CC BY
62
DOI: 10.24411/0235-2451-2018-11016
УДК 636:59
Эффективность методов доставки экзогенной ДНК в полученные in vitro зиготы крупного рогатого скота с использованием липосом
А. Б. РОМАНОВА, младший научный сотрудник Е. В. КОРНИЕНКО, научный сотрудник С. Н. КОВАЛЬЧУК, кандидат биологических наук, врио директора (е-mail: [email protected])
Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий, ул. Костякова, 12, стр. 4, Москва, 127422, Российская Федерация
Резюме. Оценивали эффективность доставки экзогенной ДНК в полученные in vitro зиготы крупного рогатого скота с использованием липосом путем микроинъекции комплексов плазмида-липосомы в цитоплазму зигот и путем липофекции лишенных блестящей оболочки зигот крупного рогатого скота. Микроинъекцию проводили через 18...22 ч после начала оплодотворения, концентрация кольцевой плазмиды pEGFP-N1 в инъекционном растворе составляла 18,26,250мкг/мл, линеаризованной -13 мкг/мл, количество эмбрионов -25,25,12и 25 соответственно. Увеличение концентрации плазмиды существенно не повлияло на динамику развития эмбрионов in vitro и на долю эмбрионов, экспрессиро-вавших целевой ген EGFP. У всех эмбрионов с флуоресцентным сигналом отмечен мозаичный характер экспрессии целевого гена. Флуоресцентный сигнал наблюдали только в 1 бластоцисте, полученной при микроинъекции линеаризованной плазмиды в комплексе с липосомами. Эффективность метода оказалась низкой (4,0.8,3 %), за исключением группы, где концентрация плазмиды составляла 18 мкг/мл (20,0 %). Впервые показана эффективность метода трансфекции лишенных блестящей оболочки зигот путем липофекции в применении к крупному рогатому скоту. Время начала трансфекции кольцевой плазмидой - 18, 22, 24, 27 ч от начала оплодотворения, количество эмбрионов - соответственно 12, 15,35,33; линеаризованной - 18 и 27ч, 12 и 13 эмбрионов соответственно. Больше всего эмбрионов, экспрессировавших ген TurboGFP(51,5 %), наблюдали при трансфекции через 27 ч после начала оплодотворения при использовании кольцевой плазмиды. При проведении липофекции с использованием линеаризованной плазмиды изменение времени начала трансфекции с 18 до 27 ч существенно не влияло на величину этого показателя (33,3 и 30,8 % соответственно). Метод липофекции представляется пре-спективным для неинвазивной трансфекции лишенных блестящей оболочки зигот крупного рогатого скота.
Ключевые слова: крупный рогатый скот, зигота, трансгеноз, липосомы, микроинъекция.
Для цитирования: Романова А. Б., Корниенко Е. В., Ковальчук С. Н. Эффективность методов доставки экзогенной ДНК в полученные in vitro зиготы крупного рогатого скота с использованием липосом // Достижения науки и техники АПК. 2018. Т. 32. № 10. С. 69-73. DOI: 10.24411/0235-2451-2018-11016.
Существует множество методов внесения чужеродной ДНК в соматические клетки: электропорация, вирус-опосредованная доставка, использование в качестве вектора доставки магнитных наночастиц, катионных полимеров и липосом [1, 2]. Однако их применение затрудняет наличие у ооцитов и ранних эмбрионов млекопитающих блестящей оболочки. Ее толщина у крупного рогатого скота составляет около 15 мкм [3]. Это важный биологический барьер, защищающий ооциты и ранние эмбрионы от механических повреждений и контаминации микроорганизмами или вирусами. К наиболее распространенным методам трансфекции ранних эмбрионов млекопитающих относят инъекционные (инъекция лентивирусов, ДНК в мужской пронуклеус, трансфецированного сперматозоида в ооплазму) и соматическое клонирование [4, 5]. Но их эффективность в применении к ранним эмбрионам крупного
рогатого скота ограничена, а сами они требуют высокого уровня опыта оператора, дорогостоящего оборудования и сложных манипуляций с эмбрионами, что может привести к снижению их жизнеспособности [6, 7].
