спорных вопросов о структуре неизвестных жирных кислот применяют масс-спектрометрическую детекцию в процессе газохроматографического анализа. При этом традиционный способ осуществления масс-детектирования в условиях ионизации электронным ударом требует проведения специфической дериватизации жирных кислот (Зенкевич, Иоффе, 1986). Кроме того, для метода газохроматографического анализа жирных кислот необходимо проведение специфической подготовки образцов. Особый случай представляет анализ таких производных жирных кислот, как амиды, особенно находящихся в смеси с собственно жирными кислотами. В этом случае при проведении газохроматографического анализа обязательными являются стадии отделения амидов жирных кислот от всех загрязняющих компонентов, гидролиз амидной связи и этерификация образующихся жирных кислот. Применение метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-селектив-ным детектированием позволяет минимизировать, а в ряде случаев и вовсе опустить все вышеперечисленные стадии подготовки образцов, что и было показано ранними исследованиями (Kusaka et al., 1988; Ikeda, Kusaka, 1992), в которых успешно проведен анализ ряда амидных производных жирных кислот, таких как их N-н-пропиламиды, ^^диэтиламиды, ^^дифениламиды и N-1-нафтила-миды. При разделении хроматографического сигнала по четности/нечетности значения m/z детектируемых квазимолекулярных ионов облегчается идентификация амидов жирных кислот, что позволяет расшифровывать состав сложных смесей.
Целью настоящего исследования была разработка метода анализа этанола-мидов жирных кислот высокоэффективной жидкостной хроматографией.
В работе использованы образцы медицинского рыбного жира (ГОСТ 1304), концентрата этиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот (омега-3 эй-конат, ТУ 9283-006-00038155-01), льняного масла (ТУ 9141-001-52572958) и соевого масла (ТУ 9140-208-00334534-97). Все реактивы, использованные в работе, были марки "хч", все растворители очищали по стандартным методикам (Гордон, Форд, 1976). Моноэтаноламин марки "хч" перегоняли над гидроксидом калия.
Высокоэффективную жидкостную хроматографию этаноламидов жирных кислот проводили на жидкостном хроматографе Agilent 1100 Series LC/MSD ("Hewlett-Packard", США), снабженном комплексом масс-спектромет-рического детектора (химическая ионизация при атмосферном давлении) и детектора на диодной матрице. Разделение осуществляли на колонке Hypersil ODS (4,0 x 250 мм, 5,0 мкм) при температуре 55 оС в режиме линейного градиентного элюирования от 55 %-ного водного ацетонитрила до 100 %-ного ацетонитрила со скоростью 2,25 % в минуту. Скорость элюирования 1 мл/мин. Диапазон регистрируемых масс составил 150-1000 Да (режим регистрации положительных ионов), напряжение на фрагменторе 70 В, напряжение в ионизационной камере 4 кВ, поток газа-осушителя (азот) 6 л/мин и давление газа-распылителя (азот) 50 кгс/ см2.
Получение этиловых эфиров жирных кислот
0,3 г гидроксида калия растворяли в 10 мл 96 %-ного водного этилового спирта при температуре 80 оС. К полученному раствору добавляли 8,01 г рыбного жира. Смесь кипятили с обратным холодильником в течение 1 ч. Далее в охлажденную до 55 оС реакционную смесь добавляли 50 %-ный раствор
серной кислоты в этиловом спирте до рН 3. Затем полученную смесь трижды промывали водой (по 30 мл) при температуре 55 °С. Органическую фракцию отделяли и упаривали досуха в вакууме при температуре 40 0С. Получали 7,99 г этиловых эфиров жирных кислот в виде светлого желто-оранжевого масла. Выход реакции составил 95 %. Аналогичные процедуры повторяли для льняного и соевого масел.
Получение этаноламидов жирных кислот
К 6,56 г этиловых эфиров жирных кислот добавляли 6,53 г свежеперегнан-ного моноэтаноламина (молярное соотношение субстрат: реагент 1: 5) и 10 мкл трифторуксусной кислоты. Полученную смесь запаивали в ампулу и энергично встряхивали. Реакционную смесь выдерживали в течение 2 ч при температуре 140 оС. Далее реакционную смесь охлаждали до 25 оС и извлекали из ампулы, после чего к содержимому прибавляли 10 мл хлороформа и 10 %-ный водный раствор соляной кислоты до рН 3. Полученную смесь энергично встряхивали. После расслоения хлороформный слой отделяли. Процедуру экстракции повторяли два раза. Хлороформные фракции объединяли, сушили над безводным сульфатом натрия, после чего упаривали в вакууме при температуре 40 оС до постоянного веса. Получали 4,09 г этаноламидов жирных кислот в виде непрозрачного, желто-оранжевого масла. Выход реакции составил 60 %.
Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-селек-тивным детектированием (ВЭЖХ-МС) для определения составов смесей синтетических этаноламидов жирных кислот позволило провести точную идентификацию каждого компонента исследуемых субстанций. Несмотря на сравнительно сложный характер реакционных смесей, путем фильтрации квазимолекулярных ионов с четными значениями т^, соответствующих [М+Н]+ с включением в их структуры одного атома азота (этаноламиды), от квазимолекулярных ионов с нечетными значениями т^ (исходные компоненты реакционной смеси — этиловые эфиры жирных кислот) была дана расшифровка хроматографи-ческих сигналов — результатов ВЭЖХ-МС-анализа смесей этаноламидов из четырех источников жирных кислот, рыбного жира, смеси этиловых эфиров жирных кислот, обогащенных полиненасыщенными жирными кислотами ("Оме-га-3 эйконат"), а также масел из семян льна и сои (см. таблицу, рис. 1-4). Последние два субстрата были использованы в качестве стандартных смесей жирных кислот с известным составом.
Для смесей этаноламидов жирных кислот из льняного и соевого масел были определены оптимальные условия для хроматографического разделения всех имеющихся в анализируемых смесях компонентов. При этом пронумерованные пики хроматографических сигналов для этаноламидов из жирных кислот обоих образцов масел (рис. 1, 2) соответствуют сигналам ионов с четными значениями т^, а именно — квазимолекулярным ионам этаноламидов жирных кислот. Результат идентификации (см. таблицу) показал, что условия хрома-тографического разделения и режима ионизации являются оптимальными.
Эти условия были применены к разделению сложных смесей этанолами-дов жирных кислот (рис. 3, 4), в результате чего установлено некоторое различие в результатах идентификации жирных кислот по методу газожидкостной хроматографии (индексы удерживания Ковача) и по результатам ВЭЖХ-МС-анализа их этаноламидов. В данном случае применение ВЭЖХ-МС позволило установить факт неправильной идентификации некоторых жирных кислот, проведенной методом ГЖХ. Это конкретно относится к таким жирным кислотам, как пентадеценовая, гексадекатетраеновая (два изомера), изогептадекановая, эй-козадеценовая (п-9), докозапентаеновая (п-6), тетракозагексаеновая (п-6) — "Омега-3 эйконат", а также гептадеценовая (один из изомеров) и тетракозагексаеновая (п-6) — рыбный жир (см. таблицу). Идентификация по значениям индексов
Отнесение сигналов хроматографических пиков (рис. 1-4), полученных в результате анализа этаноламидов жирных кислот из жиров разных источников
Interpretation of chromatographic peaks (Fig. 1-4) that were registered from analysis of fatty acids ethanolamides from various sources
Этаноламид [M+H]+, m/z Рыбный жир № "Омега-3 эйконат" пика (рис. 1-4) Масло из семян льна Масло из бобов сои
14:0 272 4 9
14:1 270 Сл 4
15:1' 284 Сл 7
16:0-изо 300 9 20
16:0 300 15 22 3 3
16:1n-7 298 6 11
16:2n-6 296 2 6
16:3n-3 294 3
16:4n-31 292 1
16:4n-3 (транс?)1 292 2
17:0 314 Сл Сл
17:0-изо1 314 Сл 25
17:1 312 12 17
17:12 312 13 18
18:0-изо 328 Сл 28
18:0 328 19 29 5 5
18:1n-7 326 16 Сл
18:1n-9 326 17 24 4 4
18:2n-6 324 10 15 2 2
18:3n-3 322 5 10 1 1
18:4n-3 320 1 5
19:1 340 Сл 27
20:0 356 Сл 31 6
20:1n-91 354 20 30
20:1n-11 354 21 Сл
20:2n-6 352 18 26
20:3n-6 350 Сл 19
20:4n-3 348 7 12
20:4n-6 348 9 14
20:5n-3 346 3 8
22:1 382 22 32
22:4n-3 376 23
22:5n-3 374 11 16
22:5n-61 374 20
22:6n-3 372 8 13
24:612 400 14 21
Примечание. Жирные кислоты, не идентифицированные по индексам удерживания Ковача их метиловых эфиров методом газожидкостной хроматографии, обозначены: 1 — "Омега-3 эйконат", 2 — рыбный жир.
Ковача, конечно же, нуждается в подтверждении результатами абсолютных методов анализа, одним из которых является масс-спектрометрия. Результаты структурного анализа этаноламидов жирных кислот были показаны ранее (Караулов и др., наст. сб.). При этом не отмечен факт прохождения процесса изменения конфигурации и положения двойных связей в полиненасыщенных радикалах молекул этаноламидов жирных кислот, т.е. наблюдается сохранение нативности углеводородной части молекулы этаноламида жирной кислоты в процессе его образования. Следовательно, отнесение названий углеводородных радикалов эта-ноламидов жирных кислот можно проводить на основании значений их молекулярных масс.
