CC BY
114
Вестник Челябинского государственного университета. 2013. № 7 (298).
Биология. Вып. 2. С. 21-23.
Е. П. Кузьминова, А. Л. Бурмистрова, Ю. Ю. Филиппова, Т. А. Суслова
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ TLR2 И TLR4 У ОЖОГОВЫХ БОЛЬНЫХ С СЕПСИСОМ
Описаны частоты встречаемости полиморфных вариантов генов TLR2 и TLR4 у ожоговых больных с таким осложнением, как сепсис. Определены маркеры предрасположенности к развитию сепсиса у пациентов с тяжёлой термической травмой.
Ключевые слова: ожоговый сепсис, полиморфизм генов, Toll -like receptors, аллели, генотипы, частота встречаемости.
Введение. Инфекционные осложнения ожоговой болезни, в частности развитие сепсиса, представляют собой серьёзную проблему, приводящую к высокой смертности пациентов ожоговых реанимаций.
Генетические факторы человека, с учётом современной концепции патогенеза инфекций, играют главную роль в исходе инфекционных заболеваний. Так, известно, что полиморфизм генов, контролирующих прикрепление, проникновение, репликацию и клиренс патогена, а также генов, инициирующих более поздние этапы иммунопатологии, влияет на течение и исход инфекционных заболеваний. К генам, контролирующим тип иммунного ответа, чувствительность / резистентность к инфекции, предрасположенность к разным формам течения инфекционных заболеваний и их осложнений, относятся, в первую очередь, гены рецепторов врождённого иммунитета и гены цитокинов [1; 2; 4].
При возникновении септических состояний первым основным задействованным звеном иммунной системы является врождённый иммунитет, где особое место занимают патоген-распо-знающие структуры, обеспечивающие проведение внутриклеточного активационного сигнала, к которым относятся Толл-подобные рецепторы (Toll-like receptors, TLR) [8; 9].
Общим свойством всех TLR является взаимодействие с PAMPs (Pathogen-associated molecular patterns) и проведение активационного сигнала, указывающего на присутствие патогена и ведущего к активации защитных реакций. Показано также, что некоторые TLR могут распознавать и эндогенные лиганды, появляющиеся в результате развития воспаления и повреждения тканей (домен А белка внеклеточного матрикса фибронек-тина, фибриноген, олигосахариды гиалуроновой кислоты, белок А сурфактанта эпителия лёгких и белки теплового шока) [5]. Исходя из вышеизложенного, можно предположить, что при ожоговой
травме TLR уже способны генерировать развитие воспаления за счёт наличия массивного повреждения тканей, независимо от присутствия инфекционного агента.
Нарушение механизмов регуляции врождённого иммунитета часто играет решающую роль в развитии ряда заболеваний, главным образом таких, где воспаление является ключевым фактором патогенеза. В частности, нарушения активации клеток с участием TLR имеют значение при инфекциях и сепсисе. Одной из основных причин, влияющих на какие-либо изменения в иммунном ответе TLR при сепсисе, считается генетический полиморфизм генов данных рецепторов [7].
На сегодняшний день существует немалое количество данных о выявлении функционального полиморфизма генов ТЬЯ, связанного с заменами единичных нуклеотидов (SNP), вызывающих количественные изменения функционирования соответствующих генов. Общей чертой функционального полиморфизма генов TLR является снижение способности к распознаванию соответствующих лигандов либо к проведению внутриклеточных сигналов, что приводит к менее выраженной активации клеток после встречи с патогенами [3; 7].
Цель. Оценить частоты встречаемости полиморфизмов генов TLR2*G753A, TLR4*A299G, *С399Т среди пациентов с ожоговой травмой, у которых впоследствии развился сепсис.
