CC BY
234
УДК 612.396.11: 676.01:663.543
Н. Б. Сапунова, А. О. Богатырева, М.В. Щанкин, Е. В. Лияськина, В. В. Ревин
ПОЛУЧЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ НА СРЕДЕ С МЕЛАССОЙ
Ключевые слова: бактериальная целлюлоза, отходы биотехнологических производств, меласса.
Исследовалась динамика образования бактериальной целлюлозы на средах, содержащих 55 г/л мелассы, при различных начальных значениях рН. Показано, что наибольшее количество полисахарида образуется на мелассе при начальном значении рН 4.0 - 2,57±0,06 г/л на 3 сутки культивирования. При этом в процессе культивирования G. sucrofermentans B-11267 кислотность среды практически не изменяется.
Key words: bacterial cellulose, waste biotechnology industries, molasse.
The dynamics of formation of bacterial cellulose on media, containing 55 g/L of molasses at various initial pH values was studied. It is shown that the highest amount of polysaccharide is formed on molasses with the initial pH value 4.0 -2,57±0,06 g/L on the 3rd day of cultivation. In the process of cultivation of G. sucrofermentans B-11267 acidity is practically unchanged.
Введение
Целлюлоза - самый распространенный природный биополимер на Земле, наделенный уникальными свойствами и являющийся основой для создания полезных материалов нового поколения [1]. Главным источником целлюлозы является древесина, однако, помимо растений ее способны образовывать некоторые микроорганизмы, которые выделяют полимер как внеклеточный продукт [2, 3].
Бактериальная целлюлоза (БЦ) - это универсальный материал будущего. Она значительно превосходит свой аналог растительного происхождения благодаря высокой чистоте, наноструктуре, высокой степени полимеризации и кристалличности [4]. Это химически чистый полимер, который не содержит лигнина, смол, жиров, гемицеллюлоз, способен к биоразложению и не токсичен. Молекулы бактериальной целлюлозы располагаются строго параллельно друг другу и образуют кристаллические микрофибриллы в 100 раз тоньше микрофибрилл растительной целлюлозы, то есть это структурные элементы наноуровневого размера. Благодаря своим особым свойствам она находит применение в технике, медицине и научных исследованиях, открывая новые горизонты нанотехнологии [4]. БЦ имеет большой потенциал использования в медицине как биоматериал для тканевой инженерии, создания раневых покрытий и трансдермальных терапевтических систем, может использоваться в диетологии в качестве носителя добавок для сбалансированного питания, в промышленной электронике для получения оптически прозрачных соединений с ультранизким коэффициентом теплового расширения, для изготовления акустических диафрагм, способна служить заменой растительной целлюлозы в производстве бумаги. БЦ является перспективным источником получения нанокристаллической целлюлозы и биокомпозиционных материалов [4, 5, 6].
Несмотря на все преимущества бактериального полимера, его крупномасштабное производство и повсеместное использование является довольно дорогостоящим процессом. Это связано с высокой стоимостью компонентов питательных сред (глюкоза, дрожжевой экстракт, пептон и др.), а также с
довольно низкой производительностью процесса биосинтеза. Одним из решений этой проблемы является использование вторичных материальных ресурсов, например, отходов пищевых производств [7, 8-12, 13].
Поскольку меласса представляет собой побочный продукт конечной стадии кристаллизации в процессе производства сахара, она является одним из наиболее экономичных источников углерода в микробиологической промышленности. Меласса содержит около 80 % сухих веществ, из которых около 57 % представлено сахарами (таблица 1). Она также богата белками и органическим азотом. Кроме того, меласса содержит значительное количество серы в виде сульфидов и диоксидов.
Таблица 1 - Химический состав свекловичной мелассы [14]
Характеристика %
Сухие вещества 80 -8 1
Чистота 57 - 58
Белок 11.0 - 12.0
Органический азот 8.0 - 8.5
Редуцирующие сахара 0.1
Общее количество сахаров 57.0
Согласно литературным данным, БЦ образуется в широком диапазоне рН - от 4,0 до 7,0 с оптимумом в районе 5,5 - 6,5 [15]. Существует мнение, что само по себе значение рН не является определяющим фактором при производстве целлюлозы, важно учитывать взаимосвязь между источником углерода и значением рН [16]. Изменение рН отражает биохимические реакции, происходящие в культураль-ной среде (Keshk and Sameshima 2005). Связанный с мембраной фермент глюкозодегидрогеназа окисляет глюкозу до глюконовой кислоты, которая выделяется в окружающую среду, что приводит к понижению рН и отрицательно сказывается на образовании цел-люлозы[17].
