CC BY
299
УДК 636.22/.28.082.4
ПОЛУЧЕНИЕ ЭМБРИОНОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПУТЕМ ДОЗРЕВАНИЯ И ОПЛОДОТВОРЕНИЯ ООЦИТОВ IN VITRO
В.Н^толярова (ВНИИ физиологии,биохимии и питания с.-х. животных), А.А. Леонтьев (Великолукская государственная сельскохозяйственная академия)
Получение большого числа зигот и ранних эмбрионов крупного рогатого скота путем дозревания и оплодотворения ооцитов in vitro крайне важно для создания обширного банка эмбрионов и проведения работ по клеточной и генной инженерии,в частности для пересадки ядер и генов, а также для получения стволовых клеток в терапевтических целях.
Несмотря на то, что созревание и оплодотворение ооцитов in vitro стало рутинным, низкая эффективность развития эмбрионов крупного рогатого скота in vitro обусловливает необходимость глубокого изучения и дальнейшего совершенствования всех этапов данной технологии.
В настоящее время для культивирования эмбрионов крупного рогатого скота в разных лабораториях за рубежом широко используют такие среды,как KSOM,CR1 и SOF с изучением экспрессии генов при развитии эмбрионов от зиготы до стадии бластоцисты ( Sagirkaya H. et al., 2006) . Оказывается, экспрессия эмбриональных генов может изменяться в зависимости от культуральных условий . Такого рода исследования направлены на оптимизацию культуральных сред, способных снизить смертность эмбрионов, особенно на поздних стадиях, - предимплантации и утробного развития .
Многие компоненты,входящие в состав культуральных сред на разных этапах развития эмбрионов от зиготы до стадии бластоцисты, ведут себя по-разному и могут оказывать как стимулирующее, так и ингибирующее действие в зависимости от времени их введения на начальном этапе развития (дроблении), стадии 8-16 клеток, морулы, бластоцисты, то есть у эмбрионов крупного рогатого скота потребность в питательных веществах меняется в зависимости от периода развития.
Целью настоящих исследований являлось создание эффективной системы получения эмбрионов крупного рогатого скота путем созревания, оплодотворения ооцитов и развития эмбрионов in vitro.
В задачи исследований входило:
1. Получение созревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота в среде с гормонами и эстральной сыворотки.
2. Получение подвижной фракции сперматозоидов методом всплывания ( Swim-up).
3. Проведение капацитации сперматозоидов in vitro с помощью длительного воздействия на них гепарина.
4.Проведение оплодотворения созревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота в среде со сперматозоидами и наличием одного компонента гепарина.
б.Культивирование эмбрионов крупного рогатого скота in vitro в культуральной среде KSOM.
Материалы и методы исследований.
Яичники коров получали на мясокомбинате и доставляли в лабораторию в фосфатном буфере Дюльбекко или в 0,9 %-ном растворе NaCl при t=+28-35 .
Ооциты выделяли из антральных фолликулов размером 2- 8 мм методом рассечения поверхности яичника лезвием. Для отмывания ооцитов использовали раствор Дюльбекко с б % фетальной сыворотки с добавлением антибиотика-гентамицина в концентрации 40 мкг / мл.
Для экспериментов отбирали ооциты средней величины с мелкозернистой ооплазмой,окруженные компактным многослойным кумулюсом.
Для дозревания ооцитов использовали среду 199 (Medium 199,Hepes modification with Earle salt,25mM Hepes-Sigma) с добавлением 10 % эстральной сыворотки крови крупного рогатого скота ( ЭСК); 0,66 mM Na- пирувата; 1.0 ЕД / мл гонадотропина хорионического; 10 ME/мл фоллигона( Intervet Boxmeer - Holland) ; 1,0мкг / мл эстрадиола 17 (спиртовой раствор) и 40 мкг / мл гентамицина.
Ооциты помещали в среду созревания в микрокапли объемом 50 мкл под минеральным маслом (“Sigma”, США ) и культивировали в течение 20-24 часов при температуре 38,5-39 в атмосфере б % CO2 в воздухе.
Получение подвижной фракции сперматозоидов проводили методом всплывания ( Swim-up) по методу Parrish I. et al. (1986). Визуальная оценка показала,что большая часть сперматозоидов остается в осадке (нижний слой в пробирке),меньшая часть всплывает .Инкубации в течение 1 часа было достаточно для того,чтобы подвижные сперматозоиды могли подняться в верхний слой среды SP-TALP, оставив на дне пробирки мертвые сперматозоиды.
Капацитация подвижных сперматозоидов проходила под длительным воздействием гепарина (в течение 4 часов) в концентрации 20 мкг/мл при температуре 38,5-39 с б % CO2 в воздухе.
Все подвижные сперматозоиды ,полученные после размораживания 2 гранул обработанные Swim-up - методом и прошедшие капацитацию гепарином, в объеме 250мкл SP-TALP распределялись по 20-30 мкл в капли Fert-TALP объемом 50 мкл при конечной концентрации 1х10-6 подвижных сперматозоидов / мл. Число ооцитов в капле варьировало в пределах 5-10.