Материалы и методы. Исследуемую группу составили 50 пациентов с тяжёлыми термическими ожогами, которым на 20-30-е сутки после ожога был поставлен диагноз сепсис. Поскольку у всех ожоговых больных проводился мониторинг течения ожоговой болезни (развитие сепсиса, сепсиса с синдромом ПОН) и её исхода (благоприятный, летальный), то в зависимости от этого пациенты были поделены на группы:
группа I — ожоговые больные, выздоровевшие после сепсиса (34 пациента);
группа II — ожоговые больные с сепсисом, осложнённым синдромом ПОН (16 пациентов): 11а — выздоровевшие (8 пациентов), 11б — летальный исход (8 пациентов).
В качестве контрольной группы использовали популяционную выборку европеоидов, сформированную на основе регистра потенциальных доноров стволовой клетки Челябинской областной станции переливания крови,— 78 человек.
Определение SNP в генах TLR2 и TLR4 проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующей инкубацией продуктов амплификации с эндонуклеазами рестрикции (таблица). Результаты реакции оценивались методом электрофореза в 2 %-ном агарозном геле.
Статистическую обработку результатов исследований проводили на персональном компьютере с применением пакета прикладных программ Statistica 8.0 for Windows, в котором использовали методы модуля «непараметрические критерии»: критерий х2 Пирсона, в том числе с поправкой Йейтса (Yates corrected), точный двусторонний критерий Фишера (Fisher exact) и программы MS Excel пакета MS Office для расчёта критерия отношения шансов и относительных частот встречаемости.
Результаты и обсуждение. На первом этапе проводили сравнение частот встречаемости исследуемых SNP в группе ожоговых больных с последующим развитием сепсиса с группой контроля.
Группа ожоговых больных характеризовалась высокой частотой встречаемости аллеля с заменой A полиморфизма TLR2*G753A (10 % против 3 %, р = 0,015, OR = 0,26, 95 % ДИ: 0,08-0,81). Вероятно, наличие аллеля А в генотипе ожогового пациента может являться маркером предрасположенности развития сепсиса. Достоверные раз-
личия между исследуемыми выборками установлены для генотипов данного полимофизма.
В группе ожоговых больных повышена частота встречаемости гетерозигот TLR2*753 О/Л (16 % против 3,5 %, р = 0,013, рисунок). Критерий отношения шансов показывает статистически значимое влияние данного генотипа на предрасположенность к развитию сепсиса у ожоговых больных: OR = 5,26; 95 %; ДИ: 1,32-20,81.
Для гомозиготного генотипа TLR2*753G/G выявлена пониженная частота в группе ожоговых больных (82 % против 95,3 %, %2 = 6,52, р = 0,011, OR = 0,22; 95 %; ДИ: 0,06-0,76) по сравнению с контролем.
Частоты аллелей и генотипов гена TLR4 *Л299О, *С399Т не имели статистически достоверных различий в группе больных по сравнению со здоровым контролем.
На втором этапе проводили сравнение частот встречаемости исследуемых полиморфизмов между группами пациентов с различным течением и исходом ожогового сепсиса. Между пациентами с различной тяжестью течения ожогового сепсиса (группа I по сравнению с группой II), а также между пациентами с благоприятным и летальным исходом (сравнение групп На и Пб) не было обнаружено достоверной разницы в частотах встречаемости аллелей и генотипов исследуемых генов.
Выводы и заключение. В нашей работе исследуемые полиморфизмы не оказывают влияния на тяжесть течения и исход сепсиса у пострадавших с тяжёлыми ожогами.
Однако нами были обнаружены повышенные частоты аллеля А и генотипа О/Л TLR2*G753A среди ожоговых больных, которым на 20-30-е сутки после ожога был поставлен диагноз сепсис, по сравнению со здоровыми лицами. Полученные нами результаты согласуются с данными, пред-
Характеристика полиморфных сайтов исследуемых генов
Ген SNP Характеристика, рестриктазы, аллели, размеры после рестрикции
TLR4 Asp299Gly Thr399Ile №о I (37еС) Редкий О: 168; 20 п. н., частый Л: 188 п. н. Н^ I (37еС) Редкий Т 98; 26 п. н., частый С: 124 п. н.
