CC BY
52
Полногеномный анализ однонуклеотидных полиморфизмов в изучении молекулярной эпидемиологии холеры и эволюционной истории возбудителя
Л.В. Миронова (mironova-lv@yandex.ru), С.В. Балахонов
ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора
Резюме
Интенсивное развитие технологий полногеномного секвенирования в последние годы обеспечило возможность эффективного генотипирования микроорганизмов на основе детекции в геноме однонуклеотидных полиморфизмов - SNP (от англ. single nucleotide polymorphisms). Такой подход характеризуется достаточно высокими информативностью, точностью, скоростью и разрешающей способностью.
В обзоре представлены общие характеристики SNP-типирования, а также основные направления и результаты его применения в молекулярной эпидемиологии, филогенетическом анализе, реконструкции эволюционных событий и выяснении направлений дивергенции возбудителя холеры. Рассмотрены вопросы установления с применением полногеномного SNP-типирования происхождения и родства пандемичных клонов возбудителя холеры, закономерностей эволюционных преобразований и распространения этиологического агента седьмой пандемии, вероятных путей заноса и генетической гетерогенности клона Vibrio cholerae, обусловившего эпидемические осложнения в странах Карибского бассейна.
Ключевые слова: Vibrio cholerae, однонуклеотидные полиморфизмы, высокопроизводительное полногеномное секвенирова-ние, филогения, эволюция, молекулярная эпидемиология
Whole-Genome Analysis of Single-Nucleotide polymorphisms in Study of cholera Molecular Epidemiology and agent Evolutionary History
L.V. Mironova (mironova-lv@yandex.ru), S.V. Balakhonov
Federal State Institution of Public Health «Irkutsk Antiplague Research Institute» of Federal Service on Customers' Rights Protection
and Human Well-Being Surveillance
abstract
In recent years intensive development of whole-genome sequencing technologies has provided a possibility of effective microorganism genotyping on a basis of Single Nucleotide Polymorphisms detection (SNPs) in a genome. Such approach is characterized by enough high information value, accuracy, rate and resolution.
In the review general characteristics of SNP-typing and also the basic directions and results of its application in molecular epidemiology, phylogenetic analysis, reconstruction of evolutionary events and identification of Vibrio cholerae divergence directions are presented. Problems of an origin determination using whole genome SNP-typing and relationship of pandemic V. cholerae clones, patterns of evolutionary transformations and distribution of the seventh pandemic etiological agent, probable ways of importation and genetic heterogeneity of the V. cholerae clone caused epidemic complications in the Caribbean countries are considered. Key words: Vibrio cholerae, single-nucleotide polymorphisms, high-throughput whole-genome sequencing, phylogeny, evolution, molecular epidemiology
В основе эволюции микроорганизмов лежит уникальная пластичность их геномов. Генетические преобразования (мутации, геномные перестройки, горизонтальный перенос генетической информации), происходящие в гетерогенных микробных популяциях под воздействием окружающей среды, приводят к дивергенции дочерних линий и формированию новых, в том числе высокопатогенных, клонов микроорганизмов [1 - 3]. Один из распространенных вариантов геномных перестроек - точечные мутации, возникающие в
процессе репликации ДНК и заключающиеся в замене одного нуклеотида на другой, - так называемые нуклеотидные замены [4, 5]. Нуклеотидные позиции в геноме, для которых в популяции установлены варианты (обусловленные заменой ну-клеотидов), получили название однонуклеотидных полиморфизмов - SNP (от англ. single nucleotide polymorphisms), а метод молекулярного типирова-ния на основе анализа таких полиморфизмов -SNP-генотипирование. При этом основным критерием для отнесения нуклеотидной вариации к SNP
является частота встречаемости вариабельной аллели в популяции. Она должна составлять 1% и более [6], аллели с более низкой частотой встречаемости обозначаются как редкие мутации (вариации). Тем не менее чаще всего этим критерием пренебрегают и все выявленные при анализе генома вариации нуклеотидов относят к SNP.
Однонуклеотидные полиморфизмы характеризуются достаточно высокой плотностью в геноме, что служит одним из критериев эффективности их использования в молекулярном типировании для оценки популяционного разнообразия, выяснения закономерностей эволюции и филогенетического родства изучаемых объектов. Так, установлено, что в геноме человека встречается в среднем один полиморфизм на 1000 пар оснований [7, 8], для генома микроорганизмов характерна более высокая плотность SNP [9]. Однако очень высокая плотность SNP в определенных участках генома может свидетельствовать о рекомбинационном происхождении данной области, что соответственно снижает эффективность использования скрининга нуклеотидной вариабельности локуса при филогенетическом анализе. Для SNP-генотипирования микроорганизмов рекомендуется использовать полиморфизмы, локализованные в консервативной части генома, которые встречаются с плотностью менее одного на 300 оснований [9]. В то же время в оперативном эпидемиологическом анализе при выяснении закономерностей распространения возбудителя высокоинформативными могут оказаться выявление и характеристика однонуклео-тидных замен - независимо от их локализации в геноме. При этом SNP-генотипирование максимально эффективно в расследовании вспышек, обусловленных патогенами, для которых характерна высокая скорость накопления геномных вариаций в популяции [10]. Так, при молекулярно-эпидемио-логическом анализе вспышки, вызванной карба-пенем-резистентным клоном Klebsiella pneumoniae в Клиническом центре Национального института здоровья США в 2011 году, полногеномное SNP-типирование позволило провести реконструкцию путей распространения возбудителя и установить три независимых направления передачи инфекции от одного источника. При этом часть SNP, имеющих дифференцирующее значение, оказалась локализована в структуре генов резистентности к антибактериальным препаратам [11].
Другим критерием, определяющим возможность использования однонуклеотидных полиморфизмов в качестве маркеров для молекулярного типирования и эволюционного анализа, является их стабильность в геноме исследуемого объекта. Установлено, что SNP имеют достаточно низкий уровень мутаций на поколение (~10-8) [12]. Стабильность сохранения SNP в популяции связана с их локализацией. Расположение замены в кодирующей области генома повышает вероятность элиминации особи с данной мутацией из популя-
ции. При этом высокому селективному давлению подвержены так называемые несинонимичные замены, приводящие к замене кодируемой триплетом аминоксилоты, а также нонсенс-мутации, в результате которых происходит замена триплета с кодирующего на стоп-кодон [4, 13]. Синонимичные нуклеотидные замены и SNP в некодирующей области генома характеризуются большей стабильностью и более распространены в сравнении с другими видами замен: в среднем, по опубликованным данным, SNP в некодирующих областях составляют 50%, а синонимичные в кодирующих - 25% от всех известных полиморфизмов [8]. Традиционно для оценки типа селективного давления, действующего на геном, применяется расчет соотношения частот несинонимичных и синонимичных замен (dN/ ds): показатель меньше единицы свидетельствует о действии стабилизирующего отбора, равный единице - нейтрального и более единицы - диверсифицирующего [4, 14]. Вместе с тем в отдельных случаях для близкородственных геномов этот показатель может оказаться на уровне единицы и выше в одной клональной линии, что чаще всего обусловлено малым периодом времени, прошедшим с даты мутационного события, и невозможностью реализации в этот ограниченный временной отрезок очищающего отбора [14].
