CC BY
5
DOI 10.31718/2077-1096.20.2.119
УДК 616.6-006:577.213/.216
Волкогон А.Д., Гарбузова В.Ю., Атаман О.В.
ПОЛ1МОРФНИЙ САЙТ RS3200401 ГЕНУ MALAT1 НЕ АСОЦ1ЙОВАНИЙ 13 В1КОМ ВИНИКНЕННЯ РАКУ НИРКИ
Сумський державний ушверситет
На сьогодн довга некодуюча РНК MALAT1 вважаеться одн/ею ¡з основних РНК, причетних до виник-нення та метастазування злояюсних пухлин р/зноУ локал'/заци. Результати нещодавн/х експериме-нт/в показали, що MALAT1 в/д/грае важливу роль у настанн/ та прогресп i раку нирки. При цьому бу-ло виявлено, що виживан/сть онкохворих залежить в/д рiвня експрес/У гена ц/еУ РНК. Метою дослi-дження стало вивчення можливого зв'язку rs3200401-полiморфiзму гена MALAT11з в/ком виникнення раку нирки в украУнських пацiентiв. Матерiали i методи досл/дження. Дослiдження проведено iз ви-користанням венозноУ кровi 101 хворого зi св/тлокл/тинним нирково-клiтинним раком (42 жнки та 59 чоловкв). Визначення rs3200401 пол'\морф'\зму гена MALAT1 здйснювали за допомогою методу пол/меразноУ ланцюговоУ реакцИ в реальному часi з використанням компонент'¡в TaqManSNP Assay C_3246069_10. Статистичний анал'з даних проводили за допомогою програми SPSS (верс/я 17.0). Методики Каплана-Мейера та Кокс-регреш були застосован/ для перевiрки можливоУ асо^ацУУ м/ж rs3200401-генотипами та в/ком виникнення раку нирки. Значення Р < 0,05 вважали статистично достов/рними. Результати. Результати генотипування за полiморфним сайтом rs3200401 гена MALAT1 показали, що серед пацiентiв iз нирково-клiтинним раком 71 (70,3 %) особа мала генотип СС, 29 (28,7 %) - генотип СТ, 1 (1 %) - генотип ТТ. Аналiз виживаност/ методом Каплана-Мейера показав, що тривал/сть життя до моменту виникнення пухлини не пов'язана iз rs3200401-локусом (log rank Р = 0,449 - для кодом/нантноУ модел/; log rank Р = 0,847 - для домнантноУ моделi). Результати анал/зу за допомогою регресУ Кокса також показали, що ризик розвитку нирково-клтинноУ карциноми з в/ком не залежить в/д rs3200401-сайту гена MALAT1 (Р > 0,05). Статистично досто-в/рн/ результати не були виявлен/ i п/сля врахування статi, ¡ндексу маси тла пацiентiв, наявност/ в них метастазв, звички палити та вживати алкоголь (Р > 0,05). Висновки. В украУнсьюй популяцИпо-л/морф/зм rs3200401 гена довгоУнекодуючоУРНК MALAT1 не пов'язаний iз в/ком настання раку нирки.
Ключов1 слова: довга некодуюча РНК, MALAT1, пол1морф1зм ген1в, рак нирки.
Досл/дження е фрагментом НДР «Роль алельного пол/морф/зму ген/в у розвитку патолог/чних процеав i хвороб» (№ держа-вноУреестраци - 0110U005038).
Вступ
На сьогодш вщомо, що основна частка транс-крип^в, що утворюються в ядрi кл^ин людини, представлена некодуючими рНк, як регулюють експресш бтьше 70 % гешв людини [1]. Залеж-но вщ довжини некодуючi молекули РНК роздн ляють на коротк (менше шж 200 нуклеотидiв) та довп (бтьше шж 200 нуклеотидiв). У той час, як вже описано вплив коротких версш цих молекул, особливо мiкроРНК, на розвиток рiзноманiтних пухлин шляхом пригшчення експреси мРНК, вплив довгих некодуючих РНК е менш дослщже-ним [2].
