CC BY
140
УДК 579.6:631.46.504
И.С. Боровкова, В.В. Вольхин
Пермский государственный технический университет
ПОЛУЧЕНИЕ БИОПРЕПАРАТА НА ОСНОВЕ АБОРИГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ-НЕФТЕДЕСТРУКТОРОВ
Определены условия активации аборигенных углеводород-окисляющих микроорганизмов, отобранных с образцами почвы на участке земли, загрязненной нефтью. Приготовлен жидкий «биопрепарат», внесение которого в почву в количестве 9108 кл./г приводит к увеличению степени биодеградации нефти с 25,4 (контроль) до 79,1 % в течение 13 недель.
Загрязнение окружающей среды нефтью и нефтепродуктами продолжается, несмотря на совершенствование технологий нефтедобычи, нефтепереработки и трубопроводных транспортных систем. По оценкам специалистов [1, 2], суммарные потери нефти достигают 3 % ее годовой добычи. При современных масштабах потребления нефти эти потери выходят на уровень 6-9 млн т. В результате аварийных разливов нефти особенно страдают почва и поверхностные воды. Нарушается нормальное функционирование природных экосистем. Поэтому возникает проблема ремедиации загрязненной среды. В данной работе ограничимся рассмотрением проблемы ремедиации нефтезагрязненной почвы.
Решению проблемы восстановления нефтезагрязненной почвы и, прежде всего, разработке методов биоремедиации посвящено много работ [1-8]. Исследования проводятся в основном в двух направлениях: стимуляция естественной нефтеокисляющей микрофлоры непосредственно на участке почвы, подвергнувшейся загрязнению нефтью или нефтепродуктами, и интродукция активных углеводородокисляю-щих микроорганизмов (УОМ) в почву, пострадавшую от нефтезагряз-нения. В последнем случае для интродукции используют биопрепараты, включающие в себя активированные микроорганизмы и определенные добавки, повышающие эффективность утилизации углеводородов. Второе из указанных направлений биоремедиации почвы особенно оправдано для зон умеренных и приполярных регионов, где из-за длительного периода сохранения низких температур почвы ее биоремедиация без применения интродукции микроорганизмов может растянуться на многие годы [6].
К настоящему времени разработан целый ряд препаратов: «Пу-тидойл», «Деворойл», «Унирем», «Дестройл», «Petrobac-1», «Олево-рин», «Экойл», «Экосорб», «КНОП» и др. [8]. Они показали свою эффективность в тех или иных регионах России. Но накопленный опыт показывает, что вряд ли возможно создать универсальный биопрепарат, который мог бы эффективно работать в разных почвенноклиматических зонах и в условиях функционирования различных по своей природе экосистем. Результаты зависят от составов аборигенной почвенной микрофлоры и нефти, вызвавшей загрязнение [8]. Поэтому разработчики биопрепаратов все чаще стремятся отобрать для активации аборигенную микрофлору непосредственно из почвы, подвергнувшейся нефтезагрязнению [4, 9, 10].
Задача данной работы - биодеградация нефти того типа, который перерабатывается на ООО «ЛУКОЙЛ-Пермнефтеоргсинтез», и использование в процессе биодеградации активированной аборигенной микрофлоры. В ходе эксперимента необходимо было определить условия получения активированной обогащенной культуры нефтеокисляющих микроорганизмов.
Методики исследования. Для подготовки жидкой обогащенной культуры использовали методику, принятую в работе [9]. Образцы нефтезагрязненной почвы (10 г), содержащей аборигенные микроорганизмы, культивировали в течение 17 сут в 100 мл нестерильной водопроводной воды в условиях постоянной аэрации на качалке (160 об/мин) при комнатной температуре. Для активации аборигенной почвенной микрофлоры в жидкую среду вносили (г/л): нитроаммофоску - 2,0, NaH2PO4 - 5,0 и K2HPO4 - 3,0. В качестве источника углерода и фактора селекции микроорганизмов служила сырая нефть -5,0 г/л. В роли эмульгатора выступал синтанол - 0,02 г/л (синтанол -неионогенное поверхностно-активное вещество). Каждый вариант эксперимента был представлен в трех повторностях. Все добавки стерилизовались автоклавированием (1 изб. атм в течение 30 мин). Методика рассчитана на получение накопительной нефтеокисляющей культуры.
В обогащенной культуре проводили подсчет количества УОМ. Для этого осуществляли высевы из обогащенных культур (в трех повторностях) на чашки Петри с агаризованной средой следующего состава (г/л): KNO3 - 1; K2HPO4-3H2O - 0,262; М§БО4 - 0,2; CaCh^O - 0,2. В среду вносили также микроэлементы - 1 мл/л. Подсчет колоний производили через 12-14 сут. Общее число гетеротрофных микроорганизмов в исходных образцах определяли, используя общепринятый метод [11].
Содержание остаточных нефтепродуктов в почве определяли методом прямой экстракции (хлороформом) с весовым окончанием. Минимальная определяемая концентрация - 0,3 мг/кг. Относительное стандартное отклонение при концентрациях 0,3-1 мг/кг составляет
12 %, при концентрациях нефти 1-5 мг/кг - 5 %.