Подходы к выявлению однонуклеотидных полиморфизмов в геноме достаточно разнообразны и классифицируются в зависимости от принципа используемого метода. В частности, одним из первых применяемых с этой целью методов считается анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции, позволяющий выявлять известные нуклеотидные замены в специфических сайтах рестрикции ДНК [6]. В настоящее время используются скрининг SNP на ДНК-микрочипах, масс-спектрометрический анализ, секвенирование отдельных содержащих однонуклеотидные полиморфизмы участков генома, различные варианты амплификационного анализа, в том числе аллель-специфическая ПЦР, и целый ряд других методов [15 - 19].
Интенсивное развитие SNP-генотипирование микроорганизмов получило с разработкой технологий высокопроизводительного полногеномного секвенирования (high-throughput whole-genome sequencing) второго поколения и созданием в последние годы мономолекулярного ультравысокопроизводительного секвенирования (ultra high-throughput whole-genome sequencing) третьего поколения [10, 20 - 22]. Применяющиеся платформы высокопроизводительного массового параллельного секвенирования позволяют генерировать большие массивы данных о структуре геномов целевых объектов с высокими точностью, скоростью и разрешающей способностью [10, 20]. При этом тенденция к снижению стоимости исследования, сокращению времени получения результата, миниатюризации приборов, оптимизации лабораторных
протоколов способствует интеграции полногеном-номого секвенирования не только в научные исследования, но и в практику лабораторий клинической диагностики и систему эпидемиологического надзора за инфекционными заболеваниями [21 - 23].
Так, определение полной нуклеотидной последовательности геномов бактерий стало надежным инструментом в разных отраслях микробной геномики, в частности в анализе структурной организации генов вирулентности (вирулом), метаболизма (метаболом), антибиотикорезистентности (резистом); в таксогеномике - для идентификации видов на основании определения структуры филогенетически информативных генов микроорганизмов; в метагеномике - для изучения особенностей генетической организации микробных сообществ [10, 20 - 24].
Применение массового параллельного секве-нирования обеспечивает возможность обнаружения однонуклеотидных полиморфизмов по всему геному исследуемого объекта и сопоставления полученных результатов с геномными базами данных на сетевых ресурсах. Такой подход, несомненно, оказывается наиболее информативным в филогенетическом анализе при изучении эволюционной истории микроорганизмов в пределах как различных таксономических групп, так и одной клональ-ной линии [14, 20, 25]. Особое место полногеномное SNP-генотипирование занимает при изучении филогении высококлональных мономорфных микроорганизмов, таких как Yersinia pestis, Bacillus anthracis, Salmonella typhi, в связи с низкой вариабельностью других маркеров в их геноме [21, 25].
Кроме того, возможность сравнения анализируемых геномов с разрешением в один нуклеотид определяет полногеномное секвенирование как мощный инструмент в молекулярно-эпидемиоло-гическом анализе как при локальных эпидемических осложнениях с оценкой микроэволюционных изменений патогенов в объектах окружающей среды и организме хозяина (в т.ч. и патоадаптив-ных генетических изменений, приводящих к формированию клонов с повышенным патогенным потенциалом), так и при широкомасштабных проспективных эпидемиологических исследованиях для оценки глобальных тенденций распространения отдельных клонов возбудителей [20 - 22, 26]. Так, проведенный по результатам исследования полных геномов анализ послужил основой гипотез о механизмах появления и распространения метициллин-резистентных клонов Staphylococcus aureus [20, 27], высокопатогенных клонов Clostridium difficile с множественной лекарственной устойчивостью [28], высоковирулентного ши-га-токсинпродуцирующего энтероагрегативного штамма Escherichia coli 0104:H4 [29] и др.
Таким образом, высокая частота встречаемости в популяции, плотность и стабильность однонуклео-тидных полиморфизмов, а также наличие широкого круга подходов для их выявления (в том числе
платформ для высокопроизводительного секвенирования нового поколения) определяют SNP-генотипирование как эффективный, обладающий высокой разрешающей способностью и воспроизводимостью метод. Вместе с тем существуют и проблемные моменты применения SNP-типирования микроорганизмов на основе полногеномного сек-венирования: сложность анализа данных при получении коротких прочтений, необходимость использования строгих критериев для отнесения вариабельного нуклеотида к SNR проблемы в идентификации повторяющихся последовательностей и гомополимеров, потребность в проведении биоинформационного анализа больших объемов данных [21, 23, 30]. Решение этих вопросов возможно при одновременном использовании нескольких платформ для секвенирования или технологий, обеспечивающих генерирование более длинных прочтений. Для оптимизации подходов к биоинформационной характеристике данных требуется разработка стандартных алгоритмов анализа.
Детекция однонуклеотидных замен достаточно успешно применяется в молекулярной эпидемиологии, реконструкции эволюционных событий и выяснении направлений дивергенции возбудителя холеры.
В частности, идентификация нуклеотидных замен в генах патогенности холерного вибриона используется для генотипирования и оценки тенденций эволюционных преобразований патогенного потенциала этиологического агента холеры, а также анализа глобального распространения отдельных клональных линий. Так, на основании определения генотип-специфических нуклеотидных замен в гене субъединицы В холерного токсина установлено существование различных генотипов, ассоциированных с биоваром и серогруппой холерного вибриона. Первый генотип (йхВ1) специфичен для V. cholerae серогруппы О1 классического биовара, второй СхВ2) - для V. ^о1егае О1 Эль-Тор из Австралии; третий {^хВ3) - для типичных V. ^о1егае О1 Эль-Тор, а также штаммов V. ^о1егае серогруппы О139; генотипы &хВ4-6 выявлены только в штаммах серогруппыО139, йхВ7 - в атипичных вариантах V. cholerae Эль-Тор серогрупп О1 и О139, &хВ8-9 - в штаммах V. ^о1егае серогрупп О27 и О37 соответственно [31 - 34]. Известно, что на современном этапе седьмой пандемии холеры произошла замена типичных V. ^о1егае еНог атипичными генетически измененными вариантами с повышенным патогенным потенциалом, несущими классическую аллель гена субъединицы В холерного токсина - &хВ1 [32 - 34]. Атипичные варианты вибриона Эль-Тор не только широко распространились в эндемичных странах, но и послужили причиной эпидемических осложнений на свободных от холеры территориях [32 - 38]. Более того, в последние годы обнаружен новый клон V. cholerae еЮ с дополнительной заменой в позиции 58 гена с1хВ классического типа СхВ7-аллель). Указан-
ный вариант V. cholerae eltor вызвал серьезные эпидемические осложнения на острове Гаити с последующим заносом возбудителя в другие страны Карибского бассейна, Северную и Южную Америку и Европу [33, 39]. V. cholerae eltor с ctxBZ-аллелью гена субъединицы В холерного токсина идентифицирован также в Индии, Непале, Камеруне, Шри-Ланке и других странах [40 - 43].
Однонуклеотидные вариации обнаружены и в других генах СТХ профага [44], а также в «острове патогенности» VPI-I атипичных вариантов вибриона Эль-Тор. Так, N.A. Hasan с соавт. [45] показали наличие в структуре гена rstB штаммов с острова Гаити, наряду с делецией GTA в позициях 77 - 79, характерной для вибрионов классического биовара, двух однонуклеотидных полиморфизмов: A - G в позиции 192 (уникального для штаммов с о. Гаити) и G - A в позиции 108 (обнаруженного ранее в штаммах из Мексики) [45]. Кроме того, в гаитянских штаммах выявлена измененная аллель гена токсин-корегулируемых пилей адгезии tcpA с одно-нуклеотидной заменой в 266-й позиции - аллель tcpACIRS, обнаруженная ранее в штамме CIRS 101 из Бангладеш [43]. Указанные нуклеотидные замены можно рассматривать в качестве дополнительных генетических маркеров данной клональной линии вибрионов Эль-Тор.
