CC BY
23
© Али Мохамад Таха
УДК 616.233-002+616-08:612.751.3:616-008:615.37:616.43
ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА TOLL-LIKE РЕЦЕПТОРА 4 ТИПА ASP299GLY У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМИ ОБСТРУКТИВНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ ЛЕГКИХ С РАЗЛИЧНЫМ АНТИТЕЛЬНЫМ ОТВЕТОМ НА ЭНДОТОКСИН
Али Мохамад Таха
ГУ "Крымский государственный медицинский университет имени С.И.Георгиевского", г. Симферополь
Р1вн1 антитш до ендотоксину (анти-ET-IgG) та полгморфгзм Asp299Gly Toll-like рецептора 4 типу (TLR4) у 31 хворого на хротчш обструктивш захворювання легень (ХОЗЛ) були досл1джен1 за допомогою iмунофермент-ного аналiзу та полiмеразноi ланцюгово'1' реакци. Згiдно з результатами до^дження рiвня анти-ET-IgG уа хворi ХОЗЛ були розподiленi на 2 клтчш групи. У першу групу увшшли 18 хворих, ят мали низькш рiвень анти-ET-IgG (2 S< Me±n) - антитiльнi анти-ЕТ гтореспондери. У другу групу — 13 хворих, що мали нормальний, або пiдвищений рiвень антитш до ЕТ анти-ЕТ-Ig G ( анmиmiльнi нормо та гтерреспондери). Була також об-стежена група здорових донорiв - 23 особи. Найбыьш розповсюджений гомозiгоmний генотип AA був виявле-ний у 27 хворих на ХОЗЛ (87,1%), 16 хворих 1 групи (88,9%) та 11 хворих 2 групи (84,6%). За частотою цього генотипу досmовiрноi рiзницi мiж клнчними групами хворих та групою здорових донорiв не було виявлено. 4 гетерозиготних AG генотипа Asp299Gly було виявлено у хворих на ХОЗЛ, по 2 в кожнт клШчнш гр^ без вiро-гiдноiрiзницi мiж групами та нормою. Жодного випадку гомозiгоmного генотипа Gly299 полiморфiзму TLR4 не було зареестровано. Наявтсть Asp299Gly полiморфiзму TLR4 не мае суттевого впливу на антитшьну вiдпо-вiдь до ЕТ.
^K^Bi слова: г^морфнзм гена, Toll-like рецептори, хроычш обструктивт захворювання легень
В настоящее время большое внимание исследователей во всем мире уделяется механизмам активации врожденного иммунитета при хронических об-структивных заболеваниях легких (ХОЗЛ), что может привести в ближайшем будущем к появлению новых стратегий лечения этого заболевания. Среди механизмов активации врожденного иммунитета, особое место занимают механизмы стимуляции паттерн распознающих трансмембранных рецепторов, к которым и относят семейство Toll-like рецепторов (TLR). TLR принимают активное участие в защите от вирусных и бактериальных инфекций, которые, как известно, принимают активное участие в формировании, обострении и прогрессировании ХОЗЛ [1] .
Учитывая важную роль грамнегативных бактерий в индукции обострения ХОЗЛ наше внимание привлекли TLR 4 типа с позиций изучения одиночного нукле-отидного полиморфизма Asp299Gly, который, во многом определяет уменьшение трансдукционного ответа на эндотоксин (ЭТ) или липополисахарид (ЛПС) грамнегативных бактерий [2].
Целью данной работы было изучение частоты одиночного нуклеотидного полиморфизма Asp299Gly TLR 4 типа у больных ХОЗЛ в зависимости от уровня антительного ответа на ЭТ грамотрицательной микрофлоры.
Материал и методы исследований
Обследован 31 больной ХОЗЛ, проходивший стационарное лечение на базе терапевтического отделения ГУ «Участковая клиническая больница ст. Симферополь» государственного предприятия «Приднепровская железная дорога». Клинический диагноз ХОЗЛ устанавливался на основании проведенного клинического и функционального обследования c верификацией стадий заболевания в соответствии с Приказом МОЗ Украины от 19.03.2007 №128 [3].