TLR2 Arg753Gln Msp I (37еС) Редкий Л: 104; 25 п. н., частый О: 129 п. н.
П. н. — пары нуклеотидов.
Контроль ШШ3 Сепсис
G/G G/A A/A
Генотипы TLR2*G753A
Частоты генотипов гена TLR2*753 в группе ожоговых больных и здоровых доноров
ставленными в работах зарубежных исследователей. Так, E. Lorenz с соавт. в своей работе делает вывод о том, что TLR2*G753A полиморфизм может повышать риск развития тяжёлого сепсиса, вызванного грамположительными микроорганизмами [6].
Считается, что аллель с заменой негативно влияет на проведение сигнала в клетку при активации рецептора посредством PAMPs, то есть в организме при наличии мутантного аллеля может наблюдаться пониженное содержание медиаторов воспаления, что увеличивает риск развития инфекции. Это представляет особый интерес с учётом того, что в последнее десятилетие основной причиной развития сепсиса в отделениях интенсивной терапии стали грамположительные микроорганизмы, которые несут в себе основные лиганды для распознавания TLR2.
Таким образом, аллель А и генотип G/A TLR2*G753A можно считать маркерами предрасположенности к развитию такого осложнения, как сепсис, у пациентов с тяжёлыми ожогами.
Список литературы
1. Конева, Е. П. Гетерозиготность гена ИЛ-10 как предиктовый маркер осложнённого сепсиса у ожоговых больных / Е. П. Конева, А. Л. Бурмистрова, Ю. Ю. Филиппова [и др.] // Вестн. урал. мед. академ. науки. 2012. № 4 (41). С. 123-124.
2. Конева, Е. П. Распределение полиморфизмов генов цитокинов ИЛ-1 и ИЛ-1РА среди ожоговых
больных с сепсисом / Е. П. Конева, Ю. Ю. Филиппова, М. И. Угнивенко [и др.] // Вестн. урал. мед. академ. науки. 2010. № 2/1. С. 151-152.
3. Симбирцев, А. С. Функциональный полиморфизм генов регуляторных молекул воспаления / А. С. Симбирцев, А. Ю. Громова // Цитокины и воспаление. 2005. Т. 4, № 1. С. 3-10.
4. Цыган, В. Н. Генетический полиморфизм иммуногенной сигнальной системы / В. Н. Цыган, А. М. Иванов, Т. А. Камилова [и др.] // Журн. ин-фектологии. 2011. Т. 3, № 2. С. 21-27.
5. Cairns, B. A. Toll-like Receptor 2 and 4 ligation results complex altered cytokine profiles early and late after burn injury / B. A. Cairns, C. M. Barnes, S. Mlot // J. Trauma. 2008. Vol. 64, № 4. P. 1069-1078.
6. Lorenz, E. Relevance of mutations in the TLR4 receptor in patients with Gram-Negative septic shock / E. Lorenz, J. P. Mira, K. L. Frees [et al.] // Arch. Intern. Med. 2002. Vol. 162, № 9. P. 1028-32.
7. Netea, M. G. Genetic variation in Toll-like receptors and disease susceptibility / M. G. Netea, C. Wijmenga, L. A. J. O’Neill // Nature immunology. 2012. Vol. 13, № 6. P. 535-542.
8. Schnare, M. Toll-Like Receptors: sentinels of host defence against bacterial infection / M. Schnare, M. Rollinghoff, S. Qureshi // Int. Arch. Allergy Immunol. 2006. Vol. 139. P. 75-85.
9. Tsujimoto, H. Role of Toll-like receptors in the development of sepsis / H. Tsujimoto, S. Ono, Ph. A. Efron [et al.] // Shock. 2008. Vol. 29, № 3. P. 315-321.
