CC BY
64
DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10910 УДК 591.3:59.085
Оплодотворение ооцитов крупного рогатого скота с интактным кумулюсом и денудированных
Е. В. КОРНИЕНКО, А. Б. РОМАНОВА, Г. П. МАЛЕНКО
Центр экспериментальной эмбриологии и репродуктивных биотехнологий, ул. Костякова, 12, стр. 4, Москва, 127422, Российская Федерация
Резюме. Клетки кумулюса, окружающие ооцит крупного рогатого скота (КРС), участвуют в процессах его развития и созревания in vivo и in vitro, а также во взаимодействии ооцита со сперматозоидами. Удаление клеток кумулюса перед оплодотворением in vitro обычно приводит к снижению уровня пенетрации ооцитов КРС сперматозоидами. Ранее в рамках используемого протокола у денудированных ооцитов отмечали как высокий общий уровень оплодотворения (83,9...84,4 %), так и высокий уровень полиспермии (29,1...39,4 %). Цель исследований - изучение влияния наличия или отсутствия интактного комплекса ооцит-кумулюс на эффективность оплодотворения дозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота. В работе использовали криоконсервировнное семя двух быков. В процессе исследований оказалось, что оно статистически значимо различается по показателям подвижности и выживаемости сперматозоидов. У денудированных ооцитов статистически значимо возрастал показатель полиспермии (до 29,36.32,32 %), по сравнению с интактными комплексами ооцит-кумулюс (9,90.12,89 %), вне зависимости от использованного семени. При этом общий уровень пенетрации и процент нормального оплодотворения у денудированных ооцитов не снижали своих значений. То есть наличие интактных клеток кумулюса и гиалуронового матрикса - это один из факторов регуляции уровня полиспермии при оплодотворении дозревших in vitro ооцитов КРС. На развитие эмбрионов до стадии бластоцисты in vitro влияли в первую очередь качественные характеристики криоконсервированного семени, а не наличие или отсутствие интактного комплекса ооцит-кумулюс при оплодотворении. При использовании семени быка с более низкими характеристиками подвижности и выживаемости сперматозоидов выход бластоцист на 7 сутки развития был существенно ниже (4,06.4,68 %), чем в варианте с применением более качественного семени (17,13.19,26 %). Эта тенденция сохранялась до завершения культивирования на 10 сутки.
Ключевые слова: клетки кумулюса, крупный рогатый скот, ооциты, оплодотворение in vitro.
Сведения об авторах: Е. В. Корниенко, научный сотрудник (e-mail: kornienko.katerina@gmail.com); А. Б. Романова, младший научный сотрудник (e-mail: romanova1105@gmail.com); Г. П. Маленко, доктор биологических наук, зав. отделом (e-mail: galina_malenko@mail.ru).
Для цитирования: Корниенко Е. В., Романова А. Б., Маленко Г. П. Оплодотворение ооцитов крупного рогатого скота с интактным кумулюсом и денудированных // Достижения науки и техники АПК. 2019. Т. 33. № 9. С. 48-53. DOI: 10.24411/02352451-2019-10910.
Fertilization of Bovine Oocytes with Intact Cumulus and of Denuded Cells
E. V. Kornienko, A. B. Romanova, G. P. Malenko
Center for Experimental Embryology and Reproductive Biotechnology, ul. Kostyakova, 12, str. 4, Moskva, 127422, Russian Federation
Abstract. Cumulus cells surrounding a bovine oocyte are involved in its development and maturation both in vivo and in vitro, as well as in the interaction of the oocyte with spermatozoa. Removal of cumulus cells prior to in vitro fertilization typically decreases the penetration of bovine oocytes by spermatozoa. Previous studies have shown an overall high level of fertilization (83.9-84.4%) and a high level of polyspermia (29.1-39.4%) in denudated oocytes. This research was aimed at investigating the effect of the presence or absence of an intact oocyte-cumulus complex on the efficiency of fertilization of bovine oocytes matured in vitro. The cryopreserved sperm from two bulls was used as experimental material. The sperm was found to be statistically significantly different in terms of motility and survival. Regardless of the sperm used, denudated oocytes demonstrated a statistically significant increase in the polyspermia indicator (up to 29.36-32.32%) compared to intact oocyte-cumulus complexes (9.90-12.89%). Along with that, the overall penetration and normal fertilization rates in denudated oocytes remained at the same level. Therefore, the presence of intact cumulus and hyaluronic matrix cells is considered to be a factor in regulating the level of polyspermia during fertilization of bovine oocytes matured in vitro. The development of embryos up to the blastocyst stage in vitro was primarily affected by the qualitative characteristics of cryopreserved sperm rather than the presence or absence of an intact oocyte-cumulus complex during fertilization. When using bull semen with lower characteristics of sperm motility and survival, the blastocyst yield was significantly lower on the 7th day of development (4.06-4.68%) compared to that with higher characteristics (17.13-19.26%). This trend continued until the completion of cultivation on the 10th day. Keywords: cumulus cells; cattle; oocytes; in vitro fertilization.
