CC BY
312
УДК 631.461:628.516
АССОЦИАЦИИ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ ДЛЯ БИОРЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ
© Н. А. Киреева*, А. С. Григориади, Е. Ф. Хайбуллина
Башкирский государственный университет Россия, Республика Башкортостан, 450074 г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32.
Тел./факс: +7 (347) 273 6712.
E-mail: vodop@yandex.ru
Из почв, загрязненных нефтью, выделены ассоциации углеводородокисляющих микроорганизмов. В лабораторных условиях была исследована их способность к утилизации углеводородов нефти в загрязненных почвах. Микроорганизмы проявили максимальную углеводородо-кисляющую активность в течение первых 5 недель с начала эксперимента. Результаты биотестирования подтвердили ускорение процесса очищения загрязненных почв после внесения ассоциации микроорганизмов.
Ключевые слова: консорциум углеводородокисляющих микроорганизмов, биоремедиация, биодеградация, зоотоксичность, фитотоксичность.
В районах интенсивной нефтедобычи в течение последних десятилетий произошло значительное ухудшение состояния окружающей среды, обусловленное в том числе и деградацией почвенного покрова. В значительной мере это связано с загрязнением почв, которое происходит практически на всех стадиях процесса нефтедобычи в результате разливов нефти и нефтесодержащих продуктов [1]. В связи с этим разработка методов ремедиации (восстановления) таких земель - одна из актуальных задач охраны окружающей среды в нефтедобывающих регионах.
Результаты научных разработок последних лет в области восстановления плодородия нефтезагряз-ненных почв показали, что существующие физикохимические способы ремедиации не могут обеспечить полного удаления нефти и нефтепродуктов из почвы. Поэтому на современном этапе развития технологий очистки нефтезагрязненных почв основное внимание уделяется методам биоремедиации, основанным на использовании углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ). При этом предпочтение отдается технологиям с применением естественной нефтеокисляющей микробиоты почвы как наиболее безопасной для окружающей среды [2].
Целью работы было выделение почвенных аборигенных УОМ и изучение в лабораторном эксперименте возможности использования наиболее активных форм для биоремедиации почв, загрязненных нефтью.
Материалы и методы
Накопительные культуры микроорганизмов, выделенных из образцов почв нефтезагрязненных участков на территории Республики Башкортостан, были получены на синтетической среде Ворошиловой-Диановой [3] со стерильной нефтью в качестве единственного источника углерода. В колбу с жидкой средой объемом 250 мл вносили 5 мл сырой нефти и образец почвы, загрязненной нефтепродуктами. Колбу помещали на качалку (200 об/мин) в термостат при температуре 30 °С на 15 суток.
Чистые культуры УОМ были выделены по методу Коха на мясо-пептонном агаре (МПА) и под-
держивались на скошенном МПА при комнатной температуре [3].
Родовую и видовую идентификацию выделенных штаммов УОМ проводили на основании изучения морфологических, культуральных, физиологобиохимических признаков в соответствии с общепринятыми методами [4-7]. Исследование и оценку патогенных свойств проводили согласно действующей нормативно-методической документации [8].
Для скрининга выделенных ассоциаций УОМ по способности утилизировать сырую нефть в пробирки со средой Ворошиловой-Диановой объемом 10 мл и сырой нефтью вносили посевной материал из накопительной культуры в количестве 1 мл на 10 мл среды. Культивирование проводили при перемешивании (200 об/мин) при 30 °С в термостате. Контролем служила стерильная среда с нефтью без внесения культур. В течение месяца визуально оценивалась степень разрушения нефтяной пленки на поверхности среды.
В лабораторных условиях изучалось влияние внесения выделенных ассоциаций УОМ на процесс деградации нефти в серой лесной почве при низких концентрациях загрязнителя (1 и 5% от массы почвы). Сразу же после загрязнения в почву вносились ассоциации микроорганизмов в 2 вариантах: с преобладанием цианобактериальной составляющей в первом случае и грибной - во втором. Инокуляция посевным материалом производилась в количестве 10 кл/г почвы. Контролем служила чистая и загрязненная нефтью в дозах 1 и 5% почва без внесения ассоциаций. Сосуды инкубировались в термостате при температуре 24 °С; влажность почвы поддерживалась на уровне 60%.
