Научная статья на тему 'Витрификация дозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота в триацетатцеллюлозных полых волокнах'

Витрификация дозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота в триацетатцеллюлозных полых волокнах Текст научной статьи по специальности «Агробиотехнологии»

CC BY
159
52
Поделиться
Ключевые слова
ооцит / витрификация / крупный рогатый скот / триацетатцеллюлозные полые волокна / oocyte / vitrification / cattle / triacetate cellulose hollow fibers

Аннотация научной статьи по агробиотехнологии, автор научной работы — Е. В. Корниенко, М. А. Иконописцева, Г. П. Маленко

Цель работы – повышение эффективности метода витрификации в триацетатцеллюлозных полых волокнах при криоконсервации дозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота (КРС). Эксперименты проводили в 2017–2018 гг. При витрификации/отогревании ооцитов использовали базовую среду TLP-HEPES c 20 % фетальной сыворотки крови КРС, приготовленную с добавлением (TH20) или без добавления (TH20–) солей кальция. В качестве проникающего криопротектора вместе с базовой средой TH20– использовали только этиленгликоль, а с базовой средой TH20 – этиленгликоль и диметилсульфоксид. Дозревшие in vitro ооциты КРС после групповой витрификации в полых волокнах демонстрировали высокий уровень выживания (80,3±1,5 и 79,0±8,5 %) и оплодотворения (83,9±7,9 и 84,4±18,1 % соответственно). В группе TH20– бластоцисты были получены только в 50 % повторов (всего 6 повторов, 140 ооцитов), в группе TH20 в 66,7 % повторов (всего 3 повтора, 65 ооцитов). На 7-е и 10-е сутки культивирования в группе TH20– выход эмбрионов на стадии бластоцисты составил 1,9±3,2 (1 из 51 эмбрионов) и 5,9±0,6 % (3 из 51) соответственно; в группе TH20 – 3,1±4,4 (1 из 48 эмбрионов) и 7,8±6,6 % (3 из 48) соответственно, что сопоставимо с развитием эмбрионов после витрификации дозревших in vitro ооцитов КРС с использованием носителей открытого типа. Выход бластоцист из блестящей оболочки наблюдали только в группе TH20– (3 из 3), что указывает на возможность дальнейшей модификации протокола витрификации ооцитов КРС в полых волокнах путем снижения влияния ионов Ca2+ во время обработки в растворах витрификации/ отогревания. Успешное применение методики групповой витрификации в триацетатцеллюлозных полых волокнах дозревших in vitro ооцитов КРС было продемонстрировано впервые.

Похожие темы научных работ по агробиотехнологии , автор научной работы — Е. В. Корниенко, М. А. Иконописцева, Г. П. Маленко

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

VITRIFICATION OF IN VITRO MATURED BOVINE OOCYTES IN TRIACETATE CELLULOSE HOLLOW FIBERS

The goal of the current work was to enhance the effectiveness of vitrification in triacetate cellulose hollow fiber at cryopreservation of in vitro matured bovine oocytes. Experiments were carried out in 2017–2018. For vitrification/rewarming of oocytes the basic medium TLP-HEPES with 20% of bovine fetal serum was used, prepared either with (TH20) or without (TH20–) calcium salts. In the case of TH20– medium, only ethylene glycol was used as permeating cryoprotectant. In the case of TH20 medium, we used both ethylene glycol and dimethyl sulfoxide. In vitro matured bovine oocytes demonstrated high survival ((80.3 ± 1.5)% and (79.0 ± 8.5)%) and fertilization ((83.9 ± 7.9)% and (84.4 ± 18.1)%) rates in groups TH20 and TH20–, correspondingly. In TH20– group, blastocysts were obtained only in 50% of repeats (6 repeats in total, 140 oocytes); in TH20 group they were obtained in 66.7% of repeats (3 repeats in total, 65 oocytes). On the 7th and the 10th days of culture in group TH20, the output of embryos on the blastocyst stage was (3.1 ± 4.4)% (1/48) and (7.8 ± 6.6)% (3/48), correspondingly. In group TH20– the output was (1.9 ± 3.2)% (1/51) and (5.9 ± 0.6)% (3/51), respectively. These results are comparable with the vitrification of in vitro matured bovine oocytes using various open-type devices. Blastocyst hatching was observed only in group TH20– (3/3), which indicates a possibility of the protocol modification via decreasing of Ca2+ effect during incubation in vitrification/rewarming solutions. In the current work for the first time the effective use of the method of the group vitrification in triacetate cellulose hollow fibers of in vitro matured bovine oocytes was demonstrated.