Особливу увагу вчених багатьох лабораторш сьогодш привертае довга некодуюча РНК (днРНК) MALAT1 (metastasis associated lung adenocarcinoma transcript), також вщома як NEAT2 (noncoding nuclear-enriched abundant transcript 2) [3]. Результати низки дослщжень показали зв'язок змши експреси MALAT1 iз виник-ненням та розвитком рiзних видiв злоякюних пухлин, включаючи рак молочноТ залози, рак ший-ки матки, колоректальний рак, рак печшки, ней-робластому, остеосаркому, рак пщшлунковоТ залози, рак сечового мiхура, рак шлунку та рак ле-гешв [4, 5].
Разом iз цим одним iз напрямiв сучасноТ мо-лекулярноТ бюлоги е дослщження ролi IncRNA
MALAT1 у патогенезi злоякюних новоутворень нирки. Результати експериментальних роб^ Zhang et al. [6] та Hirata et al. [7] показали, що в кл^инах нирково-кл^инного раку (НКР) спостерн гаеться надмiрне утворення молекули MALAT1. Групою Ye et al. встановлено, що MALAT1 спри-яе пухпиннш прогресп НКР шляхом пригшчення активност miR-194-5p [8]. А результати роботи Kulkarni et al. продемонстрували, що актива^я miR-182-5p призводить до зупинки росту пухлин НКР шляхом пригшчення експреси MALAT1 [9]. Також цкаво вщм^ити, що хворi iз НКР iз висо-ким рiвнем експреси MALAT1 в бюптатах пухлин мають значно менший показник загальноТ вижи-ваносп, шж па^енти iз низьким рiвнем утворення транскрип^в MALAT1 [6, 7].
Таким чином, враховуючи вагому роль днРНК MALAT1 у виникненш та прогресп раку нирки, а також залежнють часу життя хворих iз НКР вщ рiвня експреси MALAT1, цкавим буде дослщити можливий зв'язок генетичного полiморфiзму MALAT1 iз виживанютю па^ен^в iз злоякюними новоутворенням нирок.
Мета дослщження
Вивчення можливоТ асо^аци rs3200401- по-лiморфiзму гену lncRNA MALAT1 iз вiком настання раку нирки в украТнських па^етчв.
В1СНИК Украгнська медична стоматологгчна академхя
Матерiали i методи дослщження.
Дослiдження проведено i3 використанням венозной KpoBi 101 хворого 3i свiтлоклiтинним нир-ково-клiтинним раком (СКНКР) (42 жiнки та 59 чоловiкiв). Пацieнти спостер^ались на 6a3i Сум-ського обласного ключного онкологiчного диспансеру з 2005 по 2016 рк. Кшцевий дiагноз СКНКР встановлювався вiдповiдно до рекомен-дацiй СвропейськоТ асо^аци уролопв (European Association of Urology Guidelines). Ус хворi мали II кл^чну стадiю раку вiдповiдно до TNM-класифкаци злоякiсних пухлин.
Дослiдження проводили з дотриманням ос-новних положень Конвенцп Ради бвропи про права людини та бiомедицину, ГельсшськоУ де-кларацп Всесв^ньоУ медичноТ' асо^ацп про етш-чнi принципи проведення наукових медичних дослщжень за участю людини (1964, з подаль-шими доповненнями, включаючи версiю 2000) та Наказу МОЗ Украши №690 вiд 23.09.2009 р. Ус учасники пiдписали шформовану згоду на участь у дослщженнях з наступним забором венозноУ кровi на генетичний аналiз.
Визначення rs3200401 полiморфiзму гена MALAT1 здiйснювали за допомогою методу по-лiмеразноl ланцюговоУ реакцп в реальному часi (Real-Time PCR) з використанням компонент TaqManSNP Assay C_3246069_10. Режим для проведення амплiфiкацil: первинна денатурацiя 20 с при 95°C, денатурацiя 30 с при 95°C та вщ-пал з елонга^ею - 30 с при 60°C (всього 50 цик-лiв). Амплiфiкацiя та аналiз отриманих резуль-татiв проводилися детекторним модулем 7500 Fast Real-time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, USA) з використанням 7500 Fast Real-time PCR Software.