Для редактирования экспрессии генов [4] и получения трансгенных эмбрионов у ряда млекопитающих [8] часто используют микроинъекцию генетических конструкций в цитоплазму ранних эмбрионов. Однако при работе с ооцитами и ранними эмбрионами крупного рогатого скота инъекция кольцевых и линеаризованных плазмид в цитоплазму не давала положительных результатов [4]. Модификация метода введения в цитоплазму зигот крупного рогатого скота комплексов ДНК-липосомы позволила получить 40.. .50 % трансгенных бластоцист с различной степенью мозаицизма [4, 5]. Применение этого метода сильно упрощает технологию, позволяет избежать предварительного центрифугирования, необходимого для визуализации пронуклеусов у зигот крупного рогатого скота, и значительно сократить время обработки группы эмбрионов. К недостаткам метода микроинъекции в цитоплазму, как и микроинъекции в пронуклеус относят некоторое повышение фрагментации геномной ДНК и высокую степень мозаицизма [4, 8, 9], которые, впрочем, не влияют на дробление и формирование бластоцист [8, 9].
Другой альтернативный метод трансфекции ранних эмбрионов крупного рогатого скота - внесение экзогенной ДНК в зиготу на стадии формирования пронуклеусов и/или начала первого деления дробления неинъекционными методами. В этой связи перспективным представляется использование комплексов ДНК-липосомы, успешно применяемых для трансфекции культур соматических клеток [2]. К основным недостатком этого метода относят необходимость удаления блестящей оболочки на стадии зиготы и дальнейшее культивирование zona-free эмбрионов. Решить указанную проблему позволяет система культивирования лунка-в-лунке (well-of-the-well). Кроме того, успешная трансфекция зигот без блестящей оболочки при их дальнейшем культивировании может способствовать снижению мозаицизма с помощью дезинтеграции 3-х дневных мозаичных эмбрионов с отбором трансгенных бластомеров и их агрегацией [10].
Цель работы - оценка эффективности доставки в полученные in vitro зиготы крупного рогатого скота комплексов ДНК-липосомы путем микроинъекции в цитоплазму и методом липофекции.
Условия, материалы и методы. Исследования проводили в 2017-2018 гг. В работе, кроме оговоренных случаев, использовали реактивы фирмы «Sigma-Aldrich» (США). Среды готовили на основе маточных растворов компонентов [3], хранящихся при 4 °С или -20 °С. Дозревание ооцитов проводили в среде 199 («ПанЭко», Россия) с добавлением 0,66 мМ Na пирувата, 1 мМ L-глутамина, 0,6 мМ L-цистеина, 5 ЕД/мл гонадотропина хорионического (Московский эндокринный завод, Россия), 5 мкг/мл фолликулостимулирую-щего гормона («ФСГ-супер», ООО «Агробиомед», Россия), 1 мкг/мл эстрадиола-17р и 10 % фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота (FCS; HyClone, США). Манипуляции с ооцитами, сперматозоидами и эмбрионами на воздухе
осуществляли в модифицированной среде TALP-HEPES (TH) [3]. Для оплодотворения использовали модифицированную среду TALP-Fert (TF) [3]. Эмбрионы вультивиро-вали в модифицированной среде SOF [3] без альбумина и глюкозы, но с добавлением 2 % (v/v) пятидесятикратного раствора аминокислот MEM (50*; M5550, Sigma, США), 1 % стократного раствора заменимых аминокислот MEM (100*; M7145, Sigma, США) и 5 % FCS (mSOF). Перед использованием во все рабочие среды и растворы добавляли гентамицин в количестве 50 мкг/мл.
Яичники крупного рогатого скота получали на мясокомбинате (г. Железнодорожный, Московская обл.) и доставляли в лабораторию в физиологическом растворе при температуре 26.. .30 °С в течение 3.. .5 ч. Оооциты дозревали в С02-инкубаторе при температуре 38,5 °С в течение 22.23 ч. Для оплодотворения использовали криоконсервиро-ванное семя быка (ОАО «ГЦВ», Быково, Московская обл.). Для выделения фракции подвижных сперматозоидов, свободных от семенной плазмы и компонентов сред разбавления и криоконсервации, использовали метод swim up. Совместное инкубирование ооцитов и сперматозоидов (0,5*106 сперматозоидов/мл) проводили в среде TF с добавлением смеси пеницилламина, гипотаурина и эфпинеф-рина [3], а также 0,2 мкг/мл гепарина в течение 16.20 ч в СО2-инкубаторе при температуре 38,5 °С. День постановки на оплодотворение считали нулевым.
Предполагаемые зиготы в возрасте 18.20 ч от начала оплодотворения извлекали из среды TF и освобождали от клеток кумулюса с использованием Vortex. Под стереомикроскопом отбирали морфологически нормальные одноклеточные эмбрионы, имеющие одно или два различимых направительных тельца. Подготовленные эмбрионы использовали для проведения транс-фекции путем микроинъекции или методом липофекции. Эмбрионы культивировали в среде mSOF в атмосфере 5,6 % СО2, 5,7 % О2, 88,7 % N2 в течение 12 дней.