Текст научной работы на тему «Витрификация дозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота в триацетатцеллюлозных полых волокнах»

DOI: 10.24411/0235-2451-2018-10920 УДК 591.3:59.085

ВИТРИФИКАЦИЯ ДОЗРЕВШИХ IN VITRO ООЦИТОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

В ТРИАЦЕТАТЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ ПОЛЫХ ВОЛОКНАХ

Е. В. КОРНИЕНКО1, научный сотрудник (e-mail: kornienko.katerina@gmail.com)

М. А. ИКОНОПИСЦЕВА2, магистрант

Г. П. МАЛЕНКО1, доктор биологических наук, зав. отделом

Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий, ул. Костякова, 12, стр. 4, Москва, 127422, Российская Федерация

2Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, Ленинские горы, 1, стр. 12, Москва, 119991, Российская Федерация

Резюме. Цель работы - повышение эффективности метода витрификации в триацетатцеллюлозных полых волокнах при криоконсервации дозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота (КРС). Эксперименты проводили в 2017-2018 гг. При витрификации/отогревании ооцитов использовали базовую среду TLP-HEPES c 20 % фетальной сыворотки крови КРС, приготовленную с добавлением (TH20) или без добавления (TH20-) солей кальция. В качестве проникающего криопротектора вместе с базовой средой TH20-использовали только этиленгликоль, а с базовой средой TH20 - этиленгликоль и диметилсульфоксид. Дозревшие in vitro ооциты КРС после групповой витрификации в полых волокнах демонстрировали высокий уровень выживания (80,3±1,5 и 79,0±8,5 %) и оплодотворения (83,9±7,9 и 84,4±18,1 % соответственно). В группе TH20- бластоцисты были получены только в 50 % повторов (всего 6 повторов, 140 ооцитов), в группе TH20 в 66,7 % повторов (всего 3 повтора, 65 ооцитов). На 7-е и 10-е сутки культивирования в группе TH20- выход эмбрионов на стадии бластоцисты составил 1,9±3,2 (1 из 51 эмбрионов) и 5,9±0,6 % (3 из 51) соответственно; в группе TH20 - 3,1±4,4 (1 из 48 эмбрионов) и 7,8±6,6 % (3 из 48) соответственно, что сопоставимо с развитием эмбрионов после витрификации дозревших in vitro ооцитов КРС с использованием носителей открытого типа. Выход бластоцист из блестящей оболочки наблюдали только в группе TH20- (3 из 3), что указывает на возможность дальнейшей модификации протокола витрификации ооцитов КРС в полых волокнах путем снижения влияния ионов Ca2+ во время обработки в растворах витрификации/ отогревания. Успешное применение методики групповой витрификации в триацетатцеллюлозных полых волокнах дозревших in vitro ооцитов КРС было продемонстрировано впервые.

Ключевые слова: ооцит, витрификация, крупный рогатый скот, триацетатцеллюлозные полые волокна. Для цитирования: Корниенко Е. В., Иконописцева М. А., Маленко Г. П. Витрификация дозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота в триацетатцеллюлозных полых волокнах // Достижения науки и техники АПК. 2018. Т. 32. № 9. С. 84-88. DOI: 10.24411/0235-2451-2018-10920.

Успешное применение метода витрификации для криоконсервации ооцитов и ранних эмбрионов в течение последних 10...15 лет изменило эффективность применения вспомогательных репродуктивных методов в медицине, а также существенно улучшило возможности создания криобанков гамет, эмбрионов и соматических клеток животных [1]. Заменив собой в большинстве случаев традиционное медленное замораживание, витрификация позволила получить высокие воспроизводимые уровни выживания (до 99 %) и оплодотворения (до 93 %) ооцитов, а также приживляемости полученных эмбрионов (до 65,2 %)

у человека [2]. Однако, несмотря на все успехи применения этого метода при криоконсервации ооцитов человека, приматов и мыши, до сих пор не существует единого протокола витрификации ооцитов крупного рогатого скота (КРС), а результаты, полученные различными группами исследователей, заметно отличаются [3, 4].

Изначально принцип витрификации в минимальном объеме (minimum volume cooling) позволил увеличить процент бластоцист, получаемых после оплодотворения криоконсервированных ооцитов КРС, до 15...25 % от общего количества культивируемых эмбрионов [5, 6], что существенно превышало результаты медленного замораживания по программе (2.10 %) [3]. Несмотря на первоначальный успех и обилие предлагаемых методик, эффективность витрификации ооцитов КРС остается ниже результатов двадцатилетней давности и может существенно варьировать даже при использовании одинаковых протоколов витрификации/отогревания [3, 7], что делает имеющиеся способы малопригодными для использования в практике промышленного скотоводства. Разработка методики витрификации, позволяющей сохранять жизнеспособность ооцитов КРС на высоком уровне после криоконсервации, представляется перспективной для использования в программах селекции и воспроизводства КРС, сохранения разнообразия пород и внедрения в практику сельского хозяйства биотехнологических методов, например, клонирования и трансгеноза.