Среди больных ХОЗЛ было 17 мужчин (51,6%) и 14 женщин (48,4%), средний возраст больных -61,0±2,0 года. Спирометрия проводилась с помощью прибора «Спироком» (Комплекс спирометрический), «Микролаб» (Комплекс компьютерный диагностический) с использованием критериев ATS/ERS. (2003, 2005).
Уровни сывороточных антиэндотоксиновых антител класса G (анти-ЭТ-IgG) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА) с использованием протоколов, разработанных в отделе клинической иммунологии ЦНИЛ ГУ «Крымский государственный медицинский университет им. С.И. Георгиевского» [4,5]. Концентрацию анти-ЭТ-IgG выражали в условных единицах оптической плотности конечного продукта ферментативной реакции после проведения тИФА (усл. ед. опт. плотн.), которую определяли с помощью иммуноферментного анализатора StatFax 2100 (Awareness Tech. Inc., USA) при длине волны 492 нм для разведения тестируемой сыворотки крови 1:50.
Молекулярно-генетические исследования проведены в НИИ Генетических и иммунологических основ развития патологии и фармакогенетики ВГУЗ Украины "Украинская медицинская стоматологическая академия".
Геномную ДНК выделяли из сыворотки крови методом фенол-хлороформной екстракции [6]. Определение полиморфизма Asp299Gly Toll-like рецепторов проводили методом полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров [7].
В зависимости от интенсивности антительного ответа на ЭТ, который оценивали по отношению индивидуальных уровней анти-ЭТ-IgG в крови к нормативной величине этого показателя, больные были распределены на 2 клинические группы. В первую группу было включено 18 больных ХОЗЛ с низким уров-
нем анти-ЭТ-^ (2 5 < Me±m) -антительные гипорес-пондеры на ЭТ, во вторую - 13 больных ХОЗЛ с нормальным и повышенным уровнем анти-ЭТ-^ (антительные нормо и гиперреспондеры на ЭТ).
Для оценки нормативных показателей использовали венозную кровь 23 условно здоровых доноров, которые соответствовали больным ХОЗЛ по возрастному диапазону и половому распределению (группа контроля).
Статистическая обработка полученных результатов проведена с использованием лицензионной программы «Мес^аЬ (серийный №М80011 ДНПП ТОВ
Уровень антиэндотоксиновых антител класса 1д G и ра
«Альфа», г. Донецьк) для параметрических и непра-раметрических критериев. Достоверность различий по частоте встречаемости указанных генотипов и алелей оценивали с помощью нерапаметрического критерия х2 Пирсона и х2 Пирсона с поправкой Йетса [8].
Результаты и их обсуждение Данные о генетическом полиморфизме Т1_Р4 Asp299Gly и концентрации в крови антиэндотоксиновых антител класса 1д G представлены в таблице.
Таблица
)еление частоты генотипов и аллелей полиморфизма гена TLR4 Asp299Gly в группе контроля и больных ХОЗЛ
Показник Контрольная группа ХОЗЛ 1 группа 2 группа
n=23 n=31 n=18 n=13
Уровень антител Ig G к ЭТ усл.ед.опт.пл.