Целью данной работы было изучение образования бактериальной целлюлозы на среде с мелассой при различных значениях рН.
Материалы и методы исследования
Объектом исследования являлся продуцент бактериальной целлюлозы Gluconacetobacter sucrofermentans B-11267, выделенный на кафедре биотехнологии, биоинженерии и биохимии Национального исследовательского Мордовского государственного университета [18].
Для поддержания продуцента БЦ использовали агаризованную среду следующего состава, г/л: глюкоза - 10,0, дрожжевой экстракт - 10,0, пептон - 7,0, агар - 15,0, лимонная кислота - 0,2, уксусная кислота - 0,1, этанол - 10,0. рН 5,0-6,0.
Для получения БЦ использовали среду, содержащую мелассу в концентрации 55 г/л. Режим стерилизации 121 °С в течение 20 мин.
Культивирование продуцента осуществляли в конических колбах на 250 мл, содержащих 100 мл среды. Исходным посевным материалом являлась культура на скошенной агаризованной среде. Ино-кулят выращивали на шейкере-инкубаторе ES-20/60 (BIOSAN, Латвия) при скорости перемешивания 250 об/мин и температуре 28 °С в течение одних суток. Полученным инокулятом в количестве 10 % от объема среды засевали опытные колбы, которые затем помещали на шейкер-инкубатор ES-20/60 и осуществляли культивирование при скорости перемешивания 250 об/мин в течение 3 суток. Также культивирование осуществляли в биореакторе объемом 1 л BIOSTAT A plus (Sartorius, Германия) при скорости перемешивания 250 об/мин и температуре 28 °С в течение трех суток.
Полученную БЦ трехкратно обрабатывали 0,1 Н раствором NaOH при 80 °С в течение 30 минут для удаления клеток и компонентов среды. От раствора щелочи целлюлозу отмывали 0,5 % раствором уксусной кислоты и дистиллированной водой до нейтральной реакции. Количество полисахарида определяли весовым методом после высушивания до постоянной массы при температуре 60°С.
Результаты и их обсуждения
Исследовалась динамика образования бактериальной целлюлозы на средах, содержащих 55 г/л мелассы при различных начальных значениях рН ( 3.0, 4.0, 5.0, 6.0) (рис. 1).
Рис. 1 - Динамика образования БЦ при разных начальных значениях рН на среде с мелассой
Согласно представленным данным, наибольшее количество целлюлозы образуется при рН 4.0 -
2,57±0,06 г/л на 3 сутки культивирования. При уменьшении начального значения рН до 3.0 происходит снижение образования полимера почти в три раза. Увеличение значений рН до 5.0 и 6.0 также отрицательно влияет на процесс образования БЦ на среде с мелассой. Таким образом, оптимальным значением рН при культивировании продуцента на среде с мелассой является рН 4,0.
Поскольку о биохимических реакциях, происходящих в культуральной среде, в значительной степени свидетельствуют значения рН, также исследовалась динамика изменения кислотности среды в процессе культивирования G. sucrofermentans В-11267 (рис. 2).
Рис. 2 - Динамика рН культуральной жидкости G. sucrofermentans В-11267 при различных начальных значениях кислотности среды
Показано, что при начальных значениях рН 4.0 и 3.0 кислотность среды практически не меняется. При более высоких значениях рН 5.0 и 6.0 наблюдается повышение значений рН до 8 и 8,5, соответственно на 3 сутки культивирования.
В процессе культивирования бактерий G. sucrofermentans В-11267 на среде с мелассой в колбах образуются агломераты целлюлозы различной формы и размеров (рис. 3).
Рис. 3 - БЦ, полученная на мелассе в шейкере-инкубаторе
Аналогичные исследования проводились в процессе масштабирования в биореакторе BIOSTAT A plus объемом 1 л. В процессе культивирования G. sucrofermentans
B-11267 образовывались крупные агломераты БЦ (рис. 4).
Выход бактериальной целлюлозы в биореакторе на среде с 55 г/л мелассы при начальном значении рН 4.0 составил 3,24±0,02 г/л.