Один из важных факторов при этом, особенно в случае применения принципа витрификации в минимальном объеме, - опыт и мастерство оператора [8]. В этой связи необходим поиск возможностей упрощения и стандартизации процедур обработки ооцитов в растворах криопротекторов, витрификации и отогревания. Такую возможность предоставил предложенный Matsunari et al. [9] метод витрификации в триацетатцеллюлозных полых волокнах. Он позволил одновременно обрабатывать и витрифицировать группу преимплантационных эмбрионов млекопитающих как единое целое, благодаря использованию в качестве носителя триацетатцеллюлозного полого волокна. Волокна представляют собой полые трубки с внутренним диаметром 160.200 мкм и пористыми стенками толщиной 15 мкм, в просвет которых аспи-рируют эмбрионы на этапе эквилибрации. Метод витрификации в полых волокнах был успешно использован для криоконсервации таких высокочувствительных к холодовым повреждениям объектов, как полученные in vivo и in vitro морулы свиньи [9,10], а также полученных in vitro бластоцист КРС в возрасте 7.9 суток [11].

Цель работы - повышение эффективности применения метода витрификации в триацетатцеллюлозных полых волокнах для криоконсервации дозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота.

Условия, материалы и методы. Исследование проводили в 2017-2018 гг. В работе, кроме отдельно

оговоренных случаев, использовали реактивы фирмы "Sigma-Aldrich" (США). Яичники крупного рогатого скота получали в убойном цехе мясокомбината (г. Железнодорожный Московской обл.) и доставляли в лабораторию в физиологическом растворе при температуре 24...27 °С в течение 3...5 ч. Комплексы ооцит-кумулюс выделяли из антральных фолликулов диаметром 2.8 мм. Ооциты с равномерно гранулированной цитоплазмой, окруженные многослойным плотным или несколько разрыхленным кумулюсом, помещали в среду 199 с солями Эрла ("ПанЭко", Россия) с добавлением 0,66 мМ Na пирувата, 1 мМ L-глутамина, 0,6 мМ L-цистеина, 5 ЕД/мл хориони-ческого гонадотропина (Московский эндокринный завод, Россия), 5 мкг/мл фолликулостимулирующего гормона ("ФСГ-супер", ООО "Агробиомед", Россия), 1 мкг/мл эстрадиола-17р и 10 % фетальной сыворотки крови КРС (ФСК; HyClone, США) и инкубировали в С02-инкубаторе при 38,5 °С в течение 19.20 ч. После дозревания ооциты извлекали из среды и освобождали от клеток кумулюса в растворе гиалуронидазы (1,1 мг/мл) при помощи Vortex. Денудированные ооциты затем использовали для проведения экспериментов.

В качестве контроля использовали денудированные дозревшие in vitro ооциты, не подвергавшиеся витрификации.

Витрификацию и отогревание ооцитов КРС проводили в соответствии со схемой, предложенной Kuwayama et al. [12], с рядом модификаций. Неизменными оставили количество этапов обработки, концентрацию криопротекторов в растворе витрификации и время обработки в растворах отогревания. Модификации вносили в протокол с учетом особенностей носителя и объекта криоконсервации. В качестве носителя для витрификации использовали полупроницаемые триацетатцеллюлозные полые волокна с внутренним диаметром 200 мкм, толщиной стенок 15 мкм и размером пор 7 нм (Nirpo, Япония) в составе разработанного нами устройства [13]. В качестве базовой среды для приготовления растворов витрификации и отогревания ооцитов использовали среду TLP-HEPES [14], дополненную 20 % ФСК, приготовленную с добавлением (группа TH20) или без добавления CaCl2 (группа TH20-). В качестве криопротекторов использовали диметилсульфоксид (ДМСО) и/или этиленгликоль (ЭГ), а также сахарозу. Кроме того, в экспериментальных группах снизили концентрацию криопротекторов в растворе эквили-брации, по сравнению с [12] (табл. 1).

Все растворы, кроме раствора отогревания, использовали при комнатной температуре (22.24 °С). Отогревание проводили при температуре 39 °С.

Группу из 12.17 ооцитов дважды отмывали в базовой среде в течение 5 мин. и переносили в раствор эквилибрации, где ихаспирировали в отрезок полого волокна длиной 2,0 см, при этом столбик раствора с

эмбрионами отделяли с каждой стороны от остального раствора в полом волокне двумя воздушными пробками. В дальнейшем волокно переносили из раствора в раствор при помощи пинцета. Волокно с загруженными ооцитами инкубировали в растворе эквилибрации в течение 15 мин., затем переносили в раствор витрификации на 1 мин. После этого волокно погружали в жидкий азот.

После извлечения из жидкого азота полое волокно с загруженными ооцитами немедленно погружали в раствор отогревания на 1 мин., а затем переносили в раствор разбавления и инкубировали в течение 3 мин. Затем его дважды отмывали в базовой среде в течение 5 мин. В последнем растворе ооциты извлекали из полого волокна, используя воздушные пузырьки в качестве поршня. После отмывания ооциты переносили в среду 199 с солями Эрла и инкубировали не менее 2 ч.