Исследование генетической детерминированности устойчивости к антибактериальным препаратам в ряде случаев также основывается на скрининге нуклеотидных замен в генах-мишенях [46]. В частности, при установлении механизмов резистентности эпидемического штамма с острова Гаити показано, что его устойчивость к налидик-совой кислоте и сниженная чувствительность к ципрофлоксацину обусловлены заменами в генах gyrA (Ser83Ile) и parC (Ser85Leu). Структурным же анализом интегративного конъюгативного элемента ICEVchHai1, несущего часть приобретенных генов резистентности, и сопоставлением его полной нуклеотидной последовательности с семью подобными интегронами выявлена высокая степень гомологии указанного элемента с ICEVchInd5, обнаруженным в штаммах из Индии. При этом различия ICEVchHai1 и ICEVchInd5 заключаются в наличии пяти нуклеотидных замен в структуре указанных локусов [47].
Филогенетические исследования c применением SNP-анализа, направленные на выяснение происхождения и родства пандемичных клонов возбудителя холеры, проведены L. Feng с соавт. [48]. На основании сопоставления полной нуклеотид-ной последовательности геномов штамма шестой пандемии, предпандемичного изолята и штамма седьмой пандемии авторы проводили датирование времени дивергенции клонов с учетом концепции молекулярных часов, в соответствии с которой принято считать, что для конкретной генетической последовательности скорость эволюции постоянна во времени [4, 48]. При этом для повышения
достоверности расчета из анализа исключались рекомбинационные области генома и учитывались только мутационные SNP коровой области. В результате показано, что расхождение клонов шестой и седьмой пандемий произошло примерно в 1880 году и патогенный потенциал пандемичных клонов формировался независимо друг от друга посредством приобретения или утраты отдельных генетических блоков [48].
Для выяснения закономерностей эволюционных преобразований и распространения в мире этиологического агента седьмой пандемии C. Lam с соавт. проводили SNP-генотипирование коллекции из 64 изолятов V. cholerae, выделенных в различные временные периоды на разных территориях [49]. Исследование предусматривало детекцию 30-ти локализованных на обеих хромосомах холерного вибриона мутационных SNP (в т.ч. 18-ти специфичных для серогруппы О1 и 12-ти -для серогруппы О139), отобранных как наиболее информативные при сравнении полных геномов V. cholerae (M66-2, N16961, MJ-1236), опубликованных на сайте NCBI. Кластерный анализ результатов типирования исследуемых изолятов и группы ранее охарактеризованных на основании полных (V. cholerae M66-2, N16961, MJ-1236) или частично секвенированных геномов (V. cholerae M010, RC9, B33, CIRS 101) штаммов выявил десять SNP-профилей, объединенных в шесть групп. При этом общность профилей отдельных групп штаммов послужила основанием для заключения о вероятности заноса возбудителя в Латинскую Америку из Африки, а не из Азии, как считалось ранее. Вместе с тем присутствие изолятов из Африки в трех разных SNP-группах, наряду с присутствием в тех же группах азиатских изолятов, свидетельствует о неоднократных заносах эпидемических клонов на Африканский континент из Азии. Ступенчатость филогенетического дерева позволила авторам сделать вывод о последовательной эволюции холерного вибриона в период седьмой пандемии [49].
Данное предположение нашло подтверждение при полногеномном анализе однонуклеотидных полиморфизмов в группе из 154 штаммов V. cholerae, включающей 131 изолят седьмой пандемии [50]. В результате кластерного анализа изоляты биоваров классического и Эль-Тор вошли в состав отдельных дистанцированных филогенетических линий, не объединенных общим предком, что послужило основанием для вывода о разной эволюционной истории клонов шестой и седьмой пандемий. Группа штаммов седьмой пандемии оказалась моно-филетической, с наличием от 50 до 250 SNP в консервативной части генома, по сравнению с референсным штаммом V. cholerae eltor N16961, что может служить доказательством единого источника происхождения данной группы. При датировании эволюционных событий расчетная скорость накопления мутаций в этой группе составила 3,3 SNP в год с частотой 8,33 х 10-7 SNP на сайт в год.
На основании указанных расчетов установлен вероятный период существования общего предка группы штаммов седьмой пандемии 1827 - 1936 годов, что согласуется с данными о первичном обнаружении вибриона Эль-Тор в 1905 году. Байесовский анализ структуры популяции штаммов седьмой пандемии выявил дифференциацию филогенетического дерева на три клады, которые отражают три волны распространения холеры и ассоциированы с особенностями организации генетического элемента CTX V. cholerae. Учитывая клональную кластеризацию изолятов седьмой пандемии, постоянную скорость накопления SNP, выявленные особенности временного и пространственного распространения, авторы пришли к выводу о глобальном распространении этиологического агента седьмой пандемии из одного источника (Бенгальский залив) тремя отдельными, но перекрывающимися волнами. При этом установленная относительно невысокая генетическая вариабельность коровой части генома возбудителя обусловлена, по мнению авторов, его периодическими эволюционными изменениями в указанном источнике [50].
Комплексные филогеографические исследования с применением полногеномного SNP-генотипирования проведены для установления происхождения и вероятных путей заноса клона V. cholerae, обусловившего продолжающуюся с октября 2010 года эпидемию на острове Гаити, которая впоследствии распространилась на ряд других стран Карибского бассейна.
C.S. Chin с соавт. [39] с использованием мономолекулярного секвенирования в реальном времени двух клинических изолятов с острова Гаити и последующего сравнения результатов с данными секвенирования группы различающихся географически и по времени выделения штаммов пришли к выводу о трансконтинентальной импортации клона возбудителя холеры на остров из Южной Азии, поскольку и при сопоставлении однонуклеотидных вариаций в структуре 1588-ми консервативных генов-ортологов, и при генотипи-ровании по 30-ти максимально информативным SNP гаитянские штаммы кластеризовались со штаммами V. cholerae, изолированными в Бангладеш. Изоляты же из Латинской Америки оказались расположенными в гетерологичных группах, что исключает ранее сформулированную гипотезу о вероятности заноса холерного вибриона на Гаити с данной территории [39]. Результаты этих исследований стали важным моментом в выяснении причин развития эпидемии холеры в регионе Карибского бассейна. Филогенетическое родство изолятов из Гаити и Доминиканской Республики со штаммами из Южной Азии установлено также R. Sealfon с соавт. [51].
Альтернативное заключение о вероятном направлении заноса инфекции на Гаити сделано при анализе SNP в 632-х ортологичных генах группы гаитянских штаммов, изолированных в разные
временные периоды эпидемии (2010 - 2011 гг.), и коллекции V. cholerae из стран Азии и Африки [52]. Авторами показана кластеризация штамма из Гаити с тремя эпидемиологически не связанными изо-лятами из Камеруна и США (занос из Индии), с максимальным сходством с изолятом из Камеруна, различия с которым у гаитянских штаммов составили от четырех до семи нуклеотидов.