Для проведения трансфекции использовали кольцевые плазмиды pEGFP-N1 (микроинъекция) или pTurboGFP-N (липофекция), содержащие промотор цитомегаловируса человека и модифицированный ген флуоресцентного белка GFP (green fluorescent protein), а также липосомы Lipo-fectamine LTX (LifeTechnologies, США). В ряде экспериментов плазмиды подвергали рестрикции при помощи рестрик-тазы HindIII (LifeTechnologies, США). На основе кольцевой плазмиды или рестрикционной смеси готовили комплекс с липосомами, согласно инструкции производителя, который затем инъецировали в цитоплазму зигот (эксперимент 1) или использовали для проведения трансфекции по методу липофекции зигот без блестящей оболочки (эксперимент 2). Наличие экспрессии гена GFP в процессе культивирования и развития эмбрионов определяли под микроскопом Eclipse Ti-U (Nikon, Япония), оборудованным блоком для флуоресцентной микроскопии (флуоресцентный фильтр FITC: EX 465-495, DM 505, BA 515-555) .
В эксперименте 1 для проведения микроинъекции в цитоплазму зигот готовили растворы плазмиды pEGFP-N1 с липосомами Lipofectamine LTX в следующих пропорциях: I группа - 1 мкг кольцевой плазмиды : 30 мкл липосом; II - 1 мкг кольцевой плазмиды : 20 мкл липосом; III -1 мкг кольцевой плазмиды : 2 мкл липосом; IV - 1 мкг линеаризованной плазмиды : 40 мкл липосом. После этого полученные смеси разбавляли в пропорции 1:1 стерильным 10 %-ным раствором поливинилпирролидона. Общий объем инъекционной смеси составлял 8 мкл. Конечная концентрация плазмиды в инъекционных растворах была равна соответственно 18; 26; 250; 13 мкг/мл. Микроинъекцию осуществляли при помощи микроманипулятора (Narishige, Япония) под инвертирован-
ным микроскопом (Eclipse Ti-U, Nikon, Япония). Отобранные зиготы группами по 5...7 шт. помещали в каплю TH. Кончик микропипетки помещали в инъекционный раствор и набирали 40.50 pl раствора. Затем микропипетку перемещали в каплю с зиготами. Зиготы фиксировали при помощи микроприсоски, причем полярные тельца располагались в положении 6 или 12 ч. В цитоплазмукаждой зиготы вводили 7.10 pl инъекционного раствора, содержащего комплексы ДНК-липосомы. После проведения микроинъекции зиготы размещали на культивирование в среде mSOF. Каждая экспериментальная группа содержала не менее 3 повторов.
В эксперименте 2 для проведения трансфекции по методу липофекции у отобранных зигот удаляли блестящую оболочку при помощи раствора проназы 2 мг/ мл. Готовили смесь кольцевой или линеаризованной плазмиды pTurboGFP-N с липосомами Lipofectamine LTX в пропорции 1 мкг плазмиды : 8 мкл липосом. Комплексы ДНК-липосомы добавляли из расчета1 мкг ДНК на 400 мкл среды mSOF в лунки 4-гнездных планшетов с заранее подготовленными микролунками [10] и тщательно перемешивали. Концентрация плазмиды во всех лунках составляла 2,5 мкг/мл среды. Зиготы без блестящей оболочки помещали по одной в микролунки 4-гнездных планшетов. Инкубирование зигот в среде mSOF в присутствии комплексов плазмида-липосомы проводили в течение 22 ч. После этого эмбрионы переносили в свежую среду mSOF для дальнейшего культивирования. Каждая экспериментальная группа содержала не менее 3 повторов.
В качестве контроля в обоих экспериментах использовали морфологически нормальные полученные in vitro зиготы, имеющие одно или два различимых направительных тельца и не подвергавшиеся трансфекции. В эксперименте 2 у них была удалена блестящая оболочка.
Выделение суммарной ДНК из полученных in vitro эмбрионов крупного рогатого скота проводили по следующему протоколу. Эмбрионы в возрасте 11.12 сут. извлекали из среды культивирования и последовательно отмывали в 3 каплях буфера TAE объемом 50 мкл. Далее их помещали индивидуально в пробирку типа эппендорф, содержащую 7 мкл буфера TAE. В каждую пробирку добавляли 1,5 мкл протеиназы К и инкубировали 1 ч при 37 °С и 1 ч при 50 °С. Затем полученную смесь инкубировали в течение 15 мин. при 97 °С и проводили ПЦР с праймерами C1-F и C1-R, позволяющими получить ампликон длиной 911 bp, содержащий последовательность гена EGFP. Полученный ПЦР-продукт использовали для определения наличия плазмиды в эмбрионах при помощи горизонтального электрофореза в 1 % агарозном геле.