Author details: E. V. Kornienko, research fellow (e-mail: kornienko.katerina@gmail.com); A. B. Romanova, junior research fellow (e-mail: romanova1105@gmail.com); G. P. Malenko, D. Sc. (Biol.), head of division (e-mail: galina_malenko@mail.ru). For citation: Kornienko E. V., Romanova A. B., Malenko G. P. Fertilization of Bovine Oocytes with Intact Cumulus and of Denuded Cells. Dostizheniya nauki i tekhniki APK. 2019. Vol. 33. No. 9. Pp. 48-53 (in Russ.). DOI: 10.24411/0235-2451-2019-10910.
Технология получения эмбрионов крупного рогатого скота in vitro (in vitro production, IVP) - это неотъемлемый инструмент при проведении фундаментальных исследований в области биологии развития млекопитающих, который широко распространен в практике мирового промышленного скотоводства. Поворотным в этом процессе можно считать 2017 г., в течение которого производство IVP эмбрионов крупного рогатого скота (КРС) составило сотни тысяч и превысило производство эмбрионов КРС in vivo [1]. Важным фактором, позволяющим расширить применение технологии IVP как в лабо-
раторной, так и в промышленной практике, служит наличие эффективных методов криоконсервации ооцитов. Несмотря на более низкую эффективность, по сравнению с другими видами млекопитающих, и отсутствие стандартизированного протокола, наиболее перспективный метод криоконсервации ооцитов КРС - это витрификация [2, 3]. В рамках решения проблемы выживаемости криоконсервиро-ванных ооцитов КРС и сохранения у них способности к дальнейшему развитию выявлен ряд преимуществ витрификации как незрелых ооцитов, выделенных непосредственно из яичников, так и дозревших in
vitro. У последних одно из таких преимуществ - это отсутствие необходимости сохранения целостности комплекса ооцит-кумулюс [2, 3], которая нужна незрелым ооцитам для завершения процесса дозревания [4, 5, 6].
В наших предыдущих исследованиях возможности витрификации дозревших in vitro денудированных ооцитов КРС в триацетатцеллюлозных полых волокнах при достаточно высоких показателях выживания (79,0...80,3 %) и оплодотворения (83,9...84,4%) была выявлена значительная доля зигот с полиспермией (29,1.39,4 %). Аналогичная ситуация отмечена и в контрольной группе (32,5 %) [7]. При этом применение идентичного протокола оплодотворения при работе с комплексами ооцит-кумулюс (КОК) приводило к значительно более низкому уровню полиспермии (8,7 %) (собственные данные). Высокий уровень полиспермии у денудированных ооцитов (ДО) может негативно влиять на дальнейшее развитие эмбрионов, что особенно важно учитывать при проведении витрификации, которая сама по себе снижает показатели развития [7]. Возможное влияние на результаты оплодотворения in vitro как витрифицированных, так и контрольных ооцитов могло оказать удаление клеток кумулюса (КК). Они участвуют в регуляции развития и созревания ооцита КРС in vivo и in vitro, а также во взаимодействии ооцита со сперматозоидами [4, 5].
Цель исследований - изучение влияния наличия или отсутствия интактного комплекса ооцит-кумулюс на эффективность оплодотворения дозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота.
Условия, материалы и методы. Работа проведена в 2018-2019 гг. Кроме специально оговоренных случаев, использовали реактивы фирмы «Sigma-Aldrich» (США) и имевшееся в наличии криоконсерви-рованное семя двух быков (А и B) в криосоломинках объемом 0,25 мл. Подсчет концентрации сперматозоидов (шт./мл) проводили в камере Горяева. Подвижность и выживаемость оттаянного семени быков оценивали согласно ГОСТ 26030-83. Семя быков разбавляли раствором нейтрализованного цитрата натрия (pH 7,07) в соотношении 1 : 3. Подвижность сперматозоидов определяли в баллах по формуле: П = N х 10/Nn, где N - количество подсчитанных
ппд ' СП' ^ ппд
сперматозоидов с прямолинейным поступательным движением, 10 - постоянный коэффициент, -общее количество подсчитанных сперматозоидов. Оценку подвижности сперматозоидов проводили при температуре 37 °С. Выживаемость оценивали путем определения количества сперматозоидов, сохранивших прямолинейное поступательное движение после 5 ч инкубации оттаянного семени в термостате при температуре 37 °С.
Яичники крупного рогатого скота получали на мясокомбинате (ООО Миккон, Клинский район., Московской области) и доставляли в лабораторию в физиологическом растворе при температуре 26.30 °С в течение 3.5 ч. Комплексы ооцит-кумулюс выделяли из антральных фолликулов диаметром 2.8 мм. Ооци-ты с равномерно гранулированной цитоплазмой, окруженные многослойным плотным или несколько разрыхленным кумулюсом, помещали в среду 199 с солями Эрла («ПанЭко», Россия) с добавлением 0,66 мМ пирувата натрия, 1 мМ L-глутамина, 0,6 мМ L-цистеина, 5 ЕД/мл хорионического гонадотропина (Московский эндокринный завод, Россия), 5 мкг/мл фолликулостимулирующего гормона («ФСГ-супер»,
ООО «Агробиомед», Россия), 1 мкг/мл эстрадиола-17р, 10 % фетальной сыворотки крови КРС (ФСК; HyClone, США) и инкубировали в С02-инкубаторе при 38,5 °С в течение 19.20 часов. После дозревания часть ооцитов освобождали от клеток кумулюса с использованием раствора гиалуронидазы (1,1 мг/мл) и Vortex. КОК и ДО использовали для проведения экспериментов.