Математичне опрацювання даних проводили за допомогою програми SPSS (верая 17.0). Без-перервн данi наведенi у виглядi середнього значення ± SD. Перевiрку вiдповiдностi розподн лу алелiв за rs3200401-локусом рiвновазi Хардн Вайнберга проводили за допомогою х2-критерш ^рсона. Методики Каплана-Мейера та Кокс-
регреая були 3acTOCOBaHi для nepeBipKM можли-воТ асо^аци мiж rs3200401-генотипами та вком виникнення СКНКР. Регресiя Кокса була викона-на як без, так i3 поправкою на стать, шдекс маси тiла, наявнiсть метаст^в, звичку палити та вживати алкоголь. Значення Р < 0,05 вважали статистично значущими.
Результати дослщження та 1х обговорення
Результати генотипування за полiморфним сайтом rs3200401 гена MALAT1 показали, що серед па^ешчв iз СКНКР 71 (70,3 %) особа мае генотип СС, 29 (28,7 %) - генотип СТ, 1 (1 %) -генотип ТТ. Частота основного (С) та рецесивно-го (Т) алелiв становила 0,85 та 0,15 вщповщно, а Тх розподiл не вiдхилявся вiд рiвноваги Хардн Вайнберга (Р > 0,05).
У таблиця 1 наведет показники середнього вку настання СКНКР в оаб iз рiзним генотипом за ге3200401-локусом гена MALAT1 (у рамках кодомшантноТ та домшантноТ моделей успадку-вання). На рисунку 1 представлена крива функ-цiТ ризику, що в рамках домшантноТ моделi ус-падкування iлюструе залежнiсть мiж ймовiрнiстю настання СКНКР та вiком па^ен^в iз рiзними генотипами за полiморфiзмом rs3200401 гена MALAT1. Аналiз виживаностi методом Каплана-Мейера показав, що тривалють життя до моменту розвитку СКНКР не асоцшована iз полiморф-ним сайтом rs3200401 (log rank Р = 0,449 - для кодомшантноТ модел^ log rank Р = 0,847 - для домшантноТ модел^.
Результати аналiзу ризику виникнення СКНКР залежно вщ конкретного генотипу за rs3200401-полiморфiзмом методом регресп Кокса показанi в таблиц 2. У рамках одноварiантно-го аналiзу встановлено, що ризик розвитку СКНКР з вком не залежав вщ дослiджуваного локусу гена MALAT (Р > 0,05). Статистично зна-чущi результати також не були виявлен i пiсля поправки на стать, шдекс маси тта, наявнють метастазiв, звички палити та вживати алкоголь (Р > 0,05).
Таблиця 1
Анал'з зв'язку вку настання СКНКР i3 rs3200401-полiморфiзмом гену MALAT1
Генотип n Середнш вк SE 95 % CI log rank P Breslow P
Кодомшантна модель
СС 71 56,3 1,3 53,8-58,7
CT 29 55,9 1,8 52,4-59,4 0,449 0,439
TT 1 74,0 0,0 74,0-74,0
Домшантна модель
СС 71 56,3 1,3 53,8-58,7 0,847 0,685
СТ+ТТ 30 56,5 1,8 52,9-60,1
npuMimKa: СКНКР - свiтлоклiтинний нирково-клiтинний рак;
SE - стандартна похибка; 95 % CI - 95 % doeip4uü нтервал; n - шькють пацieнmiв
Рис 1. Функ^я ризику виникнення СКНКР залежно eid вку в oci6 i3 рiзними генотипами за полiморфним сайтом rs3200401 гену MALAT1.