Исследование генетического разнообразия и эволюционной истории V. cholerae на острове Гаити на основании сравнения особенностей структуры 992 генов-ортологов также выявило кластеризацию гаитянских изолятов со штаммами из Камеруна, Бангладеш, Индии и Зимбабве [45].
R.S. Hendriksen с соавт. с целью проверки гипотезы о заносе холеры на Гаити из Непала миротворцами ООН и установления взаимосвязей эпидемических осложнений на указанных территориях осуществляли сопоставление полных геномов 24 штаммов из Непала и 10-ти ранее секвениро-ванных штаммов (в т.ч. трех изолятов с острова Гаити) [53]. Реконструкция филогенетического древа показала, что все изоляты из Непала принадлежат к одной монофилетической линии, которая включает и штаммы из Бангладеш и Гаити. При этом часть изолятов из Непала и все исследуемые с острова Гаити входят в один из кластеров этой линии (различия нуклеотидных последовательностей внутри кластера составляют лишь 1 - 2 SNP), что определяет близкое генетическое родство указанных V. cholerae и подтверждает непальское происхождение эпидемии на Гаити. Авторами отмечено, что дифференцирующие однонуклеотидные полиморфизмы в группе гаитянских штаммов относятся к несинонимичным, а соотношение dN/ds составляет больше единицы, свидетельствуя о действии диверсифицирующего отбора в данной линии и возможных селективных преимуществах гаитянских изолятов [53].
S.B. Pun, анализируя полученные R.S. Hendriksen с соавт. результаты, предположил, что вывод о непальском происхождении вспышки холеры на Гаити мог оказаться ошибочным в связи с нерепрезентативностью исследованной выборки V. cholerae и, соответственно, включение в филогенетический анализ изолированных в последние годы на территории других стран Азии штаммов может привести к изменению заключения о происхождении гаитянского клона V. cholerae [54].
Однако проведенное L.S. Katz с соавт. филогенетическое исследование с включением в анализ 108 штаммов, в том числе изолятов, представляющих эпидемические осложнения последних лет в странах Азии и Африки, подтвердило непальское происхождение эпидемии на Гаити [55]. На сконструированной по результатам скрининга 566 SNP в ортологичных генах дендрограмме все гаитянские изоляты и три непальских вошли в одну мо-нофилетическую группу, подтверждая тем самым близкое родство указанных групп штаммов.
Таким образом, анализ однонуклеотидных поли-мофизмов на основании полногеномного секвени-рования представительных коллекций V. cholerae позволил сделать убедительные выводы о филогенетической истории и направлении заноса эпидемического клона холерного вибриона на территорию Гаити.
Наряду с этим существенный интерес представляет и оценка перспективности использования полногеномного секвенирования и SNP-типирования для молекулярно-эпидемиологического анализа и изучения эволюционных преобразований ограниченной в пространстве популяции V. cholerae на примере столь длительной эпидемии холеры на острове Гаити. Так, A.R. Reimer с соавт. [52] при анализе микроэволюционного генетического разнообразия среди гаитянских штаммов по SNP в 632 генах-ортологах установили, что выделенные на территории острова Гаити в 2010 - 2011 годах исследуемые штаммы отличались друг от друга не более чем на два SNP коровой области генома. Несущественными различия оказались и при сопоставлении полногеномных последовательностей анализируемых штаммов с двумя охарактеризованными ранее клиническими изолятами [39] -выявлены лишь три однонуклеотидные вариации [52]. Эти данные подтверждают клональное происхождение вспышки на Гаити.
При SNP-генотипировании представительной коллекции штаммов седьмой пандемии с использованием схемы, включающей анализ 277 SNP, в том числе 70-ти синонимичных, 169-ти несинонимичных и 38-ми нуклеотидных полиморфизмов в межгенной области, локализованных как на большой, так и на малой хромосоме, удалось установить географические особенности распространения отдельных SNP-профилей [45]. Так, в геноме изоля-тов с острова Гаити выявлено 12 однонуклеотидных полиморфизмов, обозначенных как «Гаити-специфические SNP» (Haiti-specific SNPs), дистанцирующих данные изоляты от других на дендрограмме. Кроме того, показано и существование микроэволюционных процессов в популяции циркулирующих в период эпидемии V. cholerae, поскольку в группе гаитянских штаммов наряду с вариабельностью состава и структуры отдельных мобильных генетических элементов (RS1, TLC) обнаружено как минимум пять изолят-специфических SNP [45]. Эти данные подтверждают значимость использования детекции однонуклеотидных полиморфизмов в молекулярной эпидемиологии для углубленного анализа эпидемических проявлений холеры.
R. Sealfon с соавт. [51] для оценки динамики генетической изменчивости холерного вибриона в период эпидемии провели полногеномный анализ трех изолятов, выделенных на Гаити в октябре 2010 года и одного - в Доминиканской Республике в январе 2011 года. В этой группе штаммов выявлено четыре уникальных однонуклеотидных полиморфизма, в том числе один - в CTX-элементе,
один - в SXT и два - в коровой части генома. Следует отметить, что три из этих SNP дифференцируют штаммы с острова Гаити и из Доминиканской Республики. Результаты скрининга SNP согласуются с установленной ранее для холерного вибриона скоростью накопления нуклеотидных замен в коровой области генома, составляющей 3,3 SNP в год, и свидетельствуют о динамических генетических преобразованиях популяции V. cholerae в период эпидемии, обусловленных, по всей вероятности, адаптацией патогена к условиям существования в организме хозяина или в окружающей водной среде [51].
Другой группой исследователей с целью выяснения вариантов и темпов эволюции популяции V. cholerae в период эпидемии на Гаити проведен филогенетический и байесовский анализ коллекции из 108 штаммов V. cholerae, изолированных как на разных территориях в период эпидемических осложнений на острове Гаити (2010 - 2012 гг.), так и в Южной Азии и на Африканском континенте [55]. Первоначальный скрининг коллекции по структуре 566 генов коровой области показал объединение в одну группу всех гаитянских изолятов и трех штаммов из Непала. Дальнейший кластерный анализ по 45hq SNP (high-quality SNP) в группе гаитянских и непальских штаммов продемонстрировал расхождение на дендрограмме многочисленных линий от одного генотипа, преобладающего в начальный период эпидемии, что свидетельствует о дивергенции изолятов от одного общего предшественника и подтверждает гипотезу о том, что изоляты являются частью одной вспышки, а не представителями вторичных заносов [55, 56]. При этом обнаруженные авторами нуклеотидные полиморфизмы (от одного до шести для отдельных штаммов) в штаммах согласуются с эпидемиологическими данными [57]. Так, датированная филогения с использованием молекулярных часов показала существование последнего общего предка нуклеотидных последовательностей гаитянских штаммов 28 сентября 2010 года (в пределах 23 июля - 17 октября 2010 г., ДИ -95%). Оказалось, что доверительный интервал включал в себя дату прибытия непальских солдат на остров Гаити (9 октября 2010 г.) и первый случай госпитализации больного холерой (17 октября 2010 г.). Эти результаты подтверждают значимость полногеномного секвенирования при эволюционном анализе популяции патогена для определения сроков отдельных событий в пределах эпидемического осложнения, а также отслеживания путей распространения вспышечных клонов.