Выделение фракции подвижных сперматозоидов из криоконсервированного семени проводили по методу swim-up. После оттаивания на водяной бане при температуре 37.39 °С 90 мкл семени быка помещали на дно пробирки объемом 10 мл, содержащей 1 мл среды TALP-HEPES [8], и инкубировали в течение 1 ч при температуре 38,5 °С. После этого при помощи автоматического дозатора отбирали верхние 0,7 мл среды из пробирки, содержащей подвижную фракцию сперматозоидов, и центрифугировали (300 g) в течение 10 мин. в пробирках объемом 2 мл. После этого при помощи автоматического дозатора из пробирки отбирали 50 мкл осадка. Концентрацию сперматозоидов подсчитывали в камере Горяева. Совместное инкубирование ооцитов и сперматозоидов проводили в среде TALP-Fert с добавлением смеси пеницилламина, гипотаурина и эпинефрина [8] и 0,2 мкг/мл гепарина в течение 18 ч в СО2-инкубаторе при температуре 38,5 °С. День постановки на оплодотворение in vitro (in vitro fertilization, IVF) считали нулевым.
В первом эксперименте КОК (группы I и III) и ДО (группы II и IV) оплодотворяли семенем быков A и B соответственно при концентрации сперматозоидов 0,5 х 106 шт./мл. С учетом результатов первого опыта c целью снижения уровня полиспермии и оптимизации процедуры IVF во втором эксперименте при работе с семенем быка А при оплодотворении ДО концентрацию сперматозоидов в среде TALP-Fert уменьшили до 0,25 х 106 шт./мл (группа V). При работе с семенем быка В необходимо было повысить общий уровень оплодотворения ооцитов, поэтому концентрацию сперматозоидов при IVF увеличили до 1,0 х 106 шт./мл (группы VI и VII). Для каждой группы сделано не менее 3 повторов.
Через 18 ч после начала оплодотворения предполагаемые зиготы из экспериментальных групп I,
Рисунок. Зигота крупного рогатого скота в возрасте 18 ч после начала оплодотворения. FP - женский пронуклеус, МР -мужской пронуклеус, Т - хвост сперматозоида, РВ - полярное тельце. Тотальный препарат, окраска ацетолакмоидом. Фазовый контраст, х 200.
Таблица 1. Оценка подвижности сперматозоидов в криокосервированном семени быков А и В
Семя быка Концентрация сперматозоидов, X 108 шт./мл Сперматозоиды с прямолинейным поступательным движением
0 ч после оттаивания, баллы 5 ч после оттаивания, баллы
а 1,48±0,26 4,51±1,11a 2,93±1,31 в 1,67±0,11 2,69±0,36a <0,50
a - значения с одинаковыми индексами статистически значимо отличаются одно от другого (U-критерии Манна-Уитни, p < 0,05).
III и VI освобождали от клеток кумулюса с помощью Vortex. Часть предполагаемых зигот из всех групп фиксировали, используя раствор Карнуа (этанол : ледяная уксусная кислота - 3 : 1), в течение 2 сут. и затем окрашивали ацетолакмоидом. Полученные препараты изучали под микроскопом с фазовым контрастом с целью оценки уровня оплодотворения, нормального оплодотворения и полиспермии. Нормально оплодотворенными считали зиготы с двумя нормально развитыми пронуклеусами, одним или двумя полярными тельцами и наличием хвоста сперматозоида в цитоплазме (см. рисунок). Остальные зиготы помещали на модифицированную культураль-ную среду SOF [8] и культивировали в течение 10 сут. в атмосфере, содержащей 5,6 % СО2, 5,7 % О2, 88,7 % N2 при температуре 38,5 °С.
Результаты экспериментов представлены в виде среднего процента ± стандартное отклонение; результаты оплодотворения - в виде процента от общего количества зафиксированных предполагаемых зигот; нормальное оплодотворение и полиспермия - процента от оплодотворенных ооцитов; выход бластоцист - процента от общего количества культивируемых эмбрионов. Выход эмбрионов из блестящей оболочки рассчитывали исходя из количества бластоцист, полученных на соответствующий день развития. Результаты обработаны с использованием непараметрического U-критерия Манна-Уитни (p < 0,05).
Результаты и обсуждение. В ходе оценки образцов криоконсервированного семени быков А и В было выявлено, что при сходной концентрации сперматозоидов его качество существенно (p < 0,05) отличалось по показателю подвижности - 4,51 балла и 2,69 балла соответственно (табл. 1).
Более того, через 5 ч инкубации подвижность сперматозоидов семени быка В была ниже минимальной, нормируемой по ГОСТ (0,5 балла). Качество криоконсервированного семени быков может быть одним из наиболее важных факторов, определяющих успех процедуры IVP [8, 9]. Для снижения вариабель-
ности между быками и достижения оптимального уровня оплодотворения ооцитов КРС in vitro требуется подбор индивидуальных условий, в первую очередь концентрации гепарина и сперматозоидов в среде. При этом может не быть корреляции между эффективностью использования криоконсервированного семени быка при искусственном осеменении коров и оплодотворении in vitro дозревших ооцитов [8].