Таблиця 2
Анал'з зв'язку м'жrs320040-полiморфiзмом гена MALAT1 та ризиком виникнення СКНКР з вком
Модель Одноварiантний аналiз Мультиварiабельний аналiз
HR 95 % CI P HR 95 % CI P
TT+CT vs CC 1,04 2 0,677-1,603 0,85 3 1,02 3 0,656-1,595 0,92 2
CT vs TT+CC 1,14 4 0,738-1,772 0,54 7 1,08 0 0,684-1,707 0,74 0
TT vs CT+CC 0,34 6 0,048-2,505 0,29 3 0,46 7 0,061-3,595 0,46 4
Прим1тка: СКНКР - св1тлокл1тинний нирково-кл1тинний рак; HR
Узагальнення результат експерименталь-них роб^ останых рош показало, що днРНК вн дiграють одну iз головних ролей у рiзноманiтниx внутршньокттинних процесах, а рiвень Тх про-дукцiТ специфiчно асоцiйований iз виникненням злоякiсниx пухлин [10], включаючи i рак нирок [11]. Серед багатьох некодуючих РНК, причет-них до патогенезу злоякюних пухлин нирок, осо-бливу увагу сьогодн привертае днРНК MALAT1.
Поряд iз вивченням ролi MALAT1 у розвитку раку нирок на сьогодн також виконан декiлька дослщжень зв'язку ^еТ днРНК iз виживанютю па-iентiв. Так, у робот Zhang et al. [6] показано, що високий показник експресп MALAT1 у хворих СКНКР був пов'язаний iз бiльшою кiлькiстю ускладнень та меншим показником виживаностi. Поряд iз цим, Hirata et al. [7] також виявили нега-тивну кореляцш мiж кiлькiстю утворених транс-
- ризик небезпеки; 95 % CI - 95 % довiрчий iнтервал.
криппв MALAT1 та ймовiрнiстю вижити у па^ен-TiB i3 СКНКР.
У нашiй po6oTi був проведений аналiз мож-ливого зв'язку мiж генетичним полiморфiзмом MALAT1 та вком настання СКНКР. Ген днРНК MALAT1 розташовуеться на довгому плечi 11-Ï хромосоми (11q13.1), складаеться i3 8708 пар основ та мютить 2 екзони [12]. Станом на бере-зень 2020 року вщомо 5730 полiморфних сайтiв гена MALAT1
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/?term=MALAT1). Одним i3 найбтьш клiнiчно значущих у контекстi зв'язку iз розвитком злоякiсних пухлин е полн морфний сайт rs3200401, що i був обраний нами для дослщження.
Результати, отриман пщ час нашого дослн дження, показали, що rs3200401-полiморфiзм не пов'язаний iз вком виникнення СКНКР в укра'ш-ських па^етчв. Такi результати були виявлен в
В1СНИК Украхнська медична стоматологгчна академхя
10. 11.
12.
13.
regulating proliferation and maintaining undifferentiated status of early-stage hematopoietic cells. BMC Genomics. 2015;16(1):676. doi: 10.1186/s12864-015-1881-x.
Li ZX, Zhu QN, Zhang HB, Hu Y, Wang G, Zhu YS. MALAT1: a potential biomarker in cancer. Cancer Manag Res. 2018;10:6757-6768. doi: 10.2147/CMAR.S169406.
Zhao M, Wang S, Li Q, Ji Q, Guo P, Liu X. MALAT1: A long non-coding RNA highly associated with human cancers. Oncol Lett. 2018;16(1):19-26. doi: 10.3892/ol.2018.8613. Zhang HM, Yang FQ, Chen SJ, Che J, Zheng JH. Upregulation of long non-coding RNA MALAT1 correlates with tumor progression and poor prognosis in clear cell renal cell carcinoma. Tumour Biol. 2015;36(4):2947-2955. doi: 10.1007/s13277-014-2925-6. Hirata H, Hinoda Y, Shahryari V, Deng G, Nakajima K, Tabatabai ZL et al. Long Noncoding RNA MALAT1 Promotes Aggressive Renal Cell Carcinoma through Ezh2 and Interacts with miR-205. Cancer Res. 2015;75(7):1322-31. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-14-2931.