Результаты представлены в виде процента от общего количества трансфецированных зигот, уровень выхода из блестящей оболочки - в виде процента от числа полученных бластоцист на 10-е сут. после начала оплодотворения. Данные обработаны с использование непараметрического критерия хи-квадрата Пирсона (p < 0,05).
Результаты и обсуждение. В эксперименте 1 в контрольной группе эмбрионов, отобранных через 18.20 ч после начала оплодотворения и имевших одно или два различимых направительных тельца, средний уровень дробления через 44.46 ч после начала оплодотворения составлял 81,7 %. Уровень выхода бластоцист на 7-е сутки развития был равен 29,5 %, на 10-е - 47,4 %, уровень вылупления бластоцист из блестящей оболочки от числа полученных бластоцист на 10-е сутки - 78,0 %, что незначительно больше, чем у эмбрионов, которые не отбирали по наличию полярного тельца на стадии зиготы (по результатам собственных исследований — 26,8, 40,6 и 70,0 % соответственно).
Таблица 1. Результаты трансфекции полученных in vitro зигот крупного рогатого скота в возрасте 18...22 ч методом микроинъекции комплексов плазмиды (pEGFP-N1) с липосомами (Lipofectimine LTX) в цитоплазму
Группа Концентрация плазмиды pEGFP-N1 в инъекционном растворе, мкг/мл Тип плазмиды Число эм-брио-нов, n Уровень развития эмбрионов, % Количесп нов во эмбрио-n (%)
дробление (44... 46 ч) полученные бластоцисты выход бластоцист из блестящей оболочки (10-е сут.) с флуо-ресцент-ным сигналом с выявленным ампли-коном EGFP
7-е сут. 10-е сут.
I 18 кольцевая 25 88,0 20,0 32,0 62,5 5 (20,0) 6 (24,0) II 26 кольцевая 25 80,0 24,0 28,0 85,7 1 (4,0) 1 (4,0)* III 250 кольцевая 12 75,0 25,0 33,3 50,0 1 (8,3) 1 (8,3) IV 13 линеаризо- 25 75,0 16,7 37,5 77,8 1 (4,0) 1 (4,0)* ванная
*значения статистически значимо отличаются от полученных в группе I (хи-квадрат Пирсона, p < 0,05).
Динамика развития эмбрионов в экспериментальных группах существенно не отличалась от контроля, однако наблюдали тенденцию к снижению выхода бластоцист на 7-е и 10-е сутки развития вне зависимости от концентрации плазмиды и пропорции ДНК : липосомы (табл. 1).
Экспрессия целевого гена EGFP в эмбрионах во всех экспериментальных группах начиналась на 3.4 сут. развития (2.3 сут. после микроинъекции). На начало экспрессии целевого гена влиял только возраст эмбриона, а не его стадия развития. Во всех эмбрионах с флуоресцентным сигналом отмечена мозаичная экспрессия целевого гена. Процент эмбрионов, экспрессирующих целевой ген, оставался низким во всех экспериментальных группах кроме I, вне зависимости от концентрации плазмиды в инъекционной смеси (см. табл.1). Также в процессе культивирования наблюдали исчезновение флуоресцентного сигнала в одном или нескольких эмбрионах к 12-м сут. культивирования во всех группах. Стадии бластоцисты достиг только один экспрессирующий EGFP эмбрион - в группе IV (см. рисунок).
После выделения ДНК из трансфецированных кольцевой плазмидой pEGFP-N1 эмбрионов в возрасте 12 сут. и проведения полимеразной цепной реакции с прайме-рами С1^ и С1-Я наличие плазмиды было обнаружено во всех эмбрионах, экспрес-сировавших EGFP в процессе развития (см. табл.1), даже в случае остановки развития на стадиях делений дробления и морулы, а также в одной из бластоцист в группе I, не имевшей флуоресцентного сигнала на всем протяжении культивирования.
В эксперименте 2 были впервые получены положительные результаты использования метода липофекции при работе с лишенным блестящей оболочки ооцитам и зиготам крупного рогатого скота (табл. 2).