Оценка влияние наличия или отсутствия интакт-ного комплекса ооцит-кумулюс на эффективность оплодотворения дозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота показала, что при использовании семени быка А с более подвижными и жизнеспособными сперматозоидами статистически значимых отличий по общему уровню оплодотворения ДО и КОК выявлено не было (группы I и II, табл. 2). В варианте с семенем быка В с более низкими показателями подвижности сперматозоидов общий уровень оплодотворения ооцитов в составе КОК был существенно ниже, чем при использовании семени быка A (69,57 и 93,61% соответственно, p < 0,05). В случае с ДО (группа IV) подобного эффекта не отмечено. Результаты противоречат данным, приведенным в значительном числе работ по данной теме, показавшим, что удаление КК перед оплодотворением ооцитов КРС in vitro приводило к существенному снижению уровня оплодотворения и/или дробления полученных эмбрионов [10, 11, 12]. На основе таких результатов ряд авторов делает выводы об участии КК в процессах регуляции взаимодействия ооцитов и сперматозоидов КРС in vitro, в частности в процессе капацитации сперматозоидов [8, 13]. Причем было показано, что даже нахождение нескольких интактных КОК среди ДО способствовало улучшению показателей оплодотворения [4]. Однако в случае с применявшимися в нашем исследовании протоколами выделения подвижной фракции сперматозоидов по методу swim-up и оплодотворения, капацитации сперматозоидов способствовали содержащийся в средах TALP-HEPES (swim-up) и TALP-Fert бычий сывороточный альбумин и, в наибольшей степени, добавленный в среду оплодотворения гепарин [8]. Сочетание оптимальных концентраций гепарина (0,2 мкг/мл) и сперматозоидов (0,5 х 106 шт./мл), позволило получить более 90 % оплодотворенных КОК и ДО в варианте с семенем быка А и 89,64 % оплодотворенных ДО при использовании семени быка В.
В то же время при оплодотворении семенем обоих быков ДО существенно возрастала доля оплодотворенных ооцитов с полиспермией (до 32,32 и 29,36 % соответственно, p < 0,05), по сравнению с КОК, при сохранении сходных долей нормально оплодотворенных ооцитов во всех четырех группах (см. табл. 2).
Таблица 2. Результаты оплодотворения дозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота в составе комплексов ооцит-кумулюс (КОК) или денудированных (ДО) при использовании семени быков А и B
Группа Семя быка КОК/ до Всего ооцитов, n Оплодотворено, n (%) Нормально оплодотворено, n (%*) Полиспермия, n (%*)
i a кок 107 101 (93,61 ± 5,63)a 69 (68,73±16,97) 10 (9,90 ± 5,18)c
ii до 108 98 (91,03 ± 6,50) 55 (57,57±13,51) 33 (32,32 ± 12,04)c
iii b кок 74 51 (69,57 ± 11,36)ab 28 (55,65±13,93) 7 (12,89 ± 8,08)d
iv до 106 95 (89,64 ± 7,57)b 59 (59,32±18,31) 26 (29,36 ± 17,54)d
- от оплодотворенных;
а,ь,с,(1 _ значения с одинаковыми индексами статистически значимо отличаются одно от другого (и-критерий Манна-Уитни, р < 0,05).
При этом в рамках каждой отдельной повторности уровень полиспермии у оплодотворенных ДО был выше, чем у оплодотворенных КОК, при использовании семени обоих быков. В опыте минимальная разница составляла 2,7 раза. Эти результаты также противоречат данным, приводимым в научной литературе [10, 11] за исключением отдельных случаев [6, 14]. Прирост доли полиспермии среди оплодотворенных ДО в текущей работе происходил в первую очередь благодаря сокращению доли «ненормально» оплодотворенных ооцитов, основную часть которых составляли ооциты, не возобновившие мейоз после проникновения сперматозоида, а также зиготы с более низкими темпами развития, нарушениями деконденсации ядра сперматозоида и несколькими женскими пронуклеусами. Ооциты КРС, выделяемые из антральных фолликулов яичников КРС в условиях лаборатории, представляют собой предельно гетерогенную популяцию с точки зрения качества и, как следствие, способности к оплодотворению и дальнейшему эмбриональному развитию [6, 8]. Например, если ооцит не оплодотворен в оптимальный для него промежуток времени, процесс дозревания продолжается. Клетка стареет и накапливает активные формы кислорода, что может приводить, в частности, к снижению концентрации факторов, регулирующих ее деление, таких, как MPF (maturation-promoting factor) и MAPKs (mitogen-activated protein kinases), преждевременному выделению кортикальных гранул и полиспермии [6]. Также было показано, что уровень полиспермии при проведении IVF существенно ниже у ооцитов, визуально классифицированных как более качественные по структуре ооплазмы и целостности КОК (4,1.4,5 %), чем у менее качественных с этой точки зрения ооцитов (11,1.9,8 %) [15]. Таким образом, результаты наших исследований указывают на то, что доля полиспермии при оплодотворении ооцитов КРС in vitro после удаления КК возрастала, по-видимому, в первую очередь за счет менее качественных ооцитов.