Для оплодотворения использовали сперматозоиды, выделенные из криоконсервированного семени быка (ОАО «ГЦВ», Московская обл.) по методу swim-up. После инкубации в среде 199 ооциты помещали в среду TALP-Fert [14], содержащую 2 мкг/мл гепарина, 20 мкМ Д-пеницилламина, 10 мкМ гипотаурина, 1 мкМ эпинефри на и сперматозоиды быка в конце-трации 0,5 • 106 шт./мл. Оплодотворение проводили в течение 19 ч в СО2-инкубаторе при температуре 38,5 °С.

Через 19 ч после начала оплодотворения оценивали уровень выживания предполагаемых зигот по их морфологии, в частности по целостности плазматической мембраны. После этого часть предполагаемых зигот фиксировали, используя раствор Карнуа (этанол : ледяная уксусная кислота в соотношении 3:1), в течение 2 суток, затем окрашивали ацетолакмоидом. Полученные препараты изучали под микроскопом с фазовым контрастом с целью оценки уровня оплодотворения. Оставшиеся зиготы помещали в модифицированную культуральную среду SOF [14] и культивировали в течение 10 суток в атмосфере, содержащей 5,6 % СО2, 5,7 % О2, 88,7 % N2 при температуре 38,5 °С. Дробление эмбрионов оценивали через 44.46 ч от начала оплодотворения. Количество эмбрионов, достигших стадии развития бластоцисты, учитывали на 7.10 сутки развития. Уровень выхода бластоцист из блестящей оболочки оценивали на 8.10 сутки развития.

Результаты представлены в виде средней арифметической и ее стандартного отклонения. Для статистического анализа полученных данных использовали непараметрический критерий Манна-Уитни (p < 0,05).

Результаты и обсуждение. Средний уровень выживания ооцитов, витрифицированных с использованием TH20 или TH20-, через 19 ч после отогревания составлял 80,3±1,5 % и 79,0±8,5 %, соответственно. В обоих вариантах это было значимо ниже (p < 0,05),

Таблица 1. Состав растворов, использованных для витрификации и отогревания ооцитов

Базовая Концентрация криопротекторов

среда (TLP-HEPES, 20 % ФСК) раствор эквилибрации (v/v) раствор витрификации раствор отогревания раствор разбавления

TH20 TH20- 2,5 % ЭГ, 2,5% ДМСО 3,0 % ЭГ 15,0 % ЭГ, 15,0% ДМСО, 0,5 М сахарозы 30,0% ЭГ, 0,5 М сахарозы 0,5 М сахарозы 0,5 М сахарозы 0,25 М сахарозы 0,25 М сахарозы

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Таблица 2. Результаты оплодотворения дозревших in vitro денудированных контрольных и витрифи-цированных/отогретых ооцитов крупного рогатого скота

Группа Число, n Оплодотворенные, n (%) Полиспермия, n (%)

повторов I ооцитов

Контроль 4 54 50 (95,5±9,1) 17 32,5±19,4)

TH20 3 33 28 (83,9±7,9) 13 39,4±18,3)

TH20- 4 59 48 (84,4±18,1) 15 (29,1±9,3)

чем в контроле - 93,8±8,6 %. Такие высокие показатели выживания дозревших in vitro ооцитов КРС согласуются с результатами других авторов (более 80 %). Однако при этом исследователи наблюдали существенное снижение уровня оплодотворения ооцитов и, как следствие, дробления эмбрионов (менее 20 %) [3, 15, 16]. Проблему низкого уровня оплодотворения в репродуктивной медицине успешно решают путем инъекции сперматозоида в ооплаз-му [2, 3]. Но этот метод при работе с ооцитами КРС менее эффективен из-за более высокого содержания липидов в ооплазме и требующейся в обязательном порядке искусственной активации инъецированных ооцитов. В целом, меньшее оплодотворение и снижение компетенции к развитию полученных эмбрионов препятствуют внедрению в практику животноводства витрификации ооцитов сельскохозяйственных животных [3, 8, 15]. В нашем случае ооциты, выжившие после витрификации в TH20 и TH20-, сохраняли свою способность к оплодотворению и по величине этого показателя не отличались от контрольных (табл. 2).

Результаты эксперимента указывают на то, что при витрификации в полых волокнах при использовании сред с различным содержанием солей кальция, по-видимому, не происходит затвердевания бле-

Таблица 3. Динамика развития эмбрионов после триацетатцеллюлозных полых волокнах

трации сперматозоидов и/или гепарина в среде оплодотворения [14, 17].