анти-ЭТ-Ig G 0,158±0,015 0,108±0,02 0,093±0,004 0,243±0,019
Р =0,096 <0,01 <0,05
Частота генотипа n (%)
GG 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0)
AG 1 (4,35%) 4 (12,9%) 2 (11,1%) 2 (15,4%)
AA 22 (95,6%) 27(87,1%) 16 (88,9%) 11 (84,6%)
х2 П р = 0,28 р = 0,41 р = 0,25
х2 П+Й р = 0,55 р = 0,83 р = 0,60
Частота алелей n (%)
А 45 (97,8%) 58 (93,5%) 34 (94,4%) 24 (92,3%)
G 1 (2,2%) 4 (6,5%) 2 (5,6%) 2 (7,7%)
х2 П р = 0,30 р = 0,42 р = 0,26
х2 П+Й р = 0,54 р = 0,83 р = 0,61
Примечание: р - достоверность различий с группой контроля X2 П - х2 Пирсона
X2 П+Й - х2 Пирсона с поправкой Йетса
(*) об обозначена достоверность различий между 1 и 2 группами р<0,01
Как видно из данных представленных в таблице в целом в группе больных ХОЗЛ носители гомозиготного генотипа Asp299Asp TLR4 составили 87,1%, в 1 группе больных ХОЗЛ - 88,9% и 2 группе - 84,6 %, что статистически достоверно не отличается от соответствующего показателя группы здоровых лиц (р=0,55, р=0,83, р=0,60 соответственно). Количество больных с гетерозиготным вариантом Asp299Gly в целом в группе больных ХОЗЛ составило 4 человека (12,9%), в 1 группе больных ХОЗЛ 2 человека (11,9%) и во 2 группе больных ХОЗЛ также 2 пациента (15,4%), что не отличается от показателя группы здоровых лиц (р=0,28, р=0,41 и р=0,25 соответственно). Между частотой встречаемости полиморфных аллелей А и G в группах больных ХОЗЛ и контрольной группой достоверных различий также не выявлено.
Наши данные в целом совпадают с результатами полученными ранее о том, что полиморфизм Asp299Gly TLR4 не превышает 10-20% среди лиц европеоидной расы, Michel O et al. (2003) изучая генетический полиморфизм TLR4 на ингаляцию ЭТ у здоровых лиц установил, наличие гипореспондерного ответа на Эт, более низкий уровень ЛСБ и С- реактивного белка у носителей гетерозинотных вариантов единичного полиморфизма TLR4 в положении +896 A/G и +1196T/C [1].
Как известно, полиморфизм Asp299Gly TLR4 ассоциируется с уменьшением ЛПС трансдукционного сигнала [2,9]. Имеются единичные сообщения о том, что при ХОЗЛ частота встречаемости данного поли-
морфизма Asp299Gly (rs498670) в TLR4 значительно ниже, чем в группе контроля [10].
В научной литературе существуют противоречивые данные о влиянии данного полиморфизма но показатели функции внешнего дыхания у больных ХОЗЛ. Так в исследовании проведенном Pahwa P. (2009) показано, что полиморфизм TLR4 Asp299Gly является потенциальным фактором риска уменьшения ОФВ 1 (объема форсированного выдоха за первую секунду) и соотношения ОФВ1/ФЖЕЛ (форсированной жизненной емкости легких) и пиковой скорости выдоха (ПСВ25-75 ) у лиц с ожирением (индекс массы тела> 30 кг/м2 [11].
LeVan T.D. et al. (2005), Budulac S. (2012) установили, что полиморфизм Asp299Gly TLR4 не имеет никакого влияния на показатели внешнего дыхания, на уменьшение ОФВ1 и на тяжесть течения ХОЗЛ [12,13].
В научной литературе обсуждаются возможная роль гипореспондерного ответа TLR4 в патогенезе дисфункции клиренса трахеобронхиального дерева от грамнегативных бактерий (прежде всего H.influenza M.cataralis), которые при стабильном течении ХОЗЛ выявляются у 30 % больных ХОЗЛ. White S. et al. ( 2004) изучали генетический полиморфизм TLR4 у 289 курильщиков с ХОЗЛ. 260 были гомозиготами по Asp299, 29 больных ХОЗЛ были гетерозиготами по Asp299Gly. Не было выявлено ни одного случая у больных ХОЗЛ гомозитот Gly299. При этом не было выявлено влияния генетического полиморфизма TLR4
Asp299Gly на показатели легочной функции и бронхиальный ответ на ингалируемый ЭТ и повышенную чувствилельность к грибковой, бактериальной и вирусной инфекции [14]. Douville R. N. et al. (2010), Lafferty E. et al. (2010) доказали, что продукция провоспали-тельных цитокинов индуцируемая ЛПС или синцитиа-льными вирусами у здоровых детей не зависит от TLR4 Asp299Gly и Thr399Ile полиморфизма [15,16].