В целом, повышение уровня полиспермии при оплодотворении ооцитов млекопитающих in vitro, по сравнению с аналогичным показателем in vivo, -это достаточно распространенная проблема [6, 16]. Одной из причин такой ситуации может быть значительно более высокое соотношение сперматозоидов к ооциту in vitro, по сравнению с ситуацией in vivo, где наблюдали «эффект разбавления», и к месту
оплодотворения попадает только незначительное количество мужских гамет [6, 8]. КК и гиалуроновый матрикс достаточно быстро удаляются при взаимодействии КОК с эпителием яйцевода in vivo, но могут препятствовать полиспермии in vitro. Так, в матрикс КОК человека при IVF попадает в среднем около 10 сперматозоидов, лишь один из которых оплодотворяет ооцит [6].
Основной же механизм регуляции полиспермии in vivo - это так называемые быстрый и медленный блоки, первый из которых связан с деполяризацией мембраны ооцита после оплодотворения, а второй -с затвердеванием блестящей оболочки вследствие воздействия протеиназ, выброшенных в перевител-линовое пространство в процессе кортикальной реакции [6, 13, 16]. У млекопитающих могут наблюдать механизмы блокирования полиспермии как отдельно на уровне плазматической мембраны (кролик) или блестящей оболочки (овца, свинья), так и сочетание этих механизмов (мышь) [6]. У КРС после оплодотворения in vitro происходит изменение структуры и механических свойств блестящей оболочки вследствие кортикальной реакции [16, 17, 18]. Однако не происходит существенного повышения ее устойчивости к воздействию протеолитических ферментов в отличие от зигот, полученных in vivo, ферментативное разрушение оболочки которых может занимать часы и даже дни [17, 18]. Более того, устойчивость к воздействию протеиназ приобретается уже неоплодотворенными ооцитами КРС после контакта с микроокружением в яйцеводе благодаря взаимодействию с гликопротеи-нами и гепарин-подобными факторами. Аналогичную модификацию блестящей оболочки наблюдали у вымытых после овуляции из яйцевода ооцитов свиней, и по предположению авторов она могла участвовать в регуляции взаимодействия ооцитов и сперматозоидов in vivo, в том числе и в регуляции полиспермии [17, 18]. При оплодотворении же ооцитов КРС in vitro их блестящая оболочка лишена подобного воздействия, а изменение ее физических свойств после кортикальной реакции недостаточно для полной блокировки полиспермии. Так, энергия, затрачиваемая для механического преодоления сперматозоидом КРС блестящей оболочки зиготы (6,4 х 10-16 Дж), лишь немногим больше той, что необходима в случае с неоплодотворенным ооцитом, и сравнима с механической энергией движения хвоста самого сперматозоида (4,6 х 10-16 Дж) [16]. С учетом
Таблица 3. Динамика развития эмбрионов, полученных в результате оплодотворения дозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота в составе комплексов ооцит-кумулюс или денудированных при использовании семени быков А и B
Выход бластоцист
Число зигот, n 7 сут. 8 сут. 9 сут. 10 сут.
Группа всего, n (%) всего, n (%) вышедшие из блестящей оболочки, n (%) всего, n (%) вышедшие из блестящей оболочки, n (%) всего, n (%) вышедшие из блестящей оболочки, n (%)
i ii iii iv 173 137 76 83 28 (17,13 ± 10,80)a 27 (19,26 ± 10,29)b 3 (4,06 ± 2,40)a 4 (4,68 ± 2,74)b 50 (29,38 ± 15,03)a 38 (26,90 ± 9,69) 10 (13,13 ± 4,10)a 15 (15,85 ± 9,30) 9 (16,34 ± 16,13) 13 (33,63 ± 25,68) 1 (12,50 ± 21,65)* 3 (45,83 ± 36,08) 56 (31,47 ± 15,36) 42 (28,62 ± 11,69) 16 (20,63 ± 8,73) 16 (16,71 ± 10,72) 31 (51,16 ± 20,77) 23 (57,14 ± 17,61) 4 (30,65 ± 13,05) 7 (55,83 ± 26,18) 58 (33,14 ± 13,67) 42 (29,46 ± 11,11) 16 (20,63 ± 8,73) 17 (18,27 ± 9,46) 42 (62,39 ± 24,28) 33 (81,12 ± 11,34) 8 (47,62 ± 8,75) 12 (65,83 ± 25,68)
а-ь - значения с одинаковыми индексами статистически значимо отличаются одно от другого (и-критерий Манна-Уитни, Р < 0,05);
* - выход из блестящей оболочки наблюдали только в одном из четырех повторов.
Таблица 4. Результаты модификации протоколов оплодотворения in vitro ооцитов КРС с использованием семени быков А и В.