Полногеномное SNP-генотипирование использовалось при изучении популяционной динамики и направлений распространения V. choleare в период вспышки холеры в Пакистане, зарегистрированной в 2010 году после серьезного наводнения [58]. При построении глобальной филогении по алгоритму максимального правдоподобия на основании SNP в геноме 38 изолятов из Па-
кистана и 146-ти доступных полногеномных последовательностей холерного вибриона было установлено, что изоляты из Пакистана дифференцируются на две отдельные субклады и PSC2) в соста-
ве третьей волны распространения седьмой пандемии. При сопоставлении эволюционных дистанций прослеживается филогеографическая корреляция между частотой мутаций, датой изоляции и направлением распространения изолятов отдельных субклад на территории Пакистана. Так, изоляты PSC1 были обнаружены преимущественно в прибрежных морских районах, тогда как изоляты субклады PSC2 распространились внутри страны и оказались связаны с паводковой ситуацией (первые изоляты этой клады с меньшим количеством нуклеотидных замен обнаружены у истока реки Инд в начале наводнения, последующие, с большим количеством SNP, - ниже по течению реки в более поздние сроки вспышки) [58].
Филогенетический анализ консервативной части генома, по данным полногеномного секвениро-вания, также успешно применялся для выяснения происхождения выделенных на территории Ростовской области штаммов V. cholerae еЮ [59], установления генетического родства изолированного от больного в 2013 году в Китае штамма серогруп-пы О139 [60].
Таким образом, SNP-типированиие на основе высокопроизводительного полногеномного секве-
нирования оказывается перспективным эффективным подходом как в изучении филогенетической истории возбудителя холеры, датировании эволюционных событий, установлении закономерностей формирования новых клонов патогена в глобальном масштабе, так и в молекулярно-эпидемиологическом анализе при выяснении микроэволюционных генетических преобразований популяции V. chо1егае, путей заноса и распространения возбудителя в период отдельных эпидемических осложнений. При этом в эпидемиологическом анализе значимы не только установление мутационных изменений в консервативной части генома, скорость накопления которых невелика и может быть недостаточна для дифференциации отдельных изолятов в пределах вспышки, но и структурный анализ полиморфизмов мобильных генетических элементов. Вместе с тем необходимо отметить, что для повышения достоверности полученных по результатам полногеномного секвени-рования выводов о происхождении, эволюции и распространении клонов возбудителя требуются стандартизация подходов к получению, анализу и аннотации данных, расширение глобальных баз данных, содержащих информацию о нукле-отидных последовательностях геномов штаммов V. cholerae с различными пространственно-временными характеристиками и эпидемическим потенциалом. ■
Литература
10. 11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21. 22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
Darmon E., Leach D.R.F. Bacterial genome instability. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014; 78 (1): 1 - 39. Rocha E.P.C. The organization of the bacterial genome. Annu. Rev. Genet. 2008; 42: 211 - 233.
Brilli M., ит P, Lacroix V., Sagot M.F. Short and long-term genome stability analysis of prokaryotic genomes. BMC Genomics. 2013; 14: 309. Лукашов B.B. Молекулярная эволюция и филогенетический анализ. Москва: БИНОМ. Лаборатория знаний; 2009. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика: Учебное пособие. 2-е изд. Новосибирск: Сиб. ун-т. изд-во; 2003. Brookes A.J. The essence of SNPs. Gene. 1999; 234: 177 - 186.
Collins F.S., Brooks L.D., Chakravarti A. A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation. Genome Res. 1998; 8: 1229 - 1231.
Shastry B.S. SNPs: impact on gene function and phenotype. Meth. Mol. Biol. 2009; 578: 3 - 22.
Van Belkum A., Tassios P.T., Dijkshoorn L., Haeggman S., Cookson B., Fry N.K. et al. Guidelines for the validation and amplication of typing methods for use in bacterial epidemiology. J. Clin. Microbiol. and Infect. Dis. 2007; 13: 1 - 46.
Bertelli C., Greub G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clin. Microbiol. Infect. 2013;19 (9): 803 - 813. Snitkin E.S., Zelazny A.M., Thomas P.J., Stock F., Tracking a hospital outbreak of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae with whole-genome sequencing. (NISC comparative sequencing program, Henderson D.K., Palmore T.N., Segre J.A. Sci. Transl. Med. 2012; 4: 148ra116. Crow J.F. Spontaneous mutation as a risk factor. Exp. Clin. Immunogen. 1995; 12: 121 - 128.
Foley S.L., Lynne A.M., Nayak R. Molecular typing methodologies for microbial source tracking and epidemiological investigations of gram-negative bacterial foodborne pathogens. Infection, Genetics and Evolution. 2009; 9: 430 - 440.
Parkhill J., Wren B.W. Bacterial epidemiology and biology - lessons from genome sequencing. Genome Biology. 2011; 12: 230. Komar A.A. Single nucleotide polymorphisms methods and protocols. Second Edition. Humana Press; 2009.
Hrabak J., Chudackova E., Walkov R. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization - time of flight (MALDITOF) mass spectrometry for detection of antibiotic resistance mechanisms: from research to routine diagnosis. Clin. Microbiol. Rev. 2013; 26 (1): 103.
Lechner D., Lathrop G.M., Gut I.G. Large-scale genotyping by mass-spectrometry: experience, advances and obstacles. Curr. Opin. Chem. Biol. 2002; 6: 31-38 Zhang W., Qi W., Albert T.J., Motiwala A.S., Alland D., Hyytia-Trees E.K. et al. Probing genomic diversity and evolution of Escherichia coli O157 by single nucleotide polymorphisms. Genome Res. 2006; 16: 757 - 767.
Tyagi S., Bratu D.P, Kramer F.R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 1998; 16: 49 - 53.
Didelot X., Bowden R., Wilson D.J., Peto T.E.A., Crook D.W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat. Rev. Genet. 2012;13 (9): 601 - 612.
Sabat A.J., Budimir A., Nashev D., Sa-Lero R., van Dijl J.M., Laurent F. et al. Overview of molecular typing methods for outbreak detection and epidemiological surveillance. Euro Surveill. 2013; 18 (4): 20380.
Struelens M.J., Brisse S. From molecular to genomic epidemiology: transforming surveillance and control of infectious diseases. Euro Surveill. 2013; 18 (4): 20386.
Sibley C.D., Peirano G., Church D.L. Molecular methods for pathogen and microbial community detection and characterization: сurrent and potential application in diagnostic microbiology. Infection, Genetics and Evolution. 2012; 12: 505-521.
Chun J., Rainey F.A. Integrating genomics into the taxonomy and systematics of the Bacteria and Archaea International Journal of Systematic and Evolutionary. Microbiology. 2014; 64: 316 - 324.
Achtman M. Insights from genomic comparisons of genetically monomorphic bacterial pathogens Phil. Trans. R. Soc. B. 2012; 367: 860 - 867. Walker M.J., Beatson S.A. Outsmarting оutbreaks. Science. 2012; 338: 1161 - 1162.
Harris S.R., Feil E.J., Holden M.T.G., Quail M.A., Nickerson E.K., Chantratita N. et al. Evolution of MRSA during hospital transmission and intercontinental spread. Science. 2010; 327: 469 - 474.