На протяжении всего эксперимента учитывалось количество УОМ на среде Ворошиловой-Диановой методом предельных разведений с последующим пересчетом по таблице МакКреди и общих гетеротрофов на МПА [3].
Содержание остаточных нефтепродуктов в почве определялось весовым методом после экстракции углеводородов из навески почвы четыреххлористым углеродом [9].
* автор, ответственный за переписку
Степень токсичности остаточных нефтепродуктов оценивалась биотестами с использованием ногохвосток Folsomia Candida (Collembola: Iso-tomidae) [10-11] и проростков редиса Raphanus sa-tivus (сорт Красный с белым кончиком) [12].
Статистическая обработка результатов проводилась с помощью пакета программ Statistica 5.0.
Результаты и их обсуждение Из более 50 полученных накопительных культур УОМ в результате скрининга были отобраны две природные ассоциации, проявившие наибольшую неферазлагающую активность. Предварительная идентификация культур, входящих в состав ассоциаций, показала, что они представлены цианобактериями Anabaena variabilis и Phormidium sp., бактериями Bacillus, Arthrobacter и микромицетом Aspergillus repens. Ассоциации отличались друг от друга наличием разных цианобактерий (в ассоциации №1 - Anabaena и в ассоциации №2 - Phormidium) и разным соотношением бактериального и микромицетного компонентов.
В качестве показателя интенсивности деструкции нефтяного загрязнения использовалась динамика численности УОМ в исследуемых почвах. Результаты исследования показали существенную разницу в количестве микроорганизмов в почвах без загрязнения и загрязненных нефтью, без обработки и с внесением ассоциаций (табл.).
Так, в незагрязненной и необработанной почве с течением времени численность УОМ практически не изменялась и оставалась низкой на протяжении всего эксперимента, что свидетельствует о небольшой доле аборигенных УОМ в составе естественного микробоценоза. В нефтезагрязненной почве количество УОМ возрастало во всех вариантах опыта, при этом в образцах с внесением выделенных ас-
социаций УОМ численность микроорганизмов была выше контрольных значений на два-три порядка.
Наибольшая разница между активностью УОМ в необработанных и инокулированных ассоциациями почвах наблюдалась при 1% нефтяном загрязнении. В контрольном образце численность УОМ достигла максимального значения (4.5*104 клеток/г почвы) через 3 недели после начала эксперимента. В обработанных почвах к этому времени численность микроорганизмов составляла 1.4*105 и 2.0*106 клеток/г почвы (для первой и второй ассоциации соответственно), т.е. значительно превышала контрольные значения. Возрастание количества УОМ в образцах с внесением ассоциаций происходило до уровня 4.0*106 и 1.5*107 клеток/г почвы, отмеченного на 5-й неделе эксперимента. В дальнейшем наблюдалась стабилизация роста их численности.
При 5% загрязнении динамика численности УОМ в почвах с внесением ассоциаций также характеризуется резким увеличением их количества на 5-й неделе эксперимента до уровня 7.0*105 клеток/г почвы (ассоциация №1) и 2.0* 106 клеток/г почвы (ассоциация №2). В то же время в необработанных образцах численность углеводородокис-ляющей микробиоты на протяжении всего эксперимента не превышает 2.5*103 клеток/г почвы.
Первоначально в почве загрязненных вариантов содержалось 100% нефти. Анализ содержания остаточных нефтепродуктов к концу эксперимента показал, что в инокулированных ассоциациями образцах почвы содержание нефти снизилось до уровня 22-51% относительно первоначального против 61-70 % в контроле. Максимум углеводородокисляющей активности микроорганизмов пришелся на 5-ю неделю эксперимента, когда наблюдалось резкое уменьшение концентрации нефти относительно начальной.
Таблица.