Группа Семя быка/ концентрация сперматозоидов, х 106 шт./мл КОК/ДО Всего ооцитов, n Оплодотворено, n (%) Нормально оплодотворено, n (%*) Полиспермия, n (%*)
v vi vii а/0,25 в/1,0 до кок до 41 45 37 37 (91,88 ± 8,34) 40 (89,78 ± 12,06) 28 (74,84 ± 4,83) 23 (62,22 ± 10,72) 28 (70,15 ± 6,37) 17 (62,78 ± 10,21) 11 (30,56 ± 10,84) 1 (2,38) ** 9 (27,22 ± 24,36)
* - от оплодотворенных;
** - зиготы с полиспермией присутствовали только в одном повторе из трех.
этих данных наличие КК и гиалуронового матрик-са может быть одним из факторов, регулирующих уровень полиспермии при оплодотворении ооцитов КРС in vitro при условии нормальной капацитации сперматозоидов.
Несмотря на существенные различия по доли зигот с полиспермией между группами, в которых семенем быков А и В оплодотворяли КОК (группы I и III) и ДО (группы II и IV), статистически значимых отличий по уровню дробления между ними не обнаружено (U-критерий Манна-Уитни, p < 0,05). В группе I уровень дробления составлял 67,3 ± 13,5 % (109/173, 6 повторов), в группе II - 67,5 ± 3,2 % (92/137, 6 повторов), в группе III - 63,4 ± 3,6 % (48/76, 4 повтора), в группе IV - 58,6 ± 10,9 % (39/83, 4 повтора). Как и в случае с общим уровнем оплодотворения, не наблюдали снижения уровня дробления оплодотворенных ДО, по сравнению с КОК, показанное в ряде исследовательских работ [19, 20, 21].
По результатам дальнейшего культивирования полученных эмбрионов следует отметить, что существенных различий (p < 0,05) по показателям эмбрионального развития в результате оплодотворения КОК или ДО при использовании семени быка А (группы I и II) не обнаружено (табл. 3), как и при использовании семени быка В (группы III и IV). Однако более низкое качество семени быка В, по-видимому, оказывало негативное воздействие на развитие полученных эмбрионов. Так, выход бластоцист на 7 сут. культивирования был статистически значимо ниже как в случае с КОК (4,06 % в группе III), так и в случае с ДО (4,68 % в группе IV), по сравнению с соответствующими показателями, полученными при использовании семени быка А (17,13 и 19,26 в группах I и II соответственно). Тенденция к уменьшению выхода бластоцист в группах с оплодотворением семенем быка В сохранялась вплоть до 10 сут. Исходя из результатов, можно заключить, что, несмотря на обнаруженные различия в доле зигот с полиспермией при оплодотворении КОК и ДО, основное влияние на развитие эмбрионов in vitro оказывает качество семени быка. Более того, ранее было установлено, что бластоцисты, полученные при оплодотворении ДО и КОК, статистически значимо не различались по общему количеству клеток и апоптотическому индексу [5]. Хотя данными авторами и было показано, что при удалении КК перед оплодотворением ооцитов КРС in vitro снижался выход бластоцист, по сравнению с результатами, полученными при работе с КОК [5].
В эксперименте 2 при модификации протокола IVF путем снижении концентрации сперматозоидов
быка A в среде TALP-Fert в 2 раза (табл. 4) показатели общего (91,88 ± 8,34 %) и нормального оплодотворения денудированных ооцитов (62,22 ± 10,72 %), а также уровня полиспермии (30,56 ± 10,84 %) практически не изменились, по сравнению с использованием семени в концентрации 0,5 х 106 шт./ мл (см. табл. 2, группа II). В результате увеличения концентрации семени быка B до 1 х 106 шт./мл при оплодотворении денудированных ооцитов они также остались на прежнем (см. табл. 2, группа IV) уровне. Однако уровень оплодотворения ооцитов в составе КОК повысился до 89,78 ± 12,06 %, достоверно (p < 0,05) отличаясь от предыдущего показателя (69,57 ± 11,36 %; см. табл. 2, группа III) при сохранении высокой доли нормально оплодотворенных ооцитов и низкой доли полиспермии. Таким образом, оптимизация протокола оплодотворения путем изменения концентрации сперматозоидов применима только при оплодотворении дозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота в составе интактных КОК, но не денудированных ооцитов, при использовании семени с низкой подвижностью сперматозоидов (семя быка B).
Выводы. У денудированных ооцитов, оплодотворенных криоконсервированным семенем как с более высокими (бык А, группа II), так и с пониженными (бык В, группа IV) показателями подвижности и выживаемости сперматозоидов при сохранении высокого общего уровня оплодотворения (89,64... 91,03 %) существенно (p < 0,05) повышен показатель полиспермии (до 29,36.32,32 %), по сравнению с оплодотворением ооцитов в составе комплексов ооцит-кумулюс (группы I и III соответственно). Наличие интактных клеток кумулюса и гиалуронового матрикса при оплодотворении дозревших in vitro ооцитов КРС может служить фактором регуляции уровня полиспермии. Однако повышение уровня полиспермии происходило без снижения доли нормально оплодотворенных ооцитов в группах ДО (57,57.59,32 % от оплодотворенных), по сравнению с КОК (55,65.68,73 %). Увеличение или уменьшение концентрации сперматозоидов в среде оплодотворения в рамках используемого протокола не приводило к изменению показателей общего оплодотворения и полиспермии у денудированных ооцитов. Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют, что на развитие эмбрионов до стадии бластоцисты in vitro влияли в первую очередь качественные характеристики криоконсервированного семени быков, а не наличие или отсутствие интактного комплекса ооцит-кумулюс при оплодотворении.