Как известно, важнейшую роль в патогенезе ХОЗЛ играет активация нейтрофилов и альвеолярных макрофагов под действием различных факторов и прежде всего табачного дыма. По данным шведских исследователей в табачном дыме, кроме других известных факторов, в критических высоких концентрациях содержится ЛПС (ЭТ) грамнегативной флоры [17]. В настоящее время доказано, что ЭТ является мощнейшим провоспалительным фактором, который потенциально может определять необычный воспалительный ответ при формировании ХОЗЛ [18].
Известно, что передача сигнала от комплекса ЭТ+ЛСБ (липополисахаридсвязывающий белок) происходит с непосредственным участием TLR рецепторов 4 типа (TLR4), ибо CD 14 рецептор не имеет вну-трицитоплазматического домена. ЭТ сигнал, переданный в клетку через TLR4 приводит в конечном итоге к активации внутриклеточного транскрипционного фактора NF-kB, который перемещается в ядро клетки и связывается с kB-последовательностями ДНК, что стимулирует синтез ОНФ, IL-1p, IL-6 [19]. Клеточный ответ на ЭТ во многом определяется структурой внеплазматического домена TLR4, которая по данным литературы определяется генетическим полиморфизмом TLR4.
Анализируя полученные нами данные можно отметить, что большинство больных ХОЗЛ по генетическому полиморфизму TLR4 Asp299Gly на ЭТ имеют предрасположенность к гиперреспондерному клеточному ответу на эндотоксин. Аналогичная закономерность характерна для групп больных с антительным гипореспондерным ответом на ЭТ (1 группа) и антительным нормо и гиперреспондерным ответом на ЭТ ( 2 группа).
Вместе с тем, ранее нами получены данные о том, что антительные гиперреспондеры и норморес-пондеры имеют более низкие показатели системного воспаления такие, как уровень СРБ, ЛСБ и более легкое течение ХОЗЛ в сравнении с антительными гипо-респондерами [20]. Объяснить этого парадокс, можно нейтрализацией ЭТ антителами на уровне мукозаль-ного барьера (более высокий уровень секреторного антиэндотоксинового Ig A) и на уровне системного кровотока (более высокий уровень антиэндотоксинового IgG во 2 группе) [21]. Поэтому нейтрализация ЭТ антителами приводит к значительно меньшему образованию комплекса ЭТ+ЛСБ и меньшей активации рецепторного комплекса CD14/TLR4 во 2 клинической группе. С другой стороны, у антительных гипореспон-деров в 1 клинической группе чрезмерное воздействие ЭТ на клеточные структуры может происходить через другие виды рецепторов к ЭТ (р2 интегриновые рецепторовы (CD11/ CD18), скавенджер рецепторы, L-селектины и другие), приводя к выраженной активации NF-kB [22].
Выводы
1. Гомозиготный генотип AA полиморфизма Asp299Gly TLR4 является наиболее часто встречающимся при ХОЗЛ, который был выявлен у 27 больных ХОЗЛ (87,1%), 16 больных в 1 клинической группе (88,9%) и 11 больных во 2 группе (84,6%). Гетерози-горный вариант генотипа AG полиморфизма Asp299Gly TLR4 был выявлен у 4 больных ХОЗЛ (12,9%) из них у 2 в 1 клинической группе (11,1%) и 2 во 2 группе (15,4%). Гомозиготного варианта GG генотипа не выявлено ни у одного больного ХОЗЛ.
2. Достоверных различий частота генетического полиморфизма Asp299Gly TLR4 у больных ХОЗЛ и в популяции здоровых лиц постоянно проживающих в АР Крым не обнаружено.
3. Не было выявлено особенностей генетического полиморфизма Asp299Gly TLR 4 между группами больных ХОЗЛ с различным уровнем антительного ответа на ЭТ.