При оценке дальнейшего развития зигот, после оплодотворения витрифицированных с использованием TH20- ооцитов, процент дробящихся эмбрионов (42,5±15,7 %, 50/116 эмбрионов) существенно снижался (p < 0,05), по сравнению с контролем (63,0±15,8 %, 91/154 эмбрионов). В случае витрификации с использованием базовой среды TH20 такого эффекта не наблюдали (60,4±18,0 %, 32/54 эмбрионов), что согласуется с данными, полученными при витрификации ооцитов КРС в средах с высокой и низкой концентрацией ионов Ca2+ [15] по протоколу Kuwayama et al. [12]. Также следует отметить, что в нашем случае эмбрионы после оплодотворения in vitro витрифицированных ооцитов развивались до стадии бластоцисты только в 50 % повторов (всего 6 повторов, 140 ооцитов) в группе TH20- и в 66,7 % повторов (всего 3 повтора, 65 ооцитов) в группе TH20.

В контрольной группе бластоцисты начинали формироваться на 7-е сутки развития, их количество значительно увеличилось на 8-е сутки и далее постепенно возрастало в течение всего периода культивирования (табл. 3).

оплодотворения ооцитов, витрифицированных в

Число, n Полученные бластоцисты

Группа повторов эмбрионов 7 суток, n (%) 8 суток, n (%) 9 суток, n (%) 10 суток, n (%)

Контроль TH20 TH20- 6 2 3 154 48 51 23 (17,0±10,3) 1 (3,1±4,4*) 1 (1,9±3,2*) 39 (28,2±11,7) 2 (4,7±2,2*) 3 (5,9±0,6*) 42 (29,6±10,0) 3 (7,8±6,6*) 3 (5,9±0,6*) 44 (30,4±9,6) 3 (7,8±6,6*) 3 (5,9±0,6*)

*статистически значимое отличие от контроля, р<0,05.

стящей оболочки, что у ряда млекопитающих ведет к снижению уровня оплодотворения [3, 15]. Следует также отметить высокий процент полиспермии как в контрольной группе, так и в экспериментальных. В случае с витрифицированными ооцитами из групп TH20 и TH20- это могло быть вызвано нарушением целостности блестящей оболочки при обработке в растворах витрификации/отогревания, в которых наблюдаются значительные изменения объема ооцитов, или непосредственно в процессе витрификации [16]. Однако высокий уровень полиспермии отмечен и в контроле, что может указывать на влияние наличия или отсутствия клеток кумулюса и, в частности, клеток лучистого венца, на эффективность оплодотворения дозревших in vitro ооцитов КРС. Так, при оплодотворении комплексов ооцит-кумулюс КРС по такому же протоколу и с той же концентрацией сперматозоидов (0,5 х 106 сп./мл) средний уровень полиспермии составлял 8,7±1,5 % (собственные неопубликованные данные по результатам проверок оплодотворяющей способности криоконсервированного семени быка за 2014-2018 гг). Добиться снижения величины этого показателя у ооцитов, оплодотворяемых без клеток кумулюса in vitro, можно путем уменьшения концен-

Это соответствует наблюдавшейся ранее динамике развития эмбрионов при стандартном оплодотворении комплексов ооцит-кумулюс [18]. Сопоставим и общий уровень выхода бластоцист на 10-е сутки развития — 30,4±9,6 % и 36,4±4,95 % (контроль и [18] соответственно). Выход бластоцист из блестящей оболочки в контрольной группе начинался на 8-е сутки развития (23,2±15,0 %) и на 10-е сутки составлял 72,5±27,4 %, что также соответствовало показателям развития эмбрионов КРС, полученных в результате оплодотворения комплексов ооцит-кумулюс [18].

В экспериментальных группах наблюдали существенное снижение уровня развития эмбрионов до стадии бластоцисты (см. табл. 3). В целом выход бластоцист на 10-е сутки развития в обеих группах (7,8±6,6 и 5,9±0,6 %) согласуется с результатами, полученными другими исследователями при витрифика-ции дозревших in vitro ооцитов КРС с использованием различных носителей и протоколов [3, 4, 16]. Однако еще раз следует отметить, что не во всех повторах эмбрионы развивались до стадии бластоцисты. В то же время не наблюдали корреляции развития эмбрионов до бластоцисты с долей продробившихся в 44.46 ч. после начала оплодотворения.

В целом развитие эмбрионов в группах TH20- и TH20 задерживалось, по сравнению с контрольными. В группе TH20- большая часть бластоцист появлялась на 8-е сутки развития, а выход из блестящей оболочки (100 %, 3/3) происходил только на 10-е. В группе TH20 хэтчинга не было, а сами бластоцисты обладали меньшим диаметром и более низкой категорией качества (удовлетворительное, согласно ГОСТ 28424-2014), по сравнению с контрольными. Аналогичная задержка в развитии до стадии бластоцисты отмечена после оплодотворения витрифици-рованных/отогретых ооцитов свиньи [19]. Причина такого эффекта, очевидно, обусловлена воздействием криопротекторов и сверхнизких температур на цитоплазму и органеллы ооцита [3, 15, 16]. Так, процедура витрификации вызывает формирование множественных астер около мужского пронуклеуса в ооците КРС. Это, в свою очередь, приводит к нарушению развития и перемещения пронуклеусов, задержке первого деления дробления и, как следствие, к снижению процента эмбрионов, развивающихся до стадии бластоцисты [16].