He M., Miyajima F., Roberts P., Ellison L., Pickard D.J., Martin M.J. et al. Emergence and global spread of epidemic healthcare-associated Clostridium difficile. Nat. Genet. 2012; 45 (1): 109 - 113.
29. Rasko D.A., Webster D.R., Sahl J.W., Bashir A., Boisen N., Scheutz F. et al. Origins of the E. coli strain causing an outbreak of hemolytic - uremic syndrome in Germany. N. Engl. J. Med. 2011; 365: 709 - 717.
30. Goering R.V., Kock R., Grundmann H., Werner G., Friedrich A.W. on behalf of the ESCMID Study Group for Epidemiological Markers (ESGEM). From theory to practice: molecular strain typing for the clinical and public health setting. Euro Surveill. 2013; 18 (4): 20383.
31. Olsvik O., Wahlberg J., Petrerson B., Uhlen M., Popovic T., Wachsmuth I.K, Fields P.I. Use of automated sequencing of polymerase chain reaction-generated amplicons to identify three types of cholera toxin subunit B in Vibrio cholerae 01 strains. J. Clin. Microbiol. 1993; 31 (1): 22 - 25.
32. Safa A., Nair G.B., Kong R.Y.C. Evolution of new variants of Vibrio cholerae 01. Trends in Microbiol. 2010; 18 (1): 46 - 54.
33. Robins W.P., Mekalanos J.J. Genomic science in understanding cholera outbreaks and evolution of Vibrio cholerae as a human pathogen. Current Topics in Microbiology and Immunology. 2014; DOI: 10.1007/82_366.
34. Mukhopadhyay A.K., Takeda Y., Nair G.B. Cholera utbreaks in the El Tor biotype era and the impact of the new El Tor variants. Current Topics in Microbiology and Immunology. 2014: DOI: 10.1007/82_363.
35. Миронова Л.В., Балахонов С.В., Урбанович Л.Я., Половинкина B.C., Кожевникова A.C., Куликалова Е.С., Афанасьев М.В. Обнаружение «гибридных» штаммов Vibrio choleraе eltor при эпидемических осложнениях в Сибири и на Дальнем Востоке. Журн. микробиол. 2011; 5: 12 - 18.
36. Миронова Л.В., Балахонов С.В., Урбанович Л.Я., Кожевникова A.C., Куликалова Е.С., Половинкина B.C., Афанасьев М.В Молекулярно-генетический анализ эпидемически опасных штаммов Vibrio cholerae eltor, изолированных в ^бирском и Дальневосточном округах России. Молекул. генетика. 2012; 2: 13 - 20.
37. Cмирнова Н.И., Заднова C.n., Шашкова A.B., Кутырев В.В. Вариабельность генома измененных вариантов Vibrio cholerae биовара Эль-Тор, изолированных на территории России в современный период Молекул. генетика. 2011; 3: 11 - 18.
38. Cавельев В.Н., Cавельева И.В., Бабенышев Б.В., Куличенко А.Н. Эволюция возбудителя и клинико-эпидемиологические особенности современной холеры Эль-Тор. Эпидемиол. и инфекц. бол. 2012; 5: 31 - 35.
39. Chin C.S., Sorenson J., Harris J.B., Robins W.P, Charles R.C., Jean-Charles R.R. et al. The origin of the haitian cholera outbreak strain. N. Engl. J. Med. 2011; 364: 33 - 42.
40. Kumar P, Jain M, Goel A.K., Bhadauria S., Sharma S. K., Kamboj D. V. et al. A large cholera outbreak due to a new cholera toxin variant of the Vibrio cholerae O1 El Tor biotype in Orissa, Eastern India. J. Med. Microbiol. 2009; 58: 234 - 238.
41. Kumar P., Mishra D.K., Deshmukh D.G., Jain M., Zade A.M., Ingole K.V. et al. Vibrio cholerae O1 Ogawa El Tor strains with the ctxB7 allele driving cholera outbreaks in south-western India in 2012. Infect. Genet. Evol. 2014; 16: pii: 1567 - 1348.
42. Reimer A.R., Domselaar G.V., Stroika S. Comparative Genomics of Vibrio cholerae from Haiti, Asia, and Africa. Emerg. Inf. Dis. 2011; 17 (11): 2113 - 2120.
43. Talkington D., Bopp C., Tarr C., Parsons M.B., Dahourou G., Freeman M. et al. Characterization of toxigenic Vibrio cholerae from Haiti, 2010 - 2011. Emerg. Inf. Dis. 2011; 17 (11): 2122 - 2129.
44. Kim E.J., Lee D., Moon S.H., Lee C.H., Kim D.W. CTX Prophages in Vibrio cholerae O1 Strains J. Microbiol. Biotechnol. 2014; 24 (6): 725 - 731.
45. Hasan N. A., Choi S.Y., Eppinger M., Clark P.W., Chen A., Alam M. et al. Genomic diversity of 2010 Haitian cholera outbreak strains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012; 109 (29): E 2010 - 2017.
46. Kitaoka M., Miyata S.T., Unterweger D., Pukatzki S. Antibiotic resistance mechanisms of Vibrio cholerae. J. Med. Microbiol. 2011; 60: 397 - 407.
47. Sjоlund-Karlsson M., Reimer A., Folster J.P, Walker M., Dahourou G.A., Batra D.G. et al. Drug-resistance mechanisms in Vibrio cholerae O1 outbreak strain, Haiti. Emerg. Inf. Dis. 2011; 17 (11): 2151 - 2154.
48. Feng L., Reeves PR., Lan R., Ren Y., Gao C., Zhou Z. et al. Recalibrated molecular clock and origins for the cholera pandemic clones. J. PLoS One. 2008; 3 (12): e4053.
49. Lam C., Octavia S., Reeves P, Wang L., Lan R. Evolution of seventh cholera pandemic and origin of 1991 epidemic Latin America. Emerg. Inf. Dis. 2010; 16 (7): 1130 - 1137.
50. Mutreja A., Kim D.W., Thomson N.R., Connor T.R., Lee J.H., Kariuki S. et al. Evidence for several waves of global transmission in the seventh cholera pandemic nature. 2011; 477: 462 - 466.
51. Sealfon R., Gire S., Ellis C., Calderwood S., Qadri F., Hensley L. et al. High depth, whole-genome sequencing of cholera isolates from Haiti and the Dominican Republic. BMC Genomics. 2012; 13: 468.
52. Reimer A. R., Domselaar G.V., Stroika S., Walker M., Kent H., Tarr C. et al. Comparative Genomics of Vibrio cholerae from Haiti, Asia, and Africa. Emerg. Inf. Diss. 2011; 17 (11): 2113 - 2121.
53. Hendriksen R.S., Price L.B., Schupp J.M., Gillece J.D., Kaas R.S., Engelthaler D.M. et al. Population genetics of Vibrio cholerae from Nepal in 2010: evidence on the origin of the haitian outbreak. mBio. 2011; 2 (4): e00157.
54. Pun S.B. South Asia instead of Nepal may be the origin of the Haitian cholera outbreak strains. mBio. 2011; 2 (5): e00219.
55. Katz L.S., Petkau A., Beaulaurier J., Tyler S., Antonova E.S., Turnsek M.A. et al. Evolutionary dynamics of Vibrio cholerae O1 following a single-source introduction to Haiti. mBio. 2013; 4 (4): e00398.