Ye Y, Zhang F, Chen Q, Huang Z, Li M. LncRNA MALAT1 modified progression of clear cell kidney carcinoma (KIRC) by regulation of miR-194-5p/ACVR2B signaling. Mol Carcinog. 2019;58(2):279-292. doi: 10.1002/mc.22926. Kulkarni P, Dasgupta P, Bhat NS, Shahryari V, Shiina M, Hashimoto Y et al. Elevated miR-182-5p Associates with Renal Cancer Cell Mitotic Arrest through Diminished MALAT-1 Expression. Mol Cancer Res. 2018;16(11):1750-1760. doi: 10.1158/1541-7786.MCR-17-0762.
Kim MY. Long non-coding RNAs in cancer. Noncoding RNA Res. 2019;4(2):45. doi: 10.1016/j.ncrna.2019.02.003. Li M, Wang Y, Cheng L, Niu W, Zhao G, Raju JK et al. Long non-coding RNAs in renal cell carcinoma: A systematic review and clinical implications. Oncotarget. 2017; 8(29): 48424-48435. doi: 10.18632/oncotarget.17053.
Wu Y, Huang C, Meng X, Li J. Long Noncoding RNA MALAT1: Insights into its Biogenesis and Implications in Human Disease. Curr Pharm Des. 2015;21(34):5017-5028.
Wang JZ, Xiang JJ, Wu LG, Bai YS, Chen ZW, Yin XQ et al. A genetic variant in long non-coding RNA MALAT1 associated with survival outcome among patients with advanced lung adenocarcinoma: a survival cohort analysis. BMC Cancer. 2017;17(1):167. doi: 10.1186/s12885-017-3151-6.
умов як без, так i з урахуванням таких факторiв, як стать, куршня, наявнють MeTacTa3iB, шдекс маси тта та зловживання алкоголем. На сьогодш дослщження такого плану в шших популя^ях ще не виконувались. Проте, колективом Wang et al. [13] пщ час вивчення асо^аци' генетичного полiморфiзму MALAT1 i3 виживанютю китайсь-ких па^етчв i3 аденокарциномою легень було встановлено, що па^енти i3 СТ- та ТТ-генотипами за ге3200401-локусом мають значно бiльший показник часу виживаност та менший ризик смертностi, порiвняно iз хворими, що ма-ють генотип СС.
Висновки
В украшськш популяци' полiморфiзм rs3200401 гена довго'Г некодуючо'Г РНК MALAT1 не пов'язаний iз вiком настання раку нирки.
Перспективи подальших дослщжень поляга-ють у вивченнi можливого зв'язку полiморфних сайтiв генiв ANRIL i HOTAIR iз показниками ви-живаностi у хворих iз раком нирки.
Лтература
1. Fernandes JC, Acuña SM, Aoki JI, Floeter-Winter LM, Muxel SM. Long Non-Coding RNAs in the Regulation of Gene Expression: Physiology and Disease. Noncoding RNA. 2019;5(1).E17. doi: 10.3390/ncrna5010017.
2. Mattick JS. The State of Long Non-Coding RNA Biology. Noncoding RNA. 2018;4(3).E17. doi: 10.3390/ncrna4030017.
3. Ma XY, Wang JH, Wang JL, Ma CX, Wang XC, Liu FS. MALAT1 as an evolutionarily conserved lncRNA, plays a positive role in
Реферат
ПОЛИМОРФНЫЙ САЙТ rs3200401 ГЕНА MALAT1 НЕ АССОЦИИРОВАН С ВОЗРАСТОМ ВОЗНИКНОВЕНИЯ РАКА ПОЧКИ Волкогон А. Д., Гарбузова В. Ю., Атаман О. В.
Ключевые слова: длинная некодирующая РНК, MALAT1, полиморфизм генов, рак почки.