Литература.
1. Viana J. H. M. Statistics of embryo production and transfer in domestic farm animals: Is it a turning point? In 2017 more in vitro-produced than in vivo-derived embryos were transferred worldwide (Technical Report) //Embryo Technology Newsletter. 2018. Vol. 36. No. 4. Pp. 8-25.
2. Hwang I. S., Hochi S. BioMed Recent Progress in Cryopreservation of Bovine Oocytes (Review Article) // BioMed Research International. 2014. Vol. 2014. Pp. 1-11. DOI: 10.1155/2014/570647.
3. Hardin P. T. Vitrification of Immature and Mature Bovine Oocytes [Электронный ресурс]// LSU Master's Theses. 2016. URL: https://digitalcommons.lsu.edu/gradschool_theses/4293 (дата обращения: 10.10.2018).
4. Developmental capability of denuded bovine oocyte in a co-culture system with intact cumulus-oocyte complexes: role of cumulus cells, cyclic adenosine 3',5'-monophosphate, and glutathione /A. M. Luciano, V. Lodde, M. S. Beretta, etc. // Mol Reprod Dev. 2005. Vol. 71. No. 3. Рр. 389-397.
5. Presence of cumulus cells during in vitro fertilization protects the bovine oocyte against oxidative stress and improves first cleavage but does not affect further development / A. N. Fatehi, B. A. J. Roelen, B. Colenbrander, etc.// Zygote. 2005. Vol. 13. Рр. 177-185.
6. Dale B. Achieving monospermy or preventing polyspermy?// Research and Reports in Biology. 2016. Vol. 7. Рр. 47-57.
7. Корниенко Е. В., Иконописцева М. А., Маленко Г. П. Витрификациядозревших in vitro ооцитов крупного рогатого скота в триацетатцеллюлозных полых волокнах //Достижения науки и техники АПК. 2018. Т. 32. № 9. С. 84-88.
8. Gordon I. Laboratory Production of Cattle Embryos, 2th. ed. CABI Publishing, 2003. Pp. 548.
9. 151 Effect of season on the in vitro fertilizing ability of frozen-thawed bovine spermatozoa (Abstract) / M. Sabes-Alsina, M. Wallgren, Y. Sjunesson, etc. // Reprod Fert Dev. 2018. Vol. 31. No. 1. Pp. 200-201.
10. Effects of cumulus cells on sperm penetration of bovine oocytes in protein-free medium / K. Saeki, Y. Nagao, M. Hoshi, etc. // Theriogenology. 1994. Vol. 42. No. 7. Pp. 1115-1123.
11. Chian R. C., Okuda K., Niwa K. Influence of cumulus cells on in vitro fertilization of bovine oocytes derived from in vitro maturation //Animal Reproduction Science. 1995. Vol. 38. No. 1. Pp. 37-48.
12. Cumulus contributions during bovine fertilization in vitro / S. Tanghe, A. Van Soom, J. Mehrzad, etc. // Theriogenology. 2003. Vol. 60. No. 1. Pp. 135-149.
13. Parrish J. J. Bovine In vitro fertilization: In vitro oocyte maturation and sperm capacitation with heparin // Theriogenology. 2014. Vol. 81. No. 1. Pp. 67-73.
14. Factors affecting successful in vitrofertilization of bovine follicular oocytes / G. D. Ball, M. L. Leibfried, R. W. Lenz, etc. // Biol Reprod. 1983. Vol. 28. Pp. 717-725.
15. Bovine oocyte quality in relation to ultrastructural characteristics of zona pellucida, polyspermic penetration and developmental competence /P. Santos, A. Chaveiro, N. Simoes, etc. //Reprod Domest Anim. 2008. Vol. 43. No. 6. Pp. 685-689.
16. Whole-Depth Change in Bovine Zona Pellucida Biomechanics after Fertilization: How Relevant in Hindering Polyspermy? / M. Papi, R. Brunelli, G. Familiari, etc. //PLoS ONE. 2012. Vol. 7. No. 9. P.e45696. DOI: 10.1371/journal.pone.0045696.
17. Oviduct-specific glycoprotein and heparin modulate sperm zona pellucida interaction during fertilization and contribute to the control of polyspermy / P. Coy, S. Cánovas, I. Mondéjar, etc. // Proc Natl Acad Sci USA. 2008. Vol. 105. Pp. 1580915814.
18. Coy P., Avilés M. What controls polyspermy in mammals: the oviduct or the oocyte?//Biol Revs. 2010. Vol. 85. Pp. 593-605.
19. Effect of cumulus cell removal of in vitro matured bovine oocytes prior to in vitro fertilization on subsequent cleavage rate / A. N. Fatehi, E. C. Zeinstra, R. V. Kooij, etc. // Theriogenology. 2002. Vol. 57. No. 4. Pp. 1347-1355.