Неудачи предшествующих исследований [8] могут быть связаны с возрастом трансфецируемых эмбрионов и продолжительностью инкубации зигот с комплекса-
ми - зиготы в возрасте 16 ч после начала оплодотворения инкубировали с комплексами ДНК-липомосомы в течение 3 ч. У зигот крупного рогатого скота отмечена следующая динамика развития после оплодотворения in vitro: через 8 ч после начала оплодотворения пронуклеусы формировались у 40 % зигот, через 12 ч - у 73 %. Величина этого показателя оставалась относительно стабильной в течение последующих 12 ч. Активный синтез ДНК наблюдали в интервале от 16 до 20 ч после начала оплодотворения [11, 12], вступление в стадию митоза первого деления дробления - впервые через 24 ч [11, 12, 13]. В течение последующих 4 ч количество эмбрионов, вступивших в первое деление дробление или окончивших его, достигало 35 %, к 32 ч - 52 %, на стадии пронуклеусов к этому времени оставалось только около 25 % зигот [11]. Таким образом, у большинства зигот крупного рогатого скота до 24 ч после начала оплодотворения сохранялась целостность мембран пронуклеусов. В то же время в интервале от 24 до 32 ч около трех четвертей морфологически нор-
Ф
В
V
■РВ
Рисунок. Полученные in vitro эмбрионы крупного рогатого скота, трансфецированные путем введения комплекса ДНК-липосомы (линеаризованная pEGFP-N1, IV группа) в цитоплазму зиготы через 18...22 ч после начала оплодотворения: А) эмбрионы в возрасте 7 сут. (проходящий свет); B) эмбрионы в возрасте 7 сут. (флуоресцентный фильтр — FITC); C) бластоциста в возрасте 9 сут. на стадии выхода из блестящей оболочки (проходящий свет); D) бластоциста в возрасте 9 сут. на стадии выхода из блестящей оболочки (флуоресцентный фильтр — FITC).
Таблица 2. Результаты трансфекции полученных in vitro зигот КРС, лишенных блестящей оболочки, путем
инкубации с комплексами ДНК-липосомы
Группа Время начала трансфекции после IVF, ч Тип плазмиды Число эмбрионов, n Количество эмбрионов с флуоресцентным сигналом, n (%) Получено бластоцист на 8-е сут. развития, n (%)
7-е сут. развития 8-е сут. развития всего из них с флуоресцентным сигналом из них с выявленным ампли-коном TurboGFP
I 18 кольцевая 12 2 (16,7) 2 (16,7)* 3 (25,0) 1 (33,3) 3 (100,0)
II 22 кольцевая 15 7 (46,7) 7 (46,7) 0 (0,0)** - -
III 24 кольцевая 35 10 (28,6) 11 (31,4) 1 (2,9)** 0 (0,0) 0 (0,0)
IV 27 кольцевая 33 15 (45,5) 17 (51,5)* 7 (21,2) 7 (100,0) 7 (100,0)
V 18 линеаризо- 12 4 (33,3) 4 (33,3) 3 (25,0) 2 (66,7) 2 (66,7)
ванная
VI 27 линеаризо- 13 4 (30,8) 4 (30,8) 1 (7,7)** 1 (100,0) 1 (100,0)
ванная
*значения статистически значимо различаются между собой (хи-квадрат Пирсона, р < 0,05); **значения статистически значимо отличаются от контроля (21,4 %, хи-квадрат Пирсона, р < 0,05).
мальных зигот вступали в стадию митоза первого деления дробления, в течение которой ядерный материал зиготы контактирует непосредственно с цитоплазмой. Продолжительность М-фазы в значительной мере определяет время, необходимое для образования функционального метафазного веретена и правильного расположения всех хромосом на метафазной пластинке [14]. Вероятно, выбор 16-и часовых зигот для проведения трансфекции [8] был обусловлен фазой активного синтеза ДНК в пронуклеусах [11]. Однако для попадания в пронуклеусы в этот период экзогенная ДНК должна преодолеть плазматическую мембрану и ядерную мембрану пронуклеусов зиготы, избегая при этом воздействия ДНК-азы в цитоплазме.
Учитывая изложенное, мы решили сместить время начала трансфекции лишенных блестящей оболочки зигот крупного рогатого скота путем липофекции с учетом продолжительности периода стабильности комплексов ДНК-липосомы (6 ч) к18, 22, 24 и 27 ч после начала оплодотворения in vitro. Также была увеличена продолжительность инкубации зигот с комплексами.