Витрификация подразумевает процесс перехода вещества из жидкого агрегатного состояния в твердое аморфное без кристаллизации. Чтобы добиться этого эффекта при криоконсервации биологических объектов необходимы сверхвысокие скорости их охлаждения/нагревания и высокая концентрация криопротекторов в растворах витрификации [20]. Сверхвысокой скорости в большинстве современных методик достигают применением принципа охлаждения в минимально возможном объеме (<0,1 мкл) и прямого контакта витрифицируемого образца с жидким азотом. При использовании в качестве носителя триацетатцеллюлозного полого волокна объем столбика раствора, содержащего группу ооцитов или эмбрионов, составляет 0,02.0,04 мкл [11].

Наиболее часто при витрификации ооцитов и эмбрионов млекопитающих используют проникающие криопротекторы ДМСО и ЭГ [14]. Их высокая суммарная концентрация в растворах эквилибрации и витрификации (15 и 30 % соответственно) [12] позволяет предотвратить образование кристаллов льда внутри клетки. Однако в таких концентрациях при длительной инкубации криопротекторы токсичны для ооцитов млекопитающих [3, 7, 21]. В то же время ввиду того, что ооцит крупного рогатого скота достаточно большой (диаметр около 120 мкм) [14], для полноценного и равномерного насыщения всей ооплазмы проникающими криопротекторами требуется более длительный период эквилибрации, по сравнению с клетками меньшего диаметра. С целью соблюдения обоих необходимых условий - уменьшить негативное влияние ЭГ и ДМСО на ооциты КРС и обеспечить оптимальное насыщение ооплазмы криопротекторами - была снижена их концентрация в растворе эквилибрации по сравнению с общепринятым протоколом Kuwayama et al. [12]. В случае с TH20- до 3 % ЭГ (согласно [7]), с TH20 - до 2,5 % ЭГ и 2,5 % ДМСО (см. табл. 1). При этом продолжительность этапа эквилибрации увеличили до 15 мин. Снижение концентрации проникающих криопротекторов в растворе эквилибрации также приводит к меньшему снижению объема самих ооцитов, по сравнению с обработкой по протоколу Kuwayama et al. [12], что может положительно влиять на их способность переносить криоконсервацию методом витрификации [3,

15]. Известно, что ЭГ и ДМСО вызывают быстрое повышение концентрации ионов Ca2+ в ооплазме. Под воздействием ДМСО увеличение цитоплазма-тической концентрации ионов Ca2+ происходит в основном из-за их выхода из эндоплазматического ретикулума и почти не зависит от наличия этих ионов в окружающем ооцит растворе [21]. Несмотря на то, что запасы ионов Ca2+ в ооцитах КРС, в отличие от ооцитов мыши, сокращаются в процессе дозревания, кальций из эндоплазматического ретикулума играет ведущую роль в активации ооцита после оплодотворения и инициации процессов ведущих к первому делению дробления [22]. В то же время в случае с ЭГ удаление ионов Ca2+ из раствора инкубации приводит к уменьшению наблюдаемого эффекта [21]. Повышение концентрации ионов Ca2+ в ооплазме может приводить к самопроизвольной активации ооцитов, преждевременному запуску кортикальной реакции [14, 15, 21], а также опосредованно негативно влиять на нормальное функционирование цитоскелета (в частности, микротрубочек) и митохондрий [4, 15]. Все эти факторы могут приводить к нарушению процессов мейоза, оплодотворения и развития пре-имплантационного эмбриона, к несвоевременной активации протеаз и фосфолипаз, запуску апоптоза и деградации ооцита [15, 16].

Для предотвращения резкого повышения концентрации свободных ионов Ca2+ в ооплазме были подготовлены растворы витрификации/отогревания на основе базовой среды TH20- с использованием ЭГ в качестве проникающего криопротектора. Ооциты, витрифицированные в этой среде, и полученные из них эмбрионы, уступали ооцитам из группы TH20 только по уровню дробления (42,5±15,7 и 60,4±18,0 % соответственно). При этом бластоцисты в группе TH20-, в отличие от группы TH20, обладали способностью вылупления из блестящей оболочки. Это может косвенно свидетельствовать как о более высокой жизнеспособности эмбрионов группы TH20-, так и об отложенном влиянии ДМСО и растворов витрификации с более высоким содержанием ионов Ca2+ на витрифицируемые ооциты. В то же время при высокой концентрации единственного криопротектора в раствореэквилибрации(15 % пропиленгликоля) и использовании базовой среды без ионов Ca2+ при витрификации дозревших in vitro ооцитов КРС происходило существенное снижение их компетенции к развитию, по сравнению ооцитами, эквилибрировашимися с 7,5 % ДМСО и 7,5 % ЭГ [15]. Однако наблюдавшийся эффект может быть связан именно с токсичным воздействием высокой концентрации криопротектора, что изначально и относили к одному из основных недостатков метода витрификации и преодолели благодаря использованию смесей ДМСО, ЭГ и пропиленгликоля с более низкой концентрацией отдельных веществ [3, 12, 16]. Длительная инкубация дозревших in vitro ооцитов КРС в растворах содержащих 3.4 % ЭГ не влияет на компетенцию к развитию эмбрионов, полученных после их оплодотворения [7].