Сегодня длинная некодирующая РНК MALAT1 считается одной из основных РНК, причастных к возникновению и метастазированию злокачественных опухолей различной локализации. Результаты недавних экспериментов показали, что MALAT1 играет важную роль в наступлении и прогрессии также и рака почки. При этом было обнаружено, что выживаемость онкобольных зависит от уровня экспрессии гена этой РНК. Целью исследования стало изучение возможной связи rs3200401-полиморфизма гена MALAT1 с возрастом возникновения рака почки среди украинских пациентов. Материалы и методы исследования. Исследование проведено с использованием венозной крови 101 больного с светлоклеточным почечно-клеточным раком (42 женщины и 59 мужчин). Определение rs320040-полиморфизма гена MALAT1 осуществляли с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием компонентов TaqManSNP Assay C_3246069_10. Статистический анализ данных проводили с помощью программы SPSS (версия 17.0). Методики Каплана-Мейера и Кокс-регрессия были применены для проверки возможной ассоциации между rs3200401-генотипами и возрастом возникновения рака почки. Значение Р < 0,05 считали статистически значимыми. Результаты. Результаты генотипирования по полиморфному сайту rs3200401 гена MALAT1 показали, что среди пациентов с почечно-клеточным раком 71 (70,3%) человек имел генотип СС, 29 (28,7%) - генотип СТ, 1 (1%) - генотип ТТ. Анализ выживаемости методом Каплана-Мейера показал, что продолжительность жизни до момента возникновения опухоли не связана с ге3200401-локусом (log rank Р = 0,449 - для кодоминантной модели; log rank Р = 0,847 - для доминантной модели). Результаты анализа с помощью регрессии Кокса также показали, что риск развития почечно-клеточного рака с возрастом не зависит от ге3200401-сайта гена MALAT (Р > 0,05). Статистически достоверные результаты не были обнаружены и после учета пола, индекса массы тела пациентов, наличия у них метастазов, привычки курить и употреблять алкоголь (Р > 0,05). Выводы. В украинской популяции полиморфизм rs3200401 гена длинной некодирующей рНк MALAT1 не связан с возрастом наступления рака почки.
Summary
rs3200401 MALAT1 GENE POLYMORPHISM IS NOT RELATED TO AGE OF KIDNEY CANCER ONSET Volkohon AD, Harbuzova V. Yu., Ataman OV
Key words: long non-coding RNA, MALAT1, gene polymorphism, kidney cancer.
Today, the long non-coding RNA MALAT1 is considered to be one of the major RNAs involved in the emergence and metastasizing of various malignant tumours. Recent experiments have shown that MALAT1 plays an important role in the onset and progression of kidney cancer as well. It was found that cancer patient survival depends on the level of MALAT1 gene expression. The aim of the study was to investigate the possible association between rs3200401 MALAT1 gene polymorphism and age of kidney cancer onset among Ukrainian patients. Materials and methods. The venous blood of 101 patients with clear cell renal cell carcinoma (42 women and 59 men) was used for study. Determination of MALAT1 gene rs320040 polymorphism was performed by the Real-Time polymerase chain reaction method using TaqManSNP Assay C_3246069_10 components. Statistical analysis of the data obtained was performed using SPSS (version 17.0). To test the possible association between rs3200401 genotypes and the age of kidney cancer onset Kaplan-Meier and Cox regression techniques were used. P value < 0.05 was considered as statistically significant. Results. The obtained results of MALAT1 gene rs3200401 polymorphic site genotyping revealed that 71 (70.3%) patients with renal cell carcinoma had CC genotype, 29 (28.7%) - CT, 1 (1%) - TT genotype. Survival analysis by Kaplan-Meier method showed that life expectancy until the tumour occurrence was not related to rs3200401 locus (log rank P = 0.449 - for codominant model; log rank P = 0.847 - for dominant model). The results of Cox regression analysis also showed no link between MALAT gene rs3200401-site and risk of renal cell carcinoma development (P > 0.05). No statistically significant results were found after adjustment for sex, body mass index, metastasis, smoking and drinking habits (P > 0.05). Conclusions. The rs3200401 gene polymorphism of long non-coding RNA MALAT1 is not associated with the age of kidney cancer onset in Ukrainian population.