Рис. 4 - БЦ, полученная на мелассе в биореакторе BIOSTAT A plus
Заключение
Показано, что наибольшее количество БЦ образуется на мелассе при начальном значении рН 4.0 - 2,57±0,06 г/л в колбах в шейкере-инкубаторе и 3,24±0,02 г/л в биореакторе на 3 сутки культивирования.
Работа выполнена при финансовой поддержке министерства образования и науки Российской Федерации в рамках базовой части госзадания, проект 2913 «Исследование условий получения новых продуктов и материалов из бактериальной целлюлозы».
Литература
1 Helida Gomes de Oliveira Barud, Robson Rosa da Silva, Hernane da Silva Barud, Carbohydrate polymers, 8, 1-72 (2016).
2 В. В. Ревин, М. В.. В. Лияськина, М. И. Назаркина, А. О. Богатырева, М. В. Щанкин, Актуальная биотехнология, 3, 10, 112-113 (2014).
3 N. Geisel, J. Clasohm, X. Shi, Small, 15, 1-7 (2016)
4 В. В. Ревин, Е. В. Лияськина, Н. А. Пестов, Получение бактериальной целлюлозы и нанокомпозиционных материалов. Издательство Мордов. ун-та, Саранск, 2014. 128 с.
5 Н. Б. Сапунова, А. О. Богатырева, М. В. Щанкин, Е. В. Лияськина, XV Международная конференция молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии» (г.Казань, 13-14 апреля, 2016). БРИГ. С. 233-235.
6 K. Y. Lee, G. Buldum, A. Mantalaris, A. Bismarck, Ma-cromolecular bioscience, 14, 10-32 (2014).
7 Michael Schankin, Alena Bogatyreva, Natalia Sapunova, Elena Paramonova, Elena Liiaskina, Nikolay Pestov, Victor Revin, Journal of Biotechnology, 231, 49-50 (2016).
8 А. О. Богатырева, Е. В. Лияськина, В. В. Ревин, сб. статей Международной научно-практической конференции, Уфа, Аэтерна, 2014, С. 19-21.
9 Пат. РФ 2536973 (2013)
10 М. В. Щанкин, Е. В. Лияськина, В. В. Ревин, сб. статей Международной научно-практической конференции, Уфа, Аэтерна, 2014, С. 33-35.
11 Elena V. Liiaskina, Victor V. Revin, Mariya I. Nazarkina, J. Biotechnol., 185, 35 (2014).
12 Elena Liiaskina, Victor Revin, Mariya Nazarkina, Alena Bogatyreva, Mikhail Shchankin., J. Biotechnol., 208, 117 (2015).
13 M. A. Sherif, M. A. Taha, J. Microbiol. Biotechnol., 2, 187-191 (2002).
14 S. Bae, M. Shoda, Biotechnol., 20, 1366-1371 (2004).
15 E. P. Coban, H. Biyik, J. Microbiol Res., 5, 1037-45 (2011).
16 SA Hutchens, RV Leo, HM O'Neill, BR Evans, Lett Appl Microbiol., 44, 175-80 (2007).
17 S. Keshk, K. Sameshima, African J Biotechnol., 4, 478-82 (2005).
18 Пат. РФ 2523606 (2013)
© Н. Б. Сапунова, асп. каф. биотехнологии, биоинженерии и биохимии, Национальный исследовательский Мордовский государственный университет; МГУ им. Н. П. Огарева, natasha-sapunva@rambler.ru; А. О. Богатырева, асп. той же кафедры, Bogatyrevaao@mail.ru; М. В. Щанкин, асп. той же кафедры, Schankinmv@mail.ru; Е. В. Лияськина, канд. биол. наук, доцент той же кафедры, liyaskina@yandex.ru; В. В. Ревин, профессор той же кафедры, revinvv2010@yandex.ru.
© N. B. Sapunova, postgraduate student by department of biotechnology, bioengineering and biochemistry, State Budgetary Educational Institution of Higher Education "National Research Ogarev Mordovia State University", natasha-sapunva@rambler.ru; A. O. Bogatyreva, postgraduate student the same Department, Bogatyrevaao@mail.ru; M. V. Schankin, postgraduate student the same Department, Schankinmv@mail.ru; E. V. Liyaskina, Cand. Sc. {Biology}, associate professor the same Department, liyaski-na@yandex.ru; V. V. Revin, professor by the same Department, revinvv2010@yandex.ru.