20. Role of cumulus cells during vitrification and fertilization of mature bovine oocytes: effects on survival, fertilization, and blastocyst development/N. Ortiz-Escribano, K. Smits, S. Piepers, etc.//Theriogenology. 2016. Vol. 86. No. 2. Pp. 635-641.
21. Influence of gamete co-icubation time, sire and special additives on the in vitro fertilization of cumulus-enclosed or denuded buffalo oocytes/ M. E. L. Gebaly, H. Abdalla, H. Amer et al. // Slov Vet Res. 2018. Vol. 55. No. 20. Pp. 313-321.
References
1. Viana JHM. Statistics of embryo production and transfer in domestic farm animals: Is it a turning point? In 2017 more in vitro-produced than in vivo-derived embryos were transferred worldwide (Technical Report). Embryo Technology Newsletter. 2018;36(4):8-25.
2. Hwang IS, Hochi S. Recent progress in cryopreservation of bovine oocytes (review article). BioMed Research International. 2014;2014:1-11. doi: 10.1155/2014/570647.
3. Hardin PT. Vitrification of immature and mature bovine oocytes [LSU Master's Theses on the Internet]. 2016 [cited 2018 Oct 10]. Available from: https://digitalcommons.lsu.edu/gradschool_theses/4293.
4. Luciano AM, Lodde V, Beretta MS, et al. Developmental capability of denuded bovine oocyte in a co-culture system with intact cumulus-oocyte complexes: role of cumulus cells, cyclic adenosine 3',5'-monophosphate, and glutathione. Mol Reprod Dev. 2005;71(3):389-97.
5. Fatehi AN, Roelen BAJ, Colenbrander B, et al. Presence of cumulus cells during in vitro fertilization protects the bovine oocyte against oxidative stress and improves first cleavage but does not affect further development. Zygote. 2005;13:177-85.
6. Dale B. Achieving monospermy or preventing polyspermy? Research and Reports in Biology. 2016;7:47-57.
7. Kornienko EV, Ikonopistseva MA, Malenko GP. [Vitrification of in vitro matured bovine oocytes in triacetate cellulose hollow fibers]. Dostizheniya nauki i tekhnikiAPK. 2018;32(9):84-8. Russian.
8. Gordon I. Laboratory production of cattle embryos. 2th. ed. CABI Publishing; 2003. 548 p.
9. Sabes-Alsina M, Wallgren M, Sjunesson Y, et al. 151 Effect of season on the in vitro fertilizing ability of frozen-thawed bovine spermatozoa (Abstract). Reprod Fert Dev. 2018;31(1):200-1.
10. Saeki K, Nagao Y, Hoshi M, et al. Effects of cumulus cells on sperm penetration of bovine oocytes in protein-free medium. Theriogenology. 1994;42(7):1115-23.
11. Chian Rc, Okuda K, Niwa K. Influence of cumulus cells on in vitro fertilization of bovine oocytes derived from in vitro maturation. Animal Reproduction Science. 1995;38(1):37-48.
12. Tanghe S, Van Soom A, Mehrzad J, et al. Cumulus contributions during bovine fertilization in vitro. Theriogenology. 2003;60(1):135-49.
13. Parrish JJ. Bovine In vitro fertilization: In vitro oocyte maturation and sperm capacitation with heparin. Theriogenology. 2014;81(1):67-73.
14. Ball GD, Leibfried ML, Lenz RW, et al. Factors affecting successful in vitrofertilization of bovine follicular oocytes. Biol Reprod. 1983;28:717-25.
15. Santos P, Chaveiro A, Simoes N, et al. Bovine oocyte quality in relation to ultrastructural characteristics of zona pellucida, polyspermic penetration and developmental competence. Reprod Domest Anim. 2008;43(6):685-9.
16. Papi M, Brunelli R, Familiari G, et al. Whole-depth change in bovine zona pellucida biomechanics after fertilization: how relevant in hindering polyspermy? PLoS ONE. 2012;7(9):e45696. doi: 10.1371/journal.pone.0045696.
17. Coy P, Canovas S, Mondejar I, et al. Oviduct-specific glycoprotein and heparin modulate sperm zona pellucida interaction during fertilization and contribute to the control of polyspermy. Proc Natl Acad Sci USA. 2008;105:15809-14.
18. Coy P, Aviles M. What controls polyspermy in mammals: the oviduct or the oocyte? Biol Revs. 2010;85:593-605.
19. Fatehi AN, Zeinstra EC, Kooij RV, et al. Effect of cumulus cell removal of in vitro matured bovine oocytes prior to in vitro fertilization on subsequent cleavage rate. Theriogenology. 2002;57(4):1347-55.
20. Ortiz-Escribano N, Smits K, Piepers S, et al. Role of cumulus cells during vitrification and fertilization of mature bovine oocytes: effects on survival, fertilization, and blastocyst development. Theriogenology. 2016;86(2):635-41.
21. Gebaly MEL, Abdalla H, Amer H, et al. Influence of gamete co-icubation time, sire and special additives on the in vitro fertilization of cumulus-enclosed or denuded buffalo oocytes. Slov Vet Res. 2018;55(20):313-21.