Статистическая обработка экспериментальных данных была проведена по методу Стьюдента: при п = 3 коэффициент Стьюдента га = 4,3.
Результаты и их обсуждение. В начале работы важно было подтвердить, что отобранные образцы почвы содержат эффективные УОМ. Для оценки нефтеокисляющей способности микроорганизмов, содержащихся в образцах почвы, на их основе выращивали культуру УОМ. Использовали среду Раймонда с добавкой 1 или 3 % нефти, культивирование проводили при температуре 25 °С на качалке (240 об/мин), продолжительность эксперимента до 20 сут. Контролем служила стерильная среда с добавлением нефти. Нефтеокисляющую способность культуры оценивали по изменению нефтяной пленки, которая исчезала через 17 сут эксперимента. Отсюда следует, что отобранная культура микроорганизмов способна полностью утилизировать нефть, добавка которой составила 3 %, в течение 17 сут. В контрольных образцах за этот же период состояние нефти почти не изменилось.
Исследовано влияние стимулирующих добавок на динамику изменения численности УОМ в процессе культивирования почвенной суспензии. Спланировано четыре варианта сочетаний добавок в жидкой среде, включающей в себя образцы нефтезагрязненной почвы (табл. 1).
Таблица 1
Варианты сочетаний стимулирующих добавок в среде при подготовке жидкой обогащенной культуры
Номер варианта Вносимая добавка, г/л
Минеральные компоненты* Нефть Меласса Синтанол
1 10,0 5,0 - -
2 10,0 5,0 60,0 —
3 10,0 5,0 60,0 0,02
4 10,0 5,0 - 0,02
* Минеральные компоненты (г/л): нитроаммофоска - 2,0, МаН2Р04 - 5,0 и К2НР04 - 3,0.
Влияние добавок на динамику изменения численности УОМ (^уОм) показано на рис. 1.
I ё '^'уОМ
Рис. 1. Динамика изменения численности УОМ в присутствии стимулирующих добавок
Во всех вариантах экспериментов стимулирующие добавки способствовали увеличению численности УОМ от 2,8-104 кл./мл (исходное содержание микроорганизмов в почвенной суспензии) до 3,5-1063,2-108 кл./мл (содержание после культивирования в присутствии добавок). Наибольшее стимулирующее влияние добавок проявилось в варианте 4 (минеральные компоненты - 10 г/л, нефть - 5 г/л, синтанол -
0,02 г/л ). Численность УОМ возросла в 1145 раз по сравнению с исходным уровнем и составила 3,2-108 кл./мл. Роль стимулирующих добавок сводится к следующему: минеральные компоненты - элементы питания, нефть - источник углерода, синтанол, согласно [4], - «посредник», улучшающий поступление гидрофобных органических загрязнителей из почвы внутрь микробных клеток, что создает условия для их биодеградации.
На рис. 2 приведена зависимость, характеризующая динамику накопления биомассы (оценка по количеству колоний) при культивировании в течение 20 сут.
0 5 10 15 20
Продолжительность культивирования, сут Рис. 2. Динамика накопления биомассы
Судя по числу выросших колоний, наибольшая численность микроорганизмов обнаружена на семнадцатые сутки процесса культивирования. Последующее уменьшение числа выросших колоний, вероятно, связано с истощением питания и накоплением продуктов метаболизма.
Число выросших колоний зависит также от содержания нефти в образце загрязненной почвы. Получены следующие экспериментальные данные в пересчете на численность клеток (метод Коха):
содержание нефти в почве, % 2 3 4
численность клеток, кл./мл 4,4-106 3,0-107 1,0-107
Результаты эксперимента показывают, что внесение 3 % сырой нефти в качестве единственного источника углерода при культивировании жидкой обогащенной культуры способствует развитию наибольшего количества нефтеокисляющих микроорганизмов (3,0-107 кл./мл) по сравнению с внесением 2 и 4 % нефти.
Температура среды в процессе культивирования также влияет на численность выросших микроорганизмов (рис. 3).
Наибольшая численность микроорганизмов (3,2-107 кл./мл) обнаружена при температуре 25 °С. Численность микроорганизмов оказалась ниже как при более высоких температурах (1,4-107 и 6,5-106 кл./мл соответственно при 30 и 35 °С), так и при более низких (1,8-104 и 8,7-106 кл./мл соответственно при 15 и 20 °С).
Температура, °С Рис. 3. Влияние температуры на численность микроорганизмов
Результаты проведенного исследования позволили определить оптимальные условия культивирования обогащенной накопительной культуры нефтеокисляющих микроорганизмов. Состав жидкой среды (г/л): минеральные компоненты - 10, нефть - 5, синтанол - 0,02; температура - 25 °С; продолжительность культивирования - 17 сут. Согласно сложившейся практике [9], образцы жидкой обогащенной культуры относят к категории «биопрепаратов».