Выводы. В текущей работе впервые оценена эффективность использования метода витрификации в триацетатцеллюлозных полых волокнах при криоконсервации дозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота. Метод позволил обеспечить достаточно высокий уровень выживания ооцитов (79,0.80,3 %) без существенного снижения способности выживших

верифицированных ооцитов к оплодотворению. Низкая способность полученных зигот к дальнейшему эмбриональному развитию (выход бластоцист на 10-е сутки - 5,9.7,8 %) сопоставима с имеющимися литературными данными. В то же время способность к

выходу из блестящей оболочки бластоцист из группы TH20- указывает на возможность дальнейшей модификации протокола витрификации ооцитов крупного рогатого скота в полых волокнах с целью повышения его эффективности.

Литература.

1. Clinical outcomes following cryopreservation of blastocysts by vitrification or slow freezing: a population-based cohort study /Z. Li, Y. A. Wang, W. Ledger, etc. // Hum Reprod. 2014. Vol. 29 (12). Pp. 2794-801. DOI: 10.1093/humrep/deu246.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

2. Cryopreservation of human oocytes, zygotes, embryos and blastocysts: A comparison study between slow freezing and ultra rapid (vitrification) methods / T. Al-Azawi, S. Tavukcuoglu, A. A. Khaki, etc. // Middle East Fertil. Soc. J. 2013. Vol. 18. No. 4. Pp. 223-232.

3. Bovine oocyte in vitro maturation and cryopreservation: mirage or reality / K. Papis, E. Stachowiak, A. Duda, etc. // Slovak J. Anim. Sci. 2015. Pp. 163.

4. Morato R., Mogas T., Maddox-Hyttel P. Ultrastructure of bovine oocytes exposed to Taxol prior to OPS vitrification // Mol. Reprod. Dev. 2008. Vol. 75. No 8. Pp. 1318-1326.

5. Martino A., Songsasen N., Leibo S. Development into Blastocysts of Bovine Oocytes Cryopreserved by Ultra-Rapid Cooling // Biol. Reprod. 1996. Vol. 54. No. 5. Pp. 1059-1069.

6. Open pulled straw (OPS) vitrification: A new way to reduce cryoinjuries of bovine ova and embryos / G. Vajta, P. Holm, M. Kuwayama, etc. // Mol. Reprod. Dev. 1998. Vol. 51. No 1. Pp. 53-58.

7. Papis K., Shimizu M., Izaike Y. Factors Affecting the Survivability of Bovine Oocytes Vitrified in Droplets // Theriogenology. 2000. Vol. 54. No. 5. Pp. 53-58.

8. Requirements for Cryopreservation of In Vitro-Produced Bovine Embryos by a Standard Method of Vitrification / V. H. Do, S. Walton, S. Catt, etc. // J Vet Sci Anim Husb. 2016. Vol. 4 (1): 102. DOI: 10.15744/2348-9790.4.102

9. Hollow Fiber Vitrification: A Novel Method for Vitrifying Multiple Embryos in a Single Device / H. Matsunari, M. Maehara, K. Nakano, etc. // J. Reprod. Dev. 2012. Vol. 58. No. 5. Pp. 599-608.

10. Hollow Fiber Vitrification Provides a Novel Method for Cryopreserving In Vitro Maturation/Fertilization-Derived Porcine Embryos / M. Maehara, H. Matsunari, K. Honda, etc. // Biol. Reprod. 2012. Vol. 87. No. 6. Pp. 1-8.

11. A new simple and reliable vitrification device based on Hollow Fiber Vitrification (HFV) method evaluated using IVP bovine embryos / G. P. Malenko, E. V. Kornienko, 1.1. Nesterov, etc. //Animal Reproduction. 2017. Vol. 14. No. 2. Pp. 392-399.

12. Highly efficient vitrification method for cryopreservation of human oocytes / Kuwayama M., Vajta G., Kato O., etc. // Reprod. Biomed. Online. 2005. Vol. 11. No. 3. Pp. 300-308.

13. Маленко Г. П., Корниенко Е. В., Косовский Г. Ю. Система и устройство (варианты) для криоконсервации группы ооцитов и эмбрионов млекопитающих по методу витрификации при использовании в качестве носителя полого волокна / Патент РФ № 2584584. 2016.