56. Grad Y.H., Waldor M.K. Deciphering the origins and tracking the evolution of cholera epidemics with whole-genome-based molecular epidemiology. mBio. 2013; 4 (5): e00670.
57. Frerichs R.R., Keim PS., Barrais R., Piarroux R. Nepalese origin of cholera epidemic in Haiti. Clin. Microbiol. Infect. 2012; 18 (6): е158 - 163.
58. Shah M.A., Mutreja A., Thomson N., Baker S., Parkhill J., Dougan G. et al. Genomic epidemiology of Vibrio cholerae O1 associated with floods, Pakistan, 2010. Emerg. Inf. Dis. 2014; 20 (1): 13 - 20.
59. Кулешов К.В., Маркелов К.М., Дедков В.Г., Водопьянов C.O., Водопьянов A.C., Керманов A.B. и др. Филогенетический анализ геномов Vibrio cholerae, выделенных на территории Ростовской области. Журн. микробиол. 2013; 6: 13 - 20.
60. Yi Y., Lu N., Liu F., Li J., Zhang R., Jia L. et al. Genome sequence and comparative analysis of a Vibrio cholerae O139 strain E306 isolated from a cholera case in China. Gut Pathogens. 2014; 6: 3.
References
1. Darmon E., Leach D.R.F. Bacterial genome instability. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2014; 78 (1): 1 - 39.
2. Rocha E.PC. The organization of the bacterial genome. Annu. Rev. Genet. 2008; 42: 211 - 233.
3. Brilli M., Ыт P, Lacroix V., Sagot M.F. Short and long-term genome stability analysis of prokaryotic genomes. BMC Genomics. 2013; 14: 309.
4. Lukashov V.V. Molecular evolution and phylogenetic analysis. М.: BINOM. Laboratoriya znaniy; 2009.
5. Zhimulev I.F. General and molecular genetics: Textbook for university students. Second edition. Novosibirsk: Siberian University; 2003.
6. Brookes A.J. The essence of SNPs. Gene. 1999; 234: 177 - 186.
7. Collins F.S., Brooks L.D., Chakravarti A. A DNA polymorphism discovery resource for research on human genetic variation. Genome Res. 1998; 8: 1229 -1231.
8. Shastry B.S. SNPs: impact on gene function and phenotype. Meth. Mol. Biol. 2009; 578: 3 - 22.
9. Van Belkum A., Tassios P.T., Dijkshoorn L., Haeggman S., Cookson B., Fry N.K. et al. Guidelines for the validation and amplication of typing methods for use in bacterial epidemiology. J. Clin. Microbiol. and Infect. Dis. 2007; 13: 1 - 46.
10. Bertelli C., Greub G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clin Microbiol. Infect. 2013; 19 (9): 803 - 813.
11. Snitkin E.S., Zelazny A.M., Thomas P. J., Stock F., Tracking a hospital outbreak of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae with whole-genome sequencing. (NISC comparative sequencing program, Henderson D.K., Palmore T.N., Segre J.A. Sci. Transl. Med. 2012; 4: 148ra116.
12. Crow J.F. Spontaneous mutation as a risk factor. Exp. Clin. Immunogen. 1995; 12: 121 - 128.
13. Foley S.L., Lynne A.M., Nayak R. Molecular typing methodologies for microbial source tracking and epidemiological investigations of gram-negative bacterial foodborne pathogens. Infection, Genetics and Evolution. 2009; 9: 430 - 440.
14. Parkhill J., Wren B.W. Bacterial epidemiology and biology - lessons from genome sequencing. Gen. Biol. 2011; 12: 230.
15. Komar A.A. Single nucleotide polymorphisms methods and protocols. Second Edition. Humana Press; 2009.
16. Hrabаk J., Chudаckovа E., Walkov R. Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization - Time of Flight (MALDI-^F) mass spectrometry for detection of antibiotic resistance mechanisms: from research to routine diagnosis. Clin. Microbiol. Rev. 2013; 26 (1):103.
17. Lechner D., Lathrop G.M., Gut I.G. Large-scale genotyping by mass spectrometry: experience, advances and obstacles. Cur. Opin. Chem. Biol. 2002; 6: 31 - 38.
18. Zhang W., Qi W., Albert T.J., Motiwala A.S., Alland D., Hyytia-Trees E.K. et al. Probing genomic diversity and evolution of Escherichia coli O157 by single nucleotide polymorphisms. Genome Res. 2006; 16: 757 - 767.
19. Tyagi S., Bratu D.P, Kramer F.R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat. Biotechnol. 1998; 16: 49 - 53.
20. Didelot X., Bowden R., Wilson D.J., Peto T.E.A., Crook D.W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat. Rev. Gen. 2012;13 (9): 601 - 612.
21. Sabat AJ, Budimir A, Nashev D, Sa-Lero R, van Dijl JM, Laurent F. et al. Overview of molecular typing methods for outbreak detection and epidemiological surveillance. Euro Surveill. 2013; 18 (4): 20380.
22. Struelens M.J., Brisse S. From molecular to genomic epidemiology: transforming surveillance and control of infectious diseases. Euro Surveill. 2013; 18 (4): 20386.
23. Sibley C.D., Peirano G., Church D.L. Molecular methods for pathogen and microbial community detection and characterization: current and potential application in diagnostic microbiology. Infection, Genetics and Evolution. 2012; 12: 505 - 521.
24. Chun J., Rainey F.A. Integrating genomics into the taxonomy and systematics of the Bacteria and Archaea International Journal of Systematic and Evolutionary. Microbiology. 2014; 64: 316 - 324.
25. Achtman M. Insights from genomic comparisons of genetically monomorphic bacterial pathogens Phil. Trans. R. Soc. B. 2012; 367: 860 - 867.
26. Walker M.J., Beatson S.A. Outsmarting outbreaks. Science. 2012; 338: 1161 - 1162.
27. Harris S.R., Feil E.J., Holden M.T.G., Quail M.A., Nickerson E.K., Chantratita N. et al. Evolution of MRSA during hospital transmission and intercontinental spread. Science. 2010; 327: 469 - 474.
28. He M., Miyajima F., Roberts P., Ellison L., Pickard D.J., Martin M.J. et al. Emergence and global spread of epidemic healthcare-associated Clostridium difficile. Nat. Genet. 2012; 45 (1): 109 - 113.
29. Rasko D.A., Webster D.R., Sahl J.W., Bashir A., Boisen N., Scheutz F. et al. Origins of the E. coli Strain causing an outbreak of hemolytic - uremic syndrome in Germany. N. Engl. J. Med. 2011; 365: 709 - 717.
30. Goering R.V., Kock R., Grundmann H., Werner G., Friedrich A.W. on behalf of the ESCMID Study Group for Epidemiological Markers (ESGEM). From theory to practice: molecular strain typing for the clinical and public health setting. Euro Surveill. 2013; 18 (4): 20383.
31. Olsvik O., Wahlberg J., Petrerson B., Uhlen M., Popovic T., Wachsmuth I.K, Fields PI. Use of automated sequencing of polymerase chain reaction-generated amplicons to identify three types of cholera toxin subunit B in Vibrio cholerae O1 strains. J. Clin. Microbiol. 1993; 31 (1): 22 - 25.
32. Safa A., Nair G.B., Kong R.Y.C. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends in Microbiol. 2010; 18 (1): 46 - 54.