Численность углеводородокисляющих микроорганизмов в почве, кл/г почвы
Концентрация нефти, % Сроки отбора образцов, сут
3 7 21 35 70
Контроль
0 (2.5±0.3) ■ 10 (1.5±0.2) ■ 10 (2.5±0.2) ■ 10 (0.4±0.3) ■ 10 (0.6±0.1) ■ 10
1 (7.5±2.1) ■ 102 (2.5±05) ■ 104 (4.5±1.7) ■ 104 (2.5±1.3) ■ 103 (2.5±0.8) ■ 103
5 (7.5±2.4) ■ 102 (2.0±0.6) ■ 103 (2.0±0.5) ■ 103 (2.5±1.0) ■ 103 (2.5±0.3) ■ 103
Ассоциация № 1
0 (2.0±0.2) ■ 103 (7.5±2.7) ■ 103 (0.9±0.4) ■ 103 (2.0±0.6) ■ 103 (1.6±0.3) ■ 103
1 (1.5±0.6) ■ 104 (2.0±0.4) ■ 104 (1.4±0.3) ■ 105 (4.0±1.1) ■ 106 (3.5±0.8) ■ 106
5 (2.0±0.4) ■ 104 (1.5±0.6) ■ 104 (9.5±3.1) ■ 104 (7.0±0.6) ■ 105 (9.0±1.8) ■ 105
Ассоциация № 2
0 (1.1±0.3) ■ 105 (7.5±1.4) ■ 103 (2.0±0.4) ■ 103 (1.5±0.3) ■ 103 (2.5±0.3) ■ 103
1 (2.5±0.6) ■ 104 (2.0±0.4) ■ 105 (2.4±0.3) ■ 106 (1.5±0.4) ■ 107 (1.1±0.3) ■ 107
5 (2.5±0.1) ■ 102 (9.5±1.9) ■ 103 (2.0±0.4) ■ 105 (2.0±0.4) ■ 106 (2.0±0.2) ■ 106
Результаты исследования динамики численности УОМ и убыли остаточных углеводородов свидетельствуют о значительном ускорении процесса биодеградации нефти в почве при внесении исследуемых ассоциаций по сравнению с необработанными вариантами. При этом корреляционный анализ показал наличие отрицательной связи средней силы между численностью УОМ и содержанием остаточных нефтепродуктов в почве (г = -0.69 и г = -0.88 при 1 и 5%-ом нефтяном загрязнении соответственно; уровень значимости р = 0.95).
Одним из диагностических показателей биологической активности почв является состояние комплекса гетеротрофных микроорганизмов. На протяжении всего эксперимента в незагрязненной почве без внесения ассоциаций количество ге-теротрофов оставалось на высоком уровне -1.0*106-1.9*106 КОЕ/г почвы. Во всех нефтезагряз-ненных образцах их общая численность резко снизилась сразу после внесения нефти в почву. Дальнейшая динамика численности гетеротрофных микроорганизмов в общем характеризовалась постепенным увеличением их числа в почве. Однако количество гетеротрофов к окончанию эксперимента в необработанных почвах было существенно ниже по сравнению с почвами, инокулированными УОМ.
Значительно различалась динамика гетеротрофных микроорганизмов в вариантах опыта и при 5% загрязнении. Возрастание активности гетеротрофов при внесении ассоциаций до уровня контрольного варианта отмечено на 3-5-й неделях эксперимента (1.3*106 - ассоциация №1; 3.5*106 - ассоциация №2), тогда как в необработанных образцах их численность к концу инкубации не превышала 2.9* 103 КОЕ/г почвы.
Определение концентрации остаточных нефтепродуктов в почве не всегда позволяет судить о степени их токсического воздействия на почвенную биоту [11]. В связи с этим для оценки токсичности исследуемых почв использовалось два вида биоди-агностических показателей.
Применение ногохвосток Folsomia Candida в качестве тест-объекта позволило оценить зоотоксичность и косвенно степень деструкции углеводородов в почвах контрольных и опытных вариантов.
Через три дня после внесения ассоциаций микроорганизмов в почву с нефтью в дозе 1% загрязненная почва оставалась токсичной для ногохвосток во всех вариантах эксперимента (рис.). Через 1 неделю наблюдалось незначительное снижение токсичности - выживаемость коллембол в почвах, инокулированных ассоциациями №1 и №2, составила соответственно 60% и 60% по сравнению с контрольной нефтезагрязненной почвой (55%). Токсичность почвы существенно снизилась через 5 недель после начала эксперимента в образцах с внесением УОМ, где гибель ногохвосток не наблюдалась вообще, тогда как в контроле она составляла 70%.