Уровень дробления zona-free эмбрионов, трансфеци-рованных методом липофекции, в среднем не опускался ниже 86,7 % и статистически достоверно не отличался от величины этого показателя в контроле (92,9 %, хи-квадрат Пирсона, p < 0,05). Экспрессия TurboGFP во всех группахна-чиналась на 5...6 сут. культивирования, то есть в среднем на 2-е сут. позже начала экспрессии EGFP в микроинъециро-ванных эмбрионах. В этом возрасте нормально развивающиеся in vitro эмбрионы крупного рогатого скота достигают стадии развития морулы, компактной морулы или ранней бластоцисты. Наибольшее количество эмбрионов, экспрес-сирующих репортерный ген, наблюдали на 8-е сут. развития (см. табл. 2). К 12-м сут. развития флуоресцентный сигнал затухал до 57.75 % от максимального в опыте (8-е сут.) во всех экспериментальных группах, кроме зигот, трансфеци-рованных в возрасте 18 ч (2/2 эмбрионов, группа I).
Из литературных источников известно, что значимая часть генов, участвующих в преимплантационном развитии, активируется на стадии 8.16 клеток [15]. В то же время, экспрессия репортерного гена у эмбрионов, подвергшихся липофекции, начиналась вне зависимости от стадии их развития, как и в случае с микроинъциро-ванными эмбрионами. Наиболее высокие результаты трансфекции отмечены в одном из повторов в группе IV, в которой количество эмбрионов, экспрессирующих репортерный ген, на 6-е, 7-е и 8-е сут. развития составляло 73 %. Флуоресцентный сигнал наблюдали во всех бластоцистах в этом варианте на 8-е сут. развития.
Выход бластоцист на 8-е сут. развития составлял соответственно в группах, трансфецированых кольце-
вой плазмидой 25,0; 0; 2,9; 21,2 %; линеарной - 25,0 и 7,7 %. Результаты, полученные в группах II, III и VI статистически значимо отличались от контрольных (21,4 %, хи-квадрат Пирсона, р < 0,05).
Исходя из результатов первого эксперимента, для выделения тотальной ДНК из эмбрионов и проведения ПЦР в каждой из опытных групп использовали только эмбрионы, достигшие стадии развития бластоцисты. Ген ТигЬс^Р был обнаружен в 100 % бластоцист, транс-фецированных с использованием комплекса кольцевая плазмида-липосомы (в 3/3 и 7/7 бластоцистах в группах I и IV соответственно), в том числе в тех, у которых не отмечали флуоресцентного сигнала на всем протяжении культивирования или потерявших его после 9.12 сут. развития. Исключение составили группы II (отсутствие бластоцист) и III (1 бластоциста без флуоресцентного сигнала). При использовании линеаризованной плазмиды pTurboGFP-N целевой ген выявили у 66,7 % бластоцист (2/3) в группе V и у единственной полученной бластоцисты в группе VI.
Обнаружение целевого гена в не имевших флуоресцентного сигнала эмбрионах в экспериментах 1 и 2 свидетельствует, что эффективность доставки экзогенной ДНК в зиготы КРС при помощи описанных методов несколько выше, чем позволяет судить оценка по наличию флуоресцентного сигнала. Отсутствие экспрессии гена в эмбрионе или в его отдельных бластомерах может быть связано со случайным характером интеграции вносимой последовательности ДНК в геном эмбриона [16, 17]. Мозаицизм эмбрионов также может быть связан со сроками интеграции. Например, в некоторых источниках высказывается предположение, что интеграция экзогенной ДНК при трансфекции зигот происходит после первого деления дробления, что приводит к различным паттернам интеграции экзогенной ДНК в отдельных бластомерах эмбриона [18]. Возможным решением этой проблемы может стать использование искусственных нуклеаз с доменами «цинковых пальцев» нуклеаз с
доменами аналогов активаторов транскрипции (TALENs) или СИБРЯ-ассоциированных нуклеаз (CRISPR/Cas9), позволяющих интегрировать целевую последовательность ДНК в необходимый участок генома [19, 20]. Отсутствие экспрессии целевого гена в целом снижает показатели эффективности метода трансфекции, по сравнению с эффективностью самой процедуры доставки, так как этот ген не будет экспрессироваться ни в эмбрионах, ни в тканях телят, полученных после их трансплантации.