Предварительно ооциты крупного рогатого скота,прошедшие созревание in vitro в течение 20-24 часов и имеющие расширенный кумулюс, освобождали частично от клеток кумулюса с помощью 0,1 %-ного раствора гиалуронидазы ( Sigma) при мягком пипетировании.Затем ооциты отмывали от примесей гиалуронидазы в нескольких каплях (5-6) раствора TL-Hepes. В качестве среды оплодотворения использовали
Fert-TALP, дополненную 10 мкг / мл гепарина. Оплодотворение ооцитов проходило в течение 18 часов после введения капацитированных сперматозоидов в капли среды для оплодотворения.Оплодотворенные ооциты определяли по дроблению от 2 - до 4- 8-клеточной стадии через 48 часов после контакта сперматозоидов с ооцитами.
Развитие эмбрионов крупного рогатого скота.
Для развития эмбрионов крупного рогатого скота была использована культуральная среда KSOM (potassium simplex optimization medium)- синтетическая среда, аналогичная по минеральному составу яйцеводной жидкости мышей (Lawitts J,Biggers J., 1993).
Культивирование предположительно зигот крупного рогатого скота, полученных путем созревания и оплодотворения ооцитов in vitro , проводили в простой солевой среде KSOM с постоянным присутствием заменимых и незаменимых аминокислот на протяжении всего периода культивирования.Однако доза вводимых аминокислот, заменимых и незаменимых, была уменьшена и колебалась в пределах ЛА от стандартной концентрации ( 1% x 100 раствора заменимых аминокислот по рецептуре среды MEM и x 50 раствора незаменимых аминокислот по рецептуре среды BME). Культивирование эмбрионов проводили в микрокаплях объемом 20 |j l ( 20 эмбрионов на 1 каплю ) под слоем минерального масла (« Sigma » , США) при температуре 38,5° С в увлажненной атмосфере под газовой фазой (по 5% CO2 и O 2 и 90 % N2) в течение 7-8 суток.
В культуральной среде KSOM aa на протяжении всего периода культивирования присутствовал глютамин в количестве 1 mM и BSA в концентрации 1мг / мл.
Несмотря на минимальное количество глюкозы (0,2mM) в стандартной среде KSOM , в предлагаемой нами системе культивирования глюкоза отсутствовала в течение 4 суток, и только на 5 сутки вводили 1,5 mM глюкозы, данная концентрация глюкозы сохранялась на протяжении последующих суток культивирования.
Через 2 суток культивирования к эмбрионам, находящимся на стадии 4-8 клеток, добавляли 10%-ную фетальную сыворотку.
Существуют противоречивые мнения о целесообразности включения глюкозы в питательные среды для культивирования эмбрионов крупного рогатого скота. По данным некоторых исследователей (Ellington J.E., 1990), глюкоза на ранних стадиях развития эмбрионов оказывает ингибирующее действие и стимулирует развитие эмбрионов на более поздних стадиях- от морулы до бластоцисты.
Таблица. - Развитие эмбрионов крупного рогатого скота в среде RSOMaa
Эксперимент Всего Ооцитов, Дробилось (через 2 суток) Развилось до стадии
n 8-16кл n % от 4-8кл Морулы / Бластоцисты n % от 4-8кл.
2кл.-n % 4.-8кл. n %
1 58 13 22,4 32 55,1% 2 1 65 ,6 11 34,3
2 65 15 23 26 40 20 76,9 15 57,6
3 87 19 21,8 42 48,2 30 71,4 22 52,3
Всего 210 47 22.3 10 0 47,6 71 71 48 48
Эффективность оплодотворения оценивали по количеству продробившихся эмбрионов (через 2 суток),в экспериментах 1-3 она составляла 77,5%, 63 и 70%, в среднем - 69,9%.
Для дальнейшего культивирования были отобраны только эмбрионы, достигшие к этому времени стадии 4-8 клеток. Работать с 2 -клеточными эмбрионами считали нецелесообразным, так как в предварительных опытах нами была отмечена неспособность 2клеточных эмбрионов к дальнейшему развитию.
По данным Ulloa C.M. et al. (2008), эмбрионы крупного рогатого скота, достигшие стадии 5-8 клеток через 2 суток культивирования, были лучшего качества,имели больший потенциал развития до стадии бластоцисты с большим количеством клеток и низким уровнем хромосомных аномалий.
После дозревания и оплодотворения ооцитов крупного рогатого скота in vitro на культивирование в среде KSOMaa- в 3 экспериментах было поставлено всего 210 одноклеточных эмбрионов, предположительно, зигот, 100 дробились до 4-8 клеток с эффективностью 47 ,6 %, до стадии 8-16 клеток развились 71%(71 /100) эмбрионов и стадии компактной морулы / бластоцисты достигли 48% (48 /100) эмбрионов от дробившихся 4-8 - клеточных эмбрионов (таблица) Сравнивая полученные нами данные по развитию эмбрионов крупного рогатого скота in vitro с данными других исследователей ( Sagirkaya H. et al., 2006), можно отметить,что не существует больших различий в эффективности созревания,оплодотворения ооцитов in vitro, а также развития эмбрионов до стадии морулы-бластоцисты.