Полученный «биопрепарат» был испытан в процессе биоремедиации нефтезагрязненной почвы супесчаного типа, образцы которой были отобраны для выделения нефтеокисляющих микроорганизмов. Биоремедиацию почвы с содержанием нефти 3,0 % проводили в лабораторных условиях. В почву вносили полученную накопительную культуру из расчета 3-108, 9-108 или 3-109 кл/г почвы. При выполнении эксперимента образцы нефтезагрязненной почвы подвергали воздействиям, имитирующим агротехнические приемы (рыхление, полив). Результаты биодеструкции нефти (доля разложившейся нефти от ее исходного содержания в почве, %) под действием «биопрепарата» или без него (контроль) при разной продолжительности процесса биоремедиации представлены в табл. 2. При заданном числе клеток УОМ, вносимых в почву, объем жидкого «биопрепарата» составлял (кл. УОМ/г почвы - мл «биопрепарата»/г почвы): 3-108 - 10; 9-108 - 30; 3-109 - 100.
Таблица 2
Результаты испытания «биопрепарата» в процессе биоремедиации нефтеокисляющей почвы
Продолжительность биоремедиации, сут Доля разложившейся нефти, %, при внесении в почву «биопрепарата», кл. УОМ/г почвы
3 108 9108 3109 0
14 5,00±0,74 8,90±0,43 10,47±1,00 0,90±0,43
28 7,00±0,74 15,77±1,24 13,67±0,87 1,43±0,57
42 17,47±1,00 50,90±0,86 49,00±0,74 10,23±1,25
55 31,10±0,86 63,33±0,87 64,00±0,75 21,80±0,43
92 39,43±0,57 79,10±0,86 80,67±0,87 25,43±0,57
Наиболее высокие показатели по биоремедиации нефти достигнуты при продолжительности процесса в течение 13 недель, они составили 79,1-80,7 %. За этот же период степень биодеградации нефти в контрольных образцах (без добавки «биопрепарата») осталась на уровне 25,4 %. В то же время увеличение дозы вносимых в почву нефтеокисляющих микроорганизмов более 9-108 кл. УОМ/г почвы не дает ощутимых результатов.
Таким образом, приготовлен «биопрепарат», представляющий собой жидкую обогащенную культуру аборигенных УОМ, отобранных непосредственно на участке нефтезагрязненной почвы. За счет использования «биопрепарата» биодеструкция нефти в лабораторных условиях достигает примерно 80 % от ее исходного содержания за период
13 недель. Метод достаточно прост в осуществлении и экологически безопасен, так как не происходит интродукция чужеродных микроорганизмов в окружающую среду.
Список литературы
1. Нефтезагрязненные биоценозы / А. А. Оборин, В.Т. Хмурчик, С.А. Илларионов [и др.]; УрО РАН, Перм. гос. ун-т, Перм. гос. техн. ун-т. Пермь, 2008. 511 с.
2. Рекультивация нефтезагрязненных почв / Ф.М Кузнецов, С.А. Илларионов, В.В. Середин [и др.]; Перм. гос. техн. ун-т. Пермь, 2000. 105 с.
3. Разработка проекта методики по разработке и оценке региональных нормативов допускаемого остаточного содержания нефти в почвах: научно-техн. отчет / ФГУ УралНИИЭкология. Пермь, 2003. 50 с.
4. Перспективы использования бактерий рода ЯИогососст для деградации нефтяных загрязнений / Е.В. Карпенко, Р.И. Вильданова-Марцишин, Н.С. Щеглова [и др.] // Прикл. биохомия и микробиология. 2006. Т. 42, № 2. С. 175-179.
5. Пирог Т.П., Шевчук Т.А., Волошина И.Н. Использование иммобилизованных на керамзите клеток нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки воды от нефти // Прикл. биохомия и микробиология. 2005. Т. 41, № 1. С. 58-63.
6. Белоусов Н.И., Шкидченко А.Н. Деструкция нефтепродуктов различной степени конденсации микроорганизмами при пониженных температурах // Прикл. биохимия и микробиология. 2004. Т. 40, № 3. С.312-316
7. Киреева Н.А., Мифтафова А.М., Кузвахметов Г.Г. Влияние загрязнения нефтью на фитотоксичность серой лесной почвы // Агрохимия. 2001. № 5. С. 64-68.
8. Илларионов С.А. Экологические аспекты восстановления неф-тезагрязненных почв / УрО РАН. Екатеринбург, 2004. 194 с.
9. Плешакова Е.В., Позднякова Н.Н., Турковская О.В. Получение нефтеокисляющего биопрепарата путем стимуляции аборигенной уг-леводородокисляющей микрофлоры // Прикл. биохимия и микробиология, 2005. Т. 41, № 6. С. 634-639.
10. Лушков С.В., Завгороднев К.Н., Бобер В.В. Очистка воды и почвы от нефти и нефтепродуктов с помощью культуры микробов-деструкторов // Экология и промышленность России. 1999. № 12. С. 17-20.
11. Практикум по микробиологии / под ред. Н.С. Егорова. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1976. 307 с.
Получено 17.06.2009