Выводы. Метод доставки экзогенной ДНК в зиготы КРС путем микроинъекции комплексов ДНК-липосомы в цитоплазму, несмотря на относительную техническую простоту, обладает низкой воспроизводимостью, а у полученных трансфецированных эмбрионов в большинстве случаев
отмечена мозаичная экспрессия целевого гена. Изменение концентрации плазмиды pEGFP-N1 в инъекционной смеси и изначального соотношения ДНК: липосомы существенно не повлияло на долю эмбрионов, экспрессировавших целевой ген. После выделения тотальной ДНК на 12-е сут. развития и проведения ПЦР целевой ген обнаружен в эмбрионах с флуоресцентным сигналом, а также в бластоцисте, в которой флуоресцентный сигнал не наблюдали на протяжении всего периода культивирования.
При трансфекции путем инкубации зигот без блестящей оболочки с комплексами ДНК-липосомы в экспериментальных группах выявлено от 16,7 до 51,5 % эмбрионов, экспрессирующих ген TurboGFP. Больше всего (51,5 %) их было при использовании кольцевой плазми-
ды pTurboGFP-N и смещении начала трансфекции к 27 ч после постановки на оплодотворение. По результатам ПЦР целевой ген обнаружен в 66,7.100,0 % бластоцист, полученных путем инкубации лишенных блестящей оболочки зигот КРС с комплексами ДНК-липосомы с 18 по 27 ч после постановки на оплодотворение.
Впервые получен положительный результат при использовании комплексов ДНК-липосомы для неин-вазивной трансфекции лишенных блестящей оболочки зигот крупного рогатого скота. Влияние времени начала трансфекции на развитие эмбрионов до бластоцисты требует дальнейшего изучения, однако процент эмбрионов, экспрессирующих целевой ген, возрастает уже при инкубации 22-часовых зигот.
Литература.
1. Kim T. K., Eberwine J. H. Mammalian cell transfection: the present and the future //Anal Bioanal Chem. 2010. Vol. 397. No. 8. Pp. 31733178.
2. Electrotransfection and lipofection show comparable efficiency for in vitro gene delivery of primary human myoblasts/T. Mars, M. Strazisar, K. Mis, etc. // J Membr Biol. 2015. Vol. 248. Pp. 273-283.
3. Gordon I. Laboratory Production of Cattle Embryos. 2nd Ed. CABI Publishing, 2003. Pp. 548.
4. Recent advances in micromanipulation and transgenesis in domestic mammals / D. Salamone, R. Bevaqua, F. P. Bonnet, etc. // Acta Scientiae Veterinariae. 2011. Vol. 39. Suppl. 1. Pp. S285-s293.
5. Transgene expression of green fluorescent protein and germ line transmission in cloned calves derived from in vitro-transfected somatic cells/V. Bordingnon, R. Keyston, A. Lazaris, etc.//BiolReprod. 2003. Vol. 68. Pp. 2013-2023.
6. Apoptosis of transgenic cloned and recloned bovine blastocysts / G. Sun, R. Li, Y. Dai, etc. // Progress in Natural Science. 2009. Vol. 19. No. 7. Pp. 821-826.
7. Efficient delivery of DNA into bovine preimplantation embryos by multiwall carbon nanotubes/M. Munk, L. O. Ladeira, B. C. Carvalho, etc. //Sci Rep. 2016. Vol. 6. Pp. 1-10.
8. Vichera G., Moro L., Salamone D. Efficient transgene expression in IVFand parthenogenetic bovine embryos by intracytoplasmic injection ofDNA-liposome complexes//Reprod. Dom. Anim. 2011. Vol. 46. No. 2. Pp. 214-220.
9. DNA fragmentation, transgene expression and embryo development after intracytoplasmic injection of DNA-liposome complexes in IVF bovine zygotes / G. Vichera, L. N. Moro, C. Buemo, etc. //Zygote. 2012. Vol. 22. No. 2. Pp. 195-203.
10. New method for culture ofzona-included or zona-free embryos: the Well of the Well (WOW) system / G. Vajta, T. T. Peura, P. Holm, etc. // Mol Reprod Dev. 2000. Vol. 55. Pp. 256-264.
11. The localization of LAP2beta in bovine oocytes after in vitro activation and fertilization / M. Isaji, H. Iwata, H. Harayama, etc. //Zygote. 2004. Vol. 12. № 1. Pp. 81-93.
12. Abdalla H., Hirabayashi M., Hochi S. Demethylation Dynamics of the Paternal Genome in Pronuclear-Stage Bovine Zygotes Produced by In Vitro Fertilization and Ooplasmic Injection of Freeze-Thawed or Freeze-Dried Spermatozoa //J Reprod Dev. 2009. Vol. 55. Pp. 433-439.
13. Genome activation in bovine embryos: review of the literature and new insights from rNa sequencing experiments/A. Graf, S. Krebs, M. Heininen-Brown, etc.//Anim Reprod Sci. 2014. Vol. 149. No. 1-2. Pp. 46-58.