-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-г
5 10 15 20 мин 25
Рис. 1. ВЭЖХ-МС-анализ смеси этаноламидов жирных кислот соевого масла. Отнесение хроматографических пиков показано в таблице
Fig. 1. HPLC-MS analysis of fatty acids ethanolamides mixture from soy been oil. Interpretation of chromatographic peaks is shown in table
25
мин
Рис. 2. ВЭЖХ-МС-анализ смеси этаноламидов жирных кислот льняного масла. Отнесение хроматографических пиков показано в таблице
Fig. 2. HPLC-MS analysis of fatty acids ethanolamides mixture from linseed oil. Interpretation of chromatographic peaks is shown in table
Разделение жирных кислот в виде их этаноламидов методом ВЭЖХ позволило разрешить проблему критических пар некоторых жирных кислот, например эйкозапентаеновой и тетрадекановой (соответственно пики № 3 и 4, рис. 3 и № 8 и 9, рис. 4), обычно не разделяющихся в недериватизированном виде (Грецкая и др., 2001). Кроме того, проведение анализа смесей этаноламидов методом
Рис. 3. ВЭЖХ-МС-анализ смеси этаноламидов жирных кислот медицинского рыбного жира. Отнесение хроматографических пиков показано в таблице
Fig. 3. HPLC-MS analysis of fatty acids ethanolamides mixture from medical fish oil. Interpretation of chromatographic peaks is shown in table
Рис. 4. ВЭЖХ-МС-анализ смеси этаноламидов жирных кислот из препарата "Оме-га-3 эйконат". Отнесение хроматографических пиков показано в таблице
Fig. 4. HPLC-MS analysis of fatty acids ethanolamides mixture from "Omega-3 eicon-at" preparation. Interpretation of chromatographic peaks is shown in table
газожидкостной хроматографии несколько затруднено из-за необходимого сложного процесса пробоподготовки. Анализ методом ВЭЖХ позволяет минимизировать указанный процесс, при этом сводятся к минимуму все возможные потери определяемых компонентов смесей.
Совершенствование современных хроматографических методов анализа сложных смесей соединений неизменно приводит к разрешению многих спорных вопросов, касающихся составов таких смесей. В случае проведения анализа смесей жирных кислот как в свободном виде, так и в виде производных исследователи сталкиваются с рядом проблем, таких как критические пары либо присутствие в смесях жирных кислот соединений, имеющих наряду с алифатическим радикалом другие функциональные группы (например, диметилацетали в смесях с метиловыми эфирами жирных кислот), которые проблематично отделить в процессе подготовки образцов от жирных кислот, имеющих сходные хроматографические характеристики (Christie, 1973). Применение ВЭЖХ-МС-анализа позволяет легко разрешить указанные проблемы. Разработанный нами метод анализа жирных кислот в виде их этаноламидов является одним из способов преодоления вышеописанных трудностей при проведении анализа и особенно идентификации жирных кислот. Метод является новым в анализе этано-ламидов жирных кислот и может быть применен для определения нативного состава жирных кислот в виде их этаноламидов.
Литература
Грецкая Н.М., Когтева Г.С., Куклев Д.В., Рыбин В.Г. и др. Новый эффективный метод хроматомасс-спектрометрического анализа жирных кислот в виде их дансилгидразидов // Изв. ТИНРО. — 2001. — Т. 129. — С. 40-51.
Гордон Ф., Форд Р. Спутник химика. — М.: Мир, 1976. — 541 с.
Зенкевич И.Г., Иоффе Б.В. Интерпретация масс-спектров органических соединений. — Л.: Химия, 1986. — 176 с.
Караулов А.Е., Рыбин В.Г., Акулин В.Н. Получение этаноламидов жирных кислот из липидов морских организмов // Наст. сб.
Энгельгардт X. Жидкостная хроматография при высоких давлениях. — М.: Наука, 1980. — 245 с.
Byrdwell W.C. Atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry for analisys of lipids // Lipids. — 2001. — Vol. 36 , № 4. — P. 327-346.
Christie W.W. Lipid analysis. — Oxford: Pergamon Press Ltd ,1973. — 338 p.
Christie W.W. Equivalent chain-lengths of methyl ester derivatives of fatty acids on gas-chromatography — a reappraisal // J. Chromatogr. A. — 1988. — Vol. 447, № 2. — P. 305-314.
Ikeda M., Kusaka T.J. Liquid chromatography-mass spectrometry of hydroxy and non-hydroxy fatty acids as amide derivatives // J. Chromatogr. B. — 1992. — Vol. 575, № 2. — P. 197-205.
Kusaka T., Ikeda M., Nakano H., Numajiri Y. Liquid chromatography/mass spectrometry of fatty acids as their anilides // J. Biochem. (Tokyo). — 1988. — Vol. 104, № 4. — P. 495-497.
Поступила в редакцию 27.06.03 г.