Лтратура
1. Michel O. Systemic responsiveness to lipopolysaccharide and polymorphisms in the toll-like receptor 4 gene in human beings./ Michel O., LeVan T., Stern D., Dentener M., Thorn J.et al.// J Allergy Clin Immunol.- 2003 - Vol. 112. - N11. - P. 923-929.
2. Schmitt C. Polymorphisms of TLR4: rapid genotyping and reduced response to lipopolysaccharide of TLR4 mutant alleles/ Schmitt C., Humeny A., Becker C.M., Brune K., Pahl A.// Clin Chem. - 2002. - Vol 48. - N. 11. - P. 16611667.
3. Наказ МОЗ Укра'ши вщ 19.03.2007 №128 «Про затвер-дження кглжчних протоколiв надання медичноТ допомо-ги за спе^альжстю «Пульмонолопя».- К., 2007.- 146.
4. Гордieнко А.!., Бтоглазов В.О., Бакова А.А. Високочут-ливий iмуноферментний метод ктькюного визначення змюту С-реактивного бтка в кровг 1нформацшний лист про нововведения в систе1^ охорони здоров'я №139.-К., УКРМЕДПАТЕН^НФОРМ, 2010.- 4с.
5. Гордieнко А.1., Бтоглазов В.О. Патент 70193 А. Споаб визначення антитш до лiпополiсахаридiв грамнегатив-них бактерш. - Заявл. 29.12. 2003; Опубл.15.09. 2004. -Бюл. №9
6. Епринцев А.Т. Идентификация и исследование экспрессии генов (учебно-методическое пособие для вузов) // Епринцев А.Т., Попов В.Н., Федорин Д.Н. - Из-дательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета. - 2008. - 64 с.
7. Методи шычних та експериментальних дослщжень в медицин Беркало Л.В., Бобович О.В., Боброва Н.О. та ш. пщ ред. проф. Кайдашева 1.П. - Полтава : Полiмет,
2003. - 320 с.
8. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA.- М.: МедиаСфера, 2002.- 312 с.
9. Arbour N.C TLR4 mutation is associated with endotoxin hyporesponsiveness in humans/ Arbour N.C., Lorenz E., Schutte B.C., Zabner J., Kline J.N., et al. // Nature Genetics. 2000. - Vol 25. - N. 1. -Р.187-191.
10. Klein W. Association of the ASP299GLY TLR4 polymorphism with COPD/Klein W, Duerig N, Bauer T, Gillissen A, Schultze-Werninghaus G, Epplen T .J.// Respir Med. - 2006. - Vol 100. - N. 5. - P. 892-896.
11. Pahwa P.Association of the TLR4 Asp299Gly polymorphism with lung function in relation to body mass index / Pahwa P., Karunanayake C. P, Rennie D. C., Chen Y.,. Schwartz D.A// BMC Pulm Med. 2009 - Vol. 46. - N.9.- Р. 1186-1196.
12. LeVan T.D. Polymorphisms in the CD14 Gene Associated with Pulmonary Function in Farmers/LeVan T.D., Von Essen S, Romberger D.J., Lambert G..P, Martinez F.D.// Am J Resp Crit Care Med. - 2005. Vol. 171 N.4. - Р. 773779.
13. Budulac S. Toll-Like Receptor (TLR2 and TLR4) Polymorphisms and Chronic Obstructive Pulmonary Disease/ Budulac S., Boezen H. M., Hiemstra P.S., Lapperre T.S.,
Vonk J.M. et.al.// PLoS One. 2012; 7(8): e43124. Pub- 19. lished online 2012 August 28. Режим доступу до журн.: http://www.plosone.org/article/info%3 Adoi%2F10.1371%2 Fjournal.pone. 00431 243/
14. Whyte I. M. K. Toll-like receptor (TLR) 4 polymorphisms and COPD/ Whyte I. M. K., Wilson A G, Dower S K, Hubbard R, Hall I// Thorax. - 2004.- Vol. 59 N.1. -Р.81-.85. 20.