При увеличении концентрации загрязнения до 5% токсичность почв резко возросла. Так, после
3 сут. инкубации наблюдалась 100%-ная гибель ногохвосток во всех вариантах эксперимента. Однако через 5 недель анализ образцов почв с внесенными ассоциациями УОМ показал значительное уменьшение токсичности по сравнению с нефтезагрязненной необработанной почвой - выживаемость в обработанной почве составила 70 и 60%) (ассоциация №1 и №2 соответственно), тогда как в контроле к этому времени все особи по-прежнему погибали.
3 7 21 35 70
еут
[□контроль Рассоциация №1 Вассо1»1вц^№2|
Рис. Выживаемость ногохвосток в нефтезагрязнен-ных почвах (А - при 1%-ном нефтяном загрязнении, Б -при 5%-ном нефтяном загрязнении)
Данные по фитотоксичности исследуемых почв показали изначально несущественную разницу между контрольными и опытными образцами почв. Длина корней проростков Raphanus sativus на 3 сут. инкубации во всех вариантах эксперимента в среднем составляла 35.4 мм при 1% загрязнении и 7.6 мм при 5% загрязнении. После 5 недель инкубирования фитотоксичность во всех вариантах снизилась. При этом максимальное снижение токсичности отмечено в почве с 1%-ым загрязнением и внесением ассоциации №2, где средняя длина корней проростков составила 51.4 мм.
Т аким образом, анализ динамики численности углеводородокисляющих и гетеротрофных микроорганизмов и оценка токсичности нефтепродуктов в почве с использованием биотестов показали ускорение процесса деградации нефти в почве и снижение ее токсического действия на почвенную биоту при внесении полученных культур.
Результаты модельного эксперимента свидетельствуют о высокой нефтеокисляющей активности выделенных ассоциаций УОМ в почве и возможности создания на их основе препарата для биоремедиации нефтезагрязненных почв.
ЛИТЕРАТУРА
1. Деградация и охрана почв / Под ред. Г. В. Добровольского. М.: изд-во МГУ, 2002. -654 с.
2. Коронелли Т. В. // Прикл. биохим. и микробиол. 1996. №6. С. 579-585.
3. Методы почвенной микробиологии и биохимии / Под ред. Д. Г. Звягинцева. М.: изд-во МГУ, 1991. -304 с.
4. Watanabe T. Pictorial atlas of soil and seed fungi: Morphologies of cultured fungi and key to species. Florida. 2000. -411 p.
5. Лысак Л. В., Добровольская Т. Г., Скворцова И. Н. Методы оценки бактериального разнообразия почв и идентификации почвенных бактерий. М.: МАКС Пресс, 2003. -123 с.
6. Определитель бактерий Берджи: в 2-х т / Под ред. Дж. Хоулта. М.: Мир, 1997. -800 с.
7. Штина Э. А., Зенова Г. М. Почвенные водоросли. М.: изд-во МГУ, 1990. -78 с.
8. Фомин Г. С., Фомин А. Г. Почва. Контроль качества и экологической безопасночти по международным стандартам. М.: Протектор, 2001. -304 с.
9. Булатов А. И., Макаренко П. П., Шеметов В. Ю. Справочник инженера-эколога нефтегазодобывающей промышленности по методам анализа загрязнителей окружающей среды. Ч.2. Почва. М.: Недра-Бизнесцентр, 1999. -634 с.
10. Киреева Н. А., Ханисламова Г. М., Тарасенко Е. М. // Экология. 2005. №5. С. 397-400.
11. Ханисламова Г. М. // Проблемы охраны окружающей среды на Урале. Уфа, 1995. С. 152-157.
12. Бабьева И. П., Зенова Г. М. Биология почв. М.: изд-во МГУ, 1989. -336 с.
Поступила в редакцию 19.03.2009 г. После доработки — 27.04.2009 г.