14. Ciemerych M. A., Maro B., Kubiak J. Z. Control of duration of the first two mitoses in a mouse embryo //Zygote. 1999. Vol. 7. Pp. 293-300
15. Fine mapping of genome activation in bovine embryos by RNAsequencing / A. Graf, S. Krebs, V. Zakhartchenko, etc. // Proc Natl Acad Sci USA. 2014. Vol. 111. Pp. 4139-4144.
16. Rossant J., Nutter L. M. J., Gertsenstein M. Engineering the embryo//Proc Natl Acad Sci USA. 2011. Vol. 108. No. 19. Pp. 7659-7660.
17. Production of IVF transgene-expressing bovine embryos using a novel strategy based on cell cycle inhibitors / R. J. Bevacua, F. Pereyra-Bonnet, R. Olivera, etc. // Theriogenology. 2012. Vol. 78. No.1. Pp. 57-68.
18. Analysis of Transgenic Mosaicism in Microinjected Mouse Embryos Using Fluorescence In Situ Hybridization at Various Developmental Time Points/J. Lewis-Williams, M. Harvey, B. Wilburn, etc.//Theriogenology. 1996. Vol. 45. № 1. P. 335.
19. Simple gene transfertechnique based on I-Scel meganuclease and cytoplasmic injection in IVF bovine embryos/R. J. Bevacqua, N. G. Canel, M. I. Hiriart, etc.//Theriogenology. 2013. Vol. 80. No.2. Pp. 104-113.
20. Gaj T., Gersback C. A., Barbas C. F. ZFN, TALEN and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering//Trends Biotechnol. 2013. Vol. 31. No. 7. Pp. 397-405.
Efficiency of Methods for the Delivery of Exogenous DNA to Bovine in vitro Zygotes
Using Liposomes
A. B. Romanova, E. V. Kornienko, S. N. Kovalchuk
Center for Experimental Embryology and Reproductive Biotechnology, ul. Kostyakova, 12, str. 4, Moskva, 127422, Russian Federation Abstract. The efficiency of delivery methods for exogenous DNA into bovine in vitro zygotes using liposomes was evaluated. The methods were microinjection of plasmid-liposome complexes into the cytoplasm of zygotes and lipofection of bovine zygotes devoid of a shiny coat. Microinjection was performed in 18-22 h after the start of fertilization, the concentration of the circular plasmid pEGFP-N1 in the injection solution was 18, 26, 250 microg/mL, of the linearized plasmid - 13 microg/mL; the number of embryos was 25, 25, 12 and 25, respectively. Increase in the plasmid concentration did not significantly affect the dynamics of embryo development in vitro and the percentage of embryos expressing the target EGFP gene. All embryos with a fluorescent signal showed a mosaic pattern of expression of the target gene. The fluorescent signal was observed only in 1 blastocyst obtained by microinjection of the linearized plasmid in the complex with liposomes. The efficiency of the method turned out to be low (4.0-8.3%), with the exception of the group where the plasmid concentration was 18 microg/mL (20.0%). For the first time, the effectiveness of the transfection method of zygotes, devoid of the shiny coat, by lipofection for cattle was shown. The start time of transfection with a circular plasmid was in 18, 22, 24, 27 hours from the start of fertilization, the number of embryos was 12, 15, 35, 33; for a linearized plasmid the start time was in 18 and 27 hours from the start of fertilization, and the number was 12 and 13 embryos, respectively. The highest percentage of embryos expressing the TurboGFP gene (51.5%) was observed when transfected in 27 h after the start of fertilization using the circular plasmid. When lipofection was performed using the linearized plasmid, the change in the time of transfection from 18 to 27 h did not significantly affect the value of this indicator (33.3 and 30.8%, respectively). The lipofection method seems promising for non-invasive transfection of bovine zygotes devoid of the shiny coat. Keywords: cattle; zygote; transgeneration; liposomes; microinjection.
Author Details: A. B. Romanova, junior research fellow; E. V. Kornienko, research fellow; S. N. Kovalchuk, Cand. Sc. (Biol.), acting director (е-mail: [email protected]).
For citation: Romanova A. B., Kornienko E. V, Kovalchuk S.N. Efficiency of Methods for the Delivery of Exogenous DNA to Bovine in vitro Zygotes Using Liposomes. DostizheniyanaukiitekhnikiAPK. 2018. Vol. 32. No. 10. Pp. 69-73 (in Russ.). DOI: 10.24411/0235-2451-2018-11016.