14. Gordon I. Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd Ed. CABI Publishing, 2003. 548 p.

15. Bovine oocyte membrane permeability and cryosurvival: Effects of different cryoprotectants and calcium in the vitrification media / C. C. Marques, C. Santos-Silva, C. Rodrigues, etc. // Cryobiology. 2018. No. 81. Pp. 4-11.

16. Moussa M., Shu J., Zhang X., Zeng F. Cryopreservation of mammalian oocytes and embryos: current problems and future perspectives // Sci. China Life Sci. 2014. Vol. 57. No. 9. Pp. 903-914.

17. Parish J. J. Bovine in vitro fertilization: In vitro oocyte maturation and sperm capacitation with heparin // Theriogenology. 2014. No. 81. Pp. 67-73.

18. Длительное использование основы среды mSOFпри получении эмбрионов крупного рогатого скота in vitro/Е. В. Корниенко, Г. Ю. Косовский, А. Б. Романова и др. // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. 2016. № 12. С. 97-105.

19. Generation of Live Piglets from Cryopreserved Oocytes for the First Time Using a Defined System for In Vitro Embryo Production /T. Somfai, K. Yoshioka, F. Tanihara, etc.//PLoS ONE. 2014. №9. Vol. 5. [Электронныйресурс]. URL: https://www.ncbi.nlm.nih. gov/pmc/articles/PMC4028240/ (дата обращения: 13.09.2018).

20. Fahy G., Rall W. Vitrification: an overview// Vitrification in Assisted Reproduction, A User's Manual and Trouble-Shooting Guide. London: Informa Healthcare, 2007. Pр. 1-20.

21. Larman M. G., Sheehan C. B., Gardner D. K. Calcium-free vitrification reduces cryoprotectant-induced zona pellucida hardening and increases fertilization rates in mouse oocytes // Reproduction. 2006. Vol. 131. No. 1. Pp. 53-61.

22. Boni R., Tosti A.C.E. Developmental Potential in Bovine Oocytes Is Related to Cumulus-Oocyte Complex Grade, Calcium Current Activity, and Calcium Stores // Biology of Reproduction. 2002. No. 66. Vol. 3. Pp. 836-842.

VITRIFICATION OF IN VITRO MATURED BOVINE OOCYTES IN TRIACETATE CELLULOSE

HOLLOW FIBERS

E. V. Kornienko1, M. A. Ikonopistseva2, G. P. Malenko1

Center for Experimental Embryology and Reproductive Biotechnology, ul. Kostyakova, 12, str. 4, Moskva, 127422, Russian Federation

2Lomonosov Moscow State University, Leninskie gory, 1, str. 12, Moskva, 119991, Russian Federation

Abstract. The goal of the current work was to enhance the effectiveness of vitrification in triacetate cellulose hollow fiber at cryopreservation of in vitro matured bovine oocytes. Experiments were carried out in 2017-2018. For vitrification/rewarming of oocytes the basic medium TLP-HEPES with 20% of bovine fetal serum was used, prepared either with (TH20) or without (TH20-) calcium salts. In the case of TH20- medium, only ethylene glycol was used as permeating cryoprotectant. In the case of TH20 medium, we used both ethylene glycol and dimethyl sulfoxide. In vitro matured bovine oocytes demonstrated high survival ((80.3 ± 1.5)% and (79.0 ± 8.5)%) and fertilization ((83.9 ± 7.9)% and (84.4 ± 18.1)%) rates in groups TH20 and TH20-, correspondingly. In TH20- group, blastocysts were obtained only in 50% of repeats (6 repeats in total, 140 oocytes); in TH20 group they were obtained in 66.7% of repeats (3 repeats in total, 65 oocytes). On the 7th and the 10th days of culture in group TH20, the output of embryos on the blastocyst stage was (3.1 ± 4.4)% (1/48) and (7.8 ± 6.6)% (3/48), correspondingly. In group TH20- the output was (1.9 ± 3.2)% (1/51) and (5.9 ± 0.6)% (3/51), respectively. These results are comparable with the vitrification of in vitro matured bovine oocytes using various open-type devices. Blastocyst hatching was observed only in group TH20- (3/3), which indicates a possibility of the protocol modification via decreasing of Ca2+ effect during incubation in vitrification/rewarming solutions. In the current work for the first time the effective use of the method of the group vitrification in triacetate cellulose hollow fibers of in vitro matured bovine oocytes was demonstrated.

Keywords: oocyte; vitrification; cattle; triacetate cellulose hollow fibers.

Author Details: E. V. Kornienko, research fellow (е-mail: kornienko.katerina@gmail.com); M. A. Ikonopistseva, master's student; G. P. Malenko, D. Sc. (Biol.), head of division.

For citation: Kornienko E. V., Ikonopistseva M. A., Malenko G. P. Vitrification of In Vitro Matured Bovine Oocytes in Triacetate Cellulose Hollow Fibers. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2018. Vol. 32. No. 9. Pp. 84-88 (in Russ.). DOI: 10.24411/0235-2451-2018-10920.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.