15. Douville R. N. TLR4 Asp299Gly and Thr399Ile Polymorphisms: No Impact on Human Immune Responsiveness to LPS or Respiratory Syncytial Virus / Douville R. N., Lissit-syn Y., Hirschfeld A. F., Becker A. B., KozyrskyjA. L., // PLoS ONE. - 2010- V. 5 N. 8. - Р. e12087.
16. Lafferty E.The role of toll-like receptors in acute and 21. chronic lung inflammation Lafferty E.,Qureshi S.T., Schnare M. //Journal of Inflammation 2010ю - Vol. 57 N.7. Режим доступу до журн. : http://www.journal-inflammation. com/ content/7/1/57.
17. Larsson L., Szponar B., Pehrson C.//Tobacco smoking increases dramatically air concentrations of endotoxin,// 22. Indoor AiTO 2004. - Vol. 14ю - N. 6. - Р. 421-424.
18. Hackett T.L. Dynamics of pro-inflammatory and anti-inflammatory cytokine release during acute inflammation in
Summary
ASP299GLY POLYMORPHISM TOLL-LIKE RECEPTORS TYPE 4 IN COPD PATIENTS WITH DIFFERENT ANTIBODIES RESPONSES TO ENDOTOXIN Ali Mochamad Tasha
Key words: gene polymorphism, Toll-like receptors, chronic obstructive pulmonary diseases
The levels of endotoxin antibodies (anti-ET) and polymorphism Asp299Gly toll like type 4 (TLR4) in 31 COPD patients were investigated by ELISA and allele specific PCR tests correspondingly. According to the levels of anti-ET-IgG COPD patients were divided into two groups. The 1st group included 18 patients which had lower levels of anti- ET-IgG (2 8 < Me±m) - antibody ET hyporresponders. In the 2nd group 13 patients had normal or increased anti- ET IgG levels (antibody ET normohyperresponders). 23 healthy donors were also examined. Homozygous genotypes AA were found in 27 COPD patients (87,1%), 16 patients from the 1st group (88,9%) and 11 patients from the 2nd group (84,6%). There were no differences between COPD groups and healthy persons. 4 heterozygotes from COPD patients and 2 heterozygotes in each group were observed without no significant difference between COPD and healthy group. No one was Gly 299 homozygous for TLR4 polymorphism. The presence of Asp299 Gly polymorphism of TLR4 did not have any significant impact of antibodies responsiveness to ET.
State University "Crimea State Medical University named after S. I. Georgievsky", Simferopol
Mamepiaл надшшов до редакцн 12.11.2012 р.
chronic obstructive pulmonary disease: an ex vivo study / Hackett T.L., Holloway R., Holgate S.T., Warner I.A.// Respiratory Research. - 2008 -Vol. 47, N. 9 - P.465-453. Кайдашев И. П. NF-kB-сигнализация как основа развития системного воспаления, инсулинорезистентности, липотоксичности, сахарного диабета 2-го типа и атеросклероза. / И. П. Кайдашев // Международный эндокринологический журнал. - 2011. - № 3 (35). - С. 3544.
Бтоглазов В.А., Али Мохамад Таха, Гордиенко А.И. Антиэндотоксиновый иммунитет и С-реактивный белок у больных хроническими обструктивными заболеваниями легких с различным иммунным ответом на эндотоксин грамнегативной флоры// 1мунолопя та алерголо-пя. Наука i практика. 2011. №4. - 53-57 с. Бтоглазов В.А., Али Мохамад Таха Мукозальный ан-тиэндотоксиновый иммунитет и липополисахаридсвя-зывающий белок у больных хроническими обструктивными заболеваниями легких Проблеми еколопчноТ та медичноТ генетики i клУчно'Т iмунологiТ. КиТв-Луганськ, выпуск 1 (109). - 2012. С. 78-87.
Antal-Szalmas P Evaluation of CD 14 in host defence// European Journal of Clinical Investigation- 2000. - Vol.30. - N.2 - P 167-179.