33. Robins W.P., Mekalanos J.J. Genomic science in understanding cholera outbreaks and evolution of Vibrio cholerae as a human pathogen. Current Topics in Microbiology and Immunology. 2014. DOI: 10.1007/82_366.
34. Mukhopadhyay A.K., Takeda Y., Nair G.B. Cholera Outbreaks in the El Tor Biotype Era and the Impact of the New El Tor Variants. Current Topics in Microbiology and Immunology. 2014. Doi: 10.1007/82_363.
35. Mironova L.V., Balakhonov S.V., Urbanovich L.Ya., Polovinkina V.S., Kozhevnikova A.S., Kulikalova E.S., Afanasyev M.V. Detection of «hybrid» Vibrio cholerae eltor strains during epidemic complications in Syberia and Far East. Zh. Mikrobiol. 2011; 5: 12 - 18 (in Russian).
36. Mironova L.V., Balakhonov S.V., Urbanovich L.Y., Polovinkina V.S., Kozhevnikova A.S., Kulikalova E.S., Afanas'ev M.V. Molecular genetic analysis of epidemic dangerous imported Vibrio cholerae El Tor strains isolated in Siberian and Far Eastern federal districts of Russia. Molecul. Genet. 2012; 2: 13 - 20 (in Russian).
37. Smirnova N.I., Zadnova S.P., Shashkova A.V., Kutyrev V.V. Genome variability in the altered variants of vibrio cholerae biovar El tor isolated in Russia. Mol. Gen. 2011; 3: 11 - 18 (in Russian).
38. Savelyev V. N., Savelyeva I.V., Babenyshev B.V., Kulichenko A.N. The evolution of the pathogen and the clinical and epidemiological features of the recent cholera (el tor). Epidemiol. Infec. disease. 2012; 5: 31 - 35 (in Russian).
39. Chin C.S., Sorenson J., Harris J.B., Robins W.P, Charles R.C., Jean-Charles R.R. et al. The origin of the haitian cholera outbreak strain. N. Engl. J. Med. 2011; 364: 33 - 42.
40. Kumar P., Jain M, Goel A.K., Bhadauria S., Sharma S. K., Kamboj D. V. et al. A large cholera outbreak due to a new cholera toxin variant of the Vibrio cholerae O1 El Tor biotype in Orissa, Eastern India. J. Med. Microbiol. 2009; 58: 234 - 238.
41. Kumar P., Mishra D.K., Deshmukh D.G., Jain M., Zade A.M., Ingole K.V. et al. Vibrio cholerae O1 Ogawa El. Tor strains with the ctxB7 allele driving cholera outbreaks in south-western India in 2012. Infect. Genet. Evol. 2014; 16: pii: 1567 - 1348.
42. Reimer A.R., Domselaar G.V., Stroika S. Comparative Genomics of Vibrio cholerae from Haiti, Asia, and Africa. Emerg. Inf. Dis. 2011; 17 (11): 2113 - 2120.
43. Talkington D., Bopp C., Tarr C., Parsons M.B., Dahourou G., Freeman M. et al. Characterization of teoxigenic Vibrio cholerae from Haiti, 2010 - 2011. Emerg. Inf. Dis. 2011; 17 (11): 2122 - 2129.
44. Kim E.J., Lee D., Moon S.H., Lee C.H., Kim D.W. CTX Prophages in Vibrio cholerae O1 Strains J. Microbiol. Biotechnol. 2014; 24 (6): 725 - 731.
45. Hasan N.A., Choi S.Y., Eppinger M., Clark P.W., Chen A., Alam M. et al. Genomic diversity of 2010 Haitian cholera outbreak strains. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012; 109(29): E 2010 - 2017.
46. Kitaoka M., Miyata S.T., Unterweger D., Pukatzki S. Antibiotic resistance mechanisms of Vibrio cholerae. J. Med. Microbiol. 2011; 60: 397 - 407.
47. Sjolund-Karlsson M., Reimer A., Folster J.P, Walker M., Dahourou G.A., Batra D.G. et al. Drug-Resistance Mechanisms in Vibrio cholerae O1 Outbreak Strain, Haiti. Emerg. Inf. Dis. 2011; 17 (11): 2151 - 2154.
48. Feng L., Reeves P.R., Lan R., Ren Y., Gao C., Zhou Z. et al. Recalibrated Molecular Clock and Origins for the Cholera Pandemic Clones. J. PLoS One. 2008; 3 (12): e4053.
49. Lam C., Octavia S., Reeves P., Wang L., Lan R. Evolution of Seventh Cholera Pandemic and Origin of 1991 Epidemic Latin America. Emerg. Inf. Dis. 2010; 16 (7): 1130 - 1137.
50. Mutreja A., Kim D.W., Thomson N.R., Connor T.R., Lee J.H., Kariuki S. et al. Evidence for several waves of global transmission in the seventh cholera pandemic nature. 2011; 477: 462 - 466.
51. Sealfon R., Gire S., Ellis C., Calderwood S., Qadri F., Hensley L. et al. High depth, whole-genome sequencing of cholera isolates from Haiti and the Dominican Republic. BMC Genomics. 2012; 13: 468.
52. Reimer A.R., Domselaar G.V., Stroika S., Walker M., Kent H., Tarr C. et al. Comparative Genomics of Vibrio cholerae from Haiti, Asia, and Africa. Emerg. Inf. Dis. 2011; 17 (11): 2113 - 2121.
53. Hendriksen R.S., Price L.B., Schupp J.M., Gillece J.D., Kaas R.S., Engelthaler D.M. et al. Population genetics of Vibrio cholerae from Nepal in 2010: evidence on the origin of the Haitian outbreak. mBio. 2011; 2 (4): e00157.
54. Pun S.B. South Asia Instead of Nepal May Be the Origin of the Haitian Cholera Outbreak Strains. mBio. 2011; 2 (5): e00219.
55. Katz L.S., Petkau A., Beaulaurier J., Tyler S., Antonova E.S., Turnsek M.A. et al. Evolutionary Dynamics of Vibrio cholerae O1 following a Single-Source Introduction to Haiti. mBio. 2013; 4( 4): e00398
56. Grad Y.H., Waldor M.K. Deciphering the origins and tracking the evolution of cholera epidemics with whole-genome-based molecular epidemiology. Bio. 2013; 4 (5): e00670.
57. Frerichs R.R., Keim P.S., Barrais R., Piarroux R. Nepalese origin of cholera epidemic in Haiti. Clin. Microbiol. Infect. 2012; 18 (6): e158 - 163.
58. Shah M.A., Mutreja A., Thomson N., Baker S., Parkhill J., Dougan G. et al. Genomic Epidemiology of Vibrio cholerae O1 Associated with Floods, Pakistan, 2010. Emerg. Inf. Dis. 2014; 20 (1): 13 - 20.
59. Kuleshov K.V., Markelov M.L., Dedkov V.G., Vodopianov S.O., Vodopianov A.S., Kermanov A.V. et al. Phylogenetic analysis of genomes of Vibrio cholerae strains isolated on the territory of Rostov region. Zh. Mikrobiol. 2013; 6: 13 - 20 (in Russian).
60. Yi Y., Lu N., Liu F., Li J., Zhang R., Jia L. et al. Genome sequence and comparative analysis of a Vibrio cholerae O139 strain E306 isolated from a cholera case in China. Gut Pathogens. 2014; 6: 3.